مستعمرة تشكيل خلية (CFC) مقايسة هو فحص في المختبر الذي الأسلاف لدم شكل مستعمرات في وسط شبه صلبة. وتستخدم مجموعة من التشكل مستعمرة ، مورفولوجيا الخلايا ، والتدفق الخلوي لتقييم قدرة الأسلاف لتتكاثر والتفريق على طول الأنساب مختلفة للدم.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تشكيل خلية مستعمرة (CFC) للخلايا المكونة للدم الفحص الإنسان
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وعادة ما يتم الحصول على الإنسان الجذعية المكونة للدم / السلف الخلايا من نخاع العظام ، دم الحبل السري ، أو الدم المحيطي وتستخدم لدراسة وleukemogenesis تكون الدم. لديهم القدرة على التمايز إلى الأنساب اللمفاوية والدم النخاعي. يستخدم مستعمرة تشكيل خلية (CFC) مقايسة لدراسة انتشار والتفريق بين نمط الأسلاف للدم من خلال قدرتها على شكل مستعمرات في المتوسط نصف صلبة. عدد والتشكل في المستعمرات التي تشكلها على عدد ثابت من الخلايا الإدخال توفير المعلومات الأولية حول قدرة الأسلاف للتمييز وتتكاثر. يمكن حصاده من مستعمرات الخلايا الفردية أو من لوحة كاملة لمواصلة تقييم أعدادهم والدول تمايز باستخدام التدفق الخلوي والتقييم من مورفولوجية بالغيمزا الملطخة الشرائح. هذا الاختبار هو مفيد لتقييم التمايز النخاعي اللمفاوية ولكن لا. يستخدم مصطلح النخاعي في هذا السياق بمفهومها الواسع ليشمل الأنساب المحببات ، الوحيدات ، محمر ، والنواءات.
وقد استخدمنا هذا الاختبار لتقييم آثار المسرطنة على تمايز الخلايا الأولية + CD34 الإنسان المستمدة من الدم المحيطي. لهذا الغرض هي الخلايا transduced مع بناء التحكم إما فيروسات أو بناء التعبير عن الجين الورمي من الفائدة ، في هذه الحالة ، NUP98 HOXA9. نحن نوظف متجه استخداما فيروسات ، MSCV - IRES - GFP ، أن يعبر عن مرنا bicistronic الجينات التي تنتج من الاهتمام وعلامة GFP. هي خلايا ما قبل تفعيلها من خلال تزايد في وجود السيتوكينات لمدة يومين قبل تنبيغ فيروسات. بعد يومين آخرين ، يتم عزل الخلايا GFP + الفرز مضان تنشيط الخلايا (FACS) ومختلطة مع methylcellulose المتوسطة التي تحتوي على نصف صلبة تستكمل مع السيتوكينات وحضنت المستعمرات حتى تظهر على السطح ، وعادة 14 يوما. يتم توثيق عدد والتشكل من المستعمرات. ثم تتم إزالة الخلايا من لوحات ، وغسلها ، عدها ، وتعرض للفحص التدفق الخلوي والمورفولوجية. التدفق الخلوي مع الاجسام المضادة المحددة لعلامات سطح الخلية التي أعرب عنها أثناء تكون الدم يوفر معلومات حول نسب ومرحلة النضج. الدراسات المورفولوجية الخلايا الفردية تحت المجهر بعد رايت تلوين غيمزا تقديم مزيد من المعلومات فيما يتعلق الانساب والنضج. transduced مقارنة مع خلايا مكافحة ناقلات الفارغة لتلك transduced مع الجين الورمي يكشف عن الآثار المترتبة على الجين الورمي على تمايز للدم.
البروتوكول
1. إعداد الكواشف
- إعداد الحلول العقيمة الأسهم 1000x من وزراء الخارجية ذات الصلة كيناز التيروزين 3 (FLT - 3) يجند ، محببة / بلعم مستعمرة عامل تحفيز (GM - CSF) ، الخلية الجذعية عامل (SCF) ، ثرومبوبويتين (TPO) ، انترلوكين (IL) -3 وIL - 6 وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تحضير محلول معقم الأسهم Retronectin (1mg/ml) أيضا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تقسيم هذه الحلول في aliquots الأسهم الصغيرة والاحتفاظ في -20 درجة مئوية لتفادي تكرار تجميد ذوبان الجليد.
- إعداد FBS 2 ٪ في IMDM.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد استخدم على نطاق واسع CFC مقايسة لتحديد أنماط انتشار والتفريق بين الأسلاف والمكونة للدم لدراسة آثار المسرطنة (4 ، 5). لها ميزة على الثقافات السائل من كونه مقايسة نسيلي ، ان هذه المستعمرات تمثل سلالة من سلف واحد ويمكن إزالتها بشكل فردي لمزيد من التحليل. الحد من مقايسة CFC هو أنه ليست كافية للكشف عن الأسلاف أو خلايا غير ناضجة أكثر الجذعية المكونة للدم ، ويتم الكشف عن استخدام مثل هذه الخلايا على المدى الطويل الثقافة الشروع في الخلية (LTC - IC) مقايسة (6 ، 7). وصف التجارب هنا تدل ع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر J. ألفين Siteman مركز السرطان في جامعة واشنطن في كلية الطب ومستشفى بارنز اليهودي في سانت لويس ، MO ، لاستخدام سرعة عالية كور فارز الخلية ، التي وفرت المعدات التدفق الخلوي وخدمات الفرز. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 HL082549 وHL084179 K02 (NRY). ويدعم مركز للسرطان Siteman جزئيا عن طريق دعم مركز سرطان NCI P30 CA91842 المنحة.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| IMDM | Life Technologies | 12440 | |
| FBS | Stem Cell Technologies | 06150 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| البنسلين/ستريبتوميسين (PS) | Life Technologies | 15140 | |
| ربيطة FLT-3 | PeproTech Inc | 300-19 | |
| GM-CSF | PeproTech Inc | 300-03 | |
| SCF | PeproTech Inc | 300-07 | |
| TPO | PeproTech Inc | 300-18 | |
| IL3 | PeproTech Inc | 200-03 | |
| IL6 | PeproTech Inc | 200-06 | |
| ألبومين المصل البقري | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A | |
| HBSS | Life Technologies | 14175 | |
| PBS | Life Technologies | 14200 | |
| محلول صبغة تريبان الزرقاء (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Methocult GF+ H4435 | Stem Cell Technologies | 04445 | |
| وسط مثرى بالميثيل سليلوز البشري | R&D Systems | HSC005 | |
| صبغة Wright/ Giemsa | Harleco | 64571 | |
| محلول منظم الفوسفات، pH 6.4 - صيغة جيوردانو | Ricca Chemical Company | 1450 | |
| الميثانول | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 8310 | |
| مصل فأر طبيعي | Rockland Immunochemicals | D208 | |
| مضاد CD11b البشري المقترن بـ phyc–rythrin | BD Biosciences | 555388 | |
| مضاد CD33 البشري المقترن بـ allophycocyanin | BD Biosciences | 551378 | |
| مضاد CD45 البشري المقترن بـ phyc–rythrin-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
| مضاد CD71 البشري المقترن بـ phyc–rythrin | BD Biosciences | 555537 | |
| مضاد CD235a البشري المقترن بـ allophycocyanin | BD Biosciences | 551336 | |
| مضاد CD45 البشري المقترن بـ phyc–rythrin-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
| أطباق زراعة أنسجة غير معالجة ذات 24 بئراً | BD Biosciences | 35-1147 | |
| طبق غير معالج بقطر 30 مم | Stem Cell Technologies | 27150 | |
| طبق زراعة أنسجة بقطر 100 مم | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| أطباق تسجيل ذات مربعات | Stem Cell Technologies | 27500 | |
| أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل | BD Biosciences | 35-2097 | |
| أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل | BD Biosciences | 35-2070 | |
| حقن سعة 3 مل | Stem Cell Technologies | 28240 | |
| إبرة ذات طرف غير مدبب مقاس 16، بطول 1½ بوصة | Stem Cell Technologies | 28110 | |
| مرشح خلايا CellTrics بمسامية 50 μm | Partec | 04-004-2327 | |
| مقياس كريات الدم (Hemocytometer) | Fisher Scientific | 0267110 | |
| غرف عينات TPX | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A78710018 | |
| شرائح مجهر Fisherbrand Superfrost/Plus، منظفة مسبقاً | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| بطاقات ترشيح Shandon | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 5991022 | |
| حامل شرائح Shandon cytospin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 59920063 | |
| مجموعة صبغ Shandon كاملة 100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 100 | |
| مناديل Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| ورق ترشيح بمسامية 1 μm | VWR international | 28307-134 | |
| مجهر مقلوب | Nikon Instruments | Diaphot | |
| كاميرا مجهر | Nikon Instruments | DS-F11 | |
| مجهر | Olympus Corporation | BX51 | |
| كاميرا مجهر | Olympus Corporation | DP71 | |
| ماسح ضوئي | Microtek | Scanmaker 4 | |
| خلاط دوامي (Vortex mixer) | Fisher Scientific | 12-812 | |
| حضانة زراعة أنسجة | Sanyo | MCO-18AIC | |
| جهاز طرد مركزي للخلايا (Cytospin) | Shandon, Inc. | Cytospin 2 | |
| جهاز طرد مركزي مكتبي | Eppendorf | 5810-R | |
| نظام تنقية المياه | Barnstead | Nanopure-Diamond |
المراجع
- Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
- Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
