تحديد عدد الخلايا خلال زراعة الخلايا باستخدام خلية مكافحة الصولجان

ملخص

لجنة مكافحة خلية الصولجان هو جهاز محمول باليد الآلية التي يمكن استخدامها لحساب عدد الخلايا ، ورصد حجم الخلية وقطر ، كما يمكن استخدامها للتحقق من صحة ونوعية السكان الخلوية من ثقافة إلى أخرى.

الملخص

عد الخلايا غالبا ما يكون خطوة ضرورية لكنها مملة لزراعة الخلايا في المختبر. تركيزات الخلية متسقة ضمان استنساخ التجارب والدقة. تعداد خلايا مهمة لرصد صحة الخلايا ومعدل الانتشار ، وتقييم تخليد أو التحول ، وبذر خلايا لاحقة ترنسفكأيشن ، والتجارب أو العدوى ، وتستعد لخلية مقرها المقايسات. من المهم أن يكون عدد الخلايا دقيقة ومتسقة ، وبسرعة ، ولا سيما لقياس الكمي لاستجابات الخلايا.

على الرغم من هذه الحاجة إلى السرعة والدقة في الفرز الخلية ، شملهم الاستطلاع 71 ٪ من 400 ¹ الباحثين الذين يعتمدون الخلايا باستخدام عدادة الكريات. بينما hemocytometry غير مكلف ، فمن شاقة وتخضع للانحياز وسوء استعماله ، والذي ينتج في تهم غير دقيقة. مصنوعة من الزجاج Hemocytometers البصرية الخاصة التي يتم تحميلها على تعليق خلية في مجلدات محددة وعدها تحت المجهر. مصادر الأخطاء في hemocytometry ما يلي : التوزيع غير المتوازن للخلية في العينة ، وكثيرة جدا أو قليل جدا من الخلايا في العينة ، وقرارات موضوعية حول ما إذا كان خلية معينة تقع داخل منطقة العد محددة ، تلوث عدادة الكريات ، دليل مستخدم إلى تباين وتباين عدادة الكريات ملء معدل ^2.

للتخفيف من حدة الملل المرتبطة العد اليدوي ، 29 ٪ من الباحثين عدد الخلايا باستخدام خلية العد الآلي الأجهزة ؛ وتشمل هذه الرؤية القائمة على عدادات ، والأنظمة التي كشف الخلايا باستخدام مبدأ كولتر ، أو التدفق الخلوي ^1. بالنسبة لمعظم الباحثين والحاجز الرئيسي لاستخدام النظام الآلي هو الثمن المرتبطة بهذه الفوق كبيرة الصكوك ^(1).

العداد الخلية الصولجان هو جهاز محمول باليد الآلية التي توفر الأتمتة ودقة العد كولتر بتكلفة منخفضة نسبيا. نظام يعمل على مبدأ الكشف عن الجسيمات كولتر مقاومة القائم على ³ في شكل المنمنمة باستخدام مزيج من الأجهزة التناظرية والرقمية للاستشعار عن بعد ، معالجة الإشارات وتخزين البيانات ، وعرض رسومية. تم تصميم الطرف القابل للتصرف مع وجود منطقة microfabricated خلايا الاستشعار عن بعد ، التي تمكن من التمييز من جانب حجم الخلية وحجم الخلية في ميكرون الفرعية وقرار اللجنة الفرعية بيكو لتر. معززة مع قنوات السائل معالجة الدقة والالكترونيات ، والعداد الخلية الصولجان تقارير الإحصاءات السكانية خلية عرض بيانيا كما رسم بياني.

البروتوكول

1. أهمية حجيرة العد

1. عد الخلايا هي خطوة ضرورية لكنها مملة لزراعة الخلايا في المختبر.
2. تركيزات الخلية متسقة ضمان استنساخ التجارب والدقة.
3. تعداد خلايا مهمة لرصد صحة الخلايا ومعدل الانتشار ، وتقييم تخليد أو التحول ، وبذر خلايا لاحقة ترنسفكأيشن ، والتجارب أو العدوى ، وتستعد لخلية مقرها المقايسات.
4. على الرغم من الحاجة إلى السرعة والدقة في الفرز الخلية ، و 71 ٪ من 400 الباحثون بمسح عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. بينما hemocytometry غير مكلف ، فمن شاقة وتخضع للانحياز وسوء استعماله ، والذي ينتج في تهم غير دقيقة.
5. مصادر الخطأ في hemocytometry ما يلي : التوزيع غير المتوازن للخلية في العينة ، وكثيرة جدا أو قليل جدا من الخلايا في العينة ، وقرارات موضوعية حول ما إذا كان خلية معينة تقع داخل منطقة العد محددة ، تلوث عدادة الكريات ، دليل مستخدم إلى تباين وتباين معدل عدادة الكريات التعبئة.
6. للتخفيف من حدة الملل المرتبطة العد اليدوي ، 29 ٪ من الباحثين عدد الخلايا باستخدام الأجهزة الآلية خلية العد. ومع ذلك ، بالنسبة لمعظم الباحثين ، وسعر المرتبطة بهذه الصكوك المقعد العلوي يشكل عائقا كبيرا لاستخدامها.
7. العداد الخلية الصولجان هو جهاز محمول باليد الآلية التي توفر الأتمتة ودقة العد كولتر بتكلفة منخفضة نسبيا.
8. نظام يعمل على مبدأ الكشف عن الجسيمات كولتر مقاومة القاعدة في شكل المنمنمة باستخدام مزيج من الأجهزة التناظرية والرقمية للاستشعار عن بعد ، معالجة الإشارات وتخزين البيانات ، وعرض رسومية.
9. تم تصميم جهاز استشعار للتصرف مع وجود منطقة microfabricated خلايا الاستشعار عن بعد ، التي تمكن من التمييز من جانب حجم الخلية وحجم الخلية في ميكرون الفرعية وقرار اللجنة الفرعية بيكو لتر.
10. معززة مع قنوات السائل معالجة الدقة والالكترونيات ، والعداد الخلية الصولجان بيانيا يعرض الإحصاءات السكانية باعتبارها الخلية الرسم البياني.

2. إعداد تعليق وحيدة الخلية عن العد

1. لاستخدام العداد الخلية الصولجان ، والبدء بتخفيف تعليق خلية واحدة من الخلايا ، والفوسفات مخزنة المالحة. وتركز الخلايا لكل مليلتر 10،000-500،000 هو الأمثل.
2. نقل 100 ميكرولتر من الخلايا المخففة لأنبوب 1.5 مل microfuge.

3. أداء عدد الخلايا باستخدام الصولجان

1. بدوره على الصولجان مواجهة الخلية عن طريق الضغط وعقد تبديل على الجزء الخلفي من الصك وانتظار التعليمات التي تظهر على الشاشة لتظهر.
2. عند المطالبة ، نعلق جهاز استشعار إلى نهاية الوحدة مع فريق الصولجان القطب الاستشعار التي تواجه نحو الجزء الأمامي من الصك.
3. مجسات الصولجان تتكون من غرفة المعاينة الدقة مصبوب ، مع منطقة الاستشعار الالكترونية المتكاملة وأقطاب الخلية الاستشعار عن بعد. أجهزة الاستشعار يجعل من الممكن التمييز في حجم الخلية الفرعي ميكرون القرار ، وحجم الخلية في شبه بيكو لتر القرار.
4. يتفق الهندسة الاستشعار ، ويضمن أن يتم احتساب حجم العينة متساوية ويتم إجراء قياسات دقيقة الحجم.
5. مرة واحدة يتم إرفاق الاستشعار ، تنفيذ كل خطوة من عملية الفرز وفقا للتعليمات التي تظهر على الشاشة كما يلي :
6. عندما يقرأ الشاشة "باستمرار المكبس لبدء" كساد الغطاس. سوف الشاشة ثم قراءة "غمر استشعار". غمر استشعار في الخلية حل التعليق والافراج عن المكبس لنضح تعليق خلية في الاستشعار.
7. الغطاس بمثابة الإشارة الكهربائية ، وسوف يوجه العينة زائد حجم القتلى في الاستشعار. سرعة أو دقة تغرق لا يهم كما هو الحال مع pipetting. وسوف تستغرق هذه العملية عدة ثوان. عندما تصبح جاهزة ، فإن أداة تنبيه ، و "نموذج تحميل" سيتم عرضها على الشاشة.
8. بمجرد أن يتم تحميل العينة إلى استشعار ويوجه من خلال الاستشعار عن المنطقة لتقييم حجم الخلية وحجم الخلية ، ثم من خلال microchannels. مرة واحدة يتم احتساب 50 ميكرولتر من العينة الاستشعار يروي سيلة لوقف العد.
9. بعد اكتمال العدد ، سيتم عرض وثيقة للقراءة "الكونت الكاملة. الرجاء إزالة أجهزة الاستشعار وتجاهل". اتبع موجه ، وإزالة والتخلص من أجهزة الاستشعار.
10. والصك ثم عرض رسم بياني لحجم الخلية أو القطر على الشاشة ، وكذلك تركيز خلية لكل مل.

4. تحليل البيانات

1. بعد اكتمال العد ويظهر الرسم البياني على الصك ، وتطبيق البوابات بالضغط على زر تبديل. حدد "النابضة السيارات" أو "استخدام الماضية" إما تلقائيا تعيين البوابة استنادا إلى ملف الرسم البياني ، أو لاستخدام البوابات من الإحصاء السابق.
2. بغض النظر عن التحديد ، يمكن للبوابات انتقل يدويا لضبط البيانات. دفع زر التبديل مرة أخرى لتحديد اليسار وبوابة لتمريرggle لنقل بوابة على النحو المرغوب فيه.
3. ثم اضغط على تبديل مرة أخرى لتفعيل بوابة الحق والتمرير إلى تبديل مكان البوابة الصحيح. انقر مرة أخرى ، وسيتم عرضها على تركيز الخلية ، ومتوسط ​​حجم الخلية الجديدة وقطر.
4. يمكن أيضا تبديل يمكن نقلها إلى أي من الجانبين للتبديل بين عرض التاريخ والوقت ، يعني حجم الخلية ، ومتوسط ​​حجم الخلية.
5. ويمكن تخزين ما يصل الى 72 رسوم بيانية على الصك نفسه. لتحميل البيانات إلى جهاز كمبيوتر شخصي ، نعلق الصك عبر منفذ كابل USB على الشاشة.
6. على جهاز الكمبيوتر ، انقر مرتين على الصولجان تطبيق برامج لإطلاق البرنامج ثم انقر على "الاتصال". وسوف جميع التهم منفذ تلقائيا إلى البرنامج.
7. تطبيق البرمجيات الصولجان يعرض الرسم البياني تفاصيل التوزيع السكاني للثقافة في أي حجم أو القطر. ويمكن بعد ذلك تحميل الملفات يتم تصديرها إلى Microsoft Excel ، حيث سيتم عرض البيانات الأولية في صناديق من أقطار الخلية المحددة أو وحدات التخزين الخلية.

5. ممثل النتائج

1. وأعدت تسعة عشر خطوط مختلفة من الخلايا لحساب وتحددت تركيزات النظرية بدءا باستخدام عداد كولتر. ثم تم تعليق هذه الخلية للحصول على مزيد من المخفف الايقاف الخلية بتركيزات الخلية النظري.
2. ثم تم استخدام العداد لتحديد الخلية الصولجان تركيزات الخلية. ويوضح الشكل 1 5 التخفيفات التي تم قياسها لمدة 5 خطوط الخلايا ممثل جنبا إلى جنب مع تركيز الخلية النظري.
3. درجة عالية من الخطي كما يتبين من القيم R2 ، يدل على أن العد الصولجان هي طريقة موثوق بها للخطوط الخلايا اختبار ، عبر طائفة واسعة تعمل الخطية.
4. وتتجلى دقة الشاملة النسبية العد الصولجان في الشكل 2 ، والتي تتم مقارنة البيانات التي تم الحصول عليها من العد الصولجان مع التهم التي تم الحصول عليها من العد كولتر.
5. يتم رسم سجل للتعداد خلايا الصولجان ضد السجل من التهم كولتر ، ويظهر ذلك في جميع خطوط الخلايا اختبار ، تعول الصولجان مباراة تهم كولتر.
6. أجريت تهم خطوط الخلايا باستخدام 19 كولتر Z2 مكافحة الإرهاب ، والعداد الخلية الصولجان ، عداد الآلي القائم على رؤية مثل السادس سيل أو نظام لا يحصى ، وhemocytemeter ملف.
7. أجريت التهم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ، وذلك باستخدام نفس الخلية بدءا التعليق والتخفيفات متطابقة. أظهرت النتائج في الشكل 3 إثبات أن تركيزات الخلية تقاس الصولجان العد المباراة بشكل وثيق مع نظرية الخلية تركيزات عالية الخطي.
8. تم احتساب معامل في المئة من التباين ، أو السيرة الذاتية ، والتخفيف عن كل خلية من كل سطر لكل نظام العد. ويبين الشكل 4 ٪ متوسط ​​السير الذاتية عبر خطوط الخلية 19 فيما يتعلق تركيز الخلية وطريقة عد الأصوات.
9. ضمن نطاق التشغيل ، ومكافحة خلية الصولجان هو أكثر دقة من رؤية العد عدادة الكريات يستند إلى عرض أصغر الانحرافات المعيارية ومعاملات المتوسط ​​أصغر من الاختلاف.
10. الصولجان العد عشر مرات أسرع من hemocytometry وأسرع من العدادات الآلية الأخرى أيضا. في الشكل 5 ، SF9 ، MCF7 ، وخلايا HEK293 احصي باستخدام الأساليب المذكورة في هذا الفيديو.
11. تم تسجيل متوسط ​​الوقت اللازم لقياس تركيز الخلية. علما بأن تنفيذ hemocytometry مرة واحدة فقط لكل عينة.
12. الصولجان يجعل قياسات استنادا إلى حجم الخلية. بالتالي يمكن القبض على أي تغييرات في التشكل الخلوي في الرسم البياني. عرض ثقافات صحية لطيفة توزيع جرس جاوس الشكل ، في حين أن الخلايا غير الصحية ، وليز ، وتتسبب في حدوث تحول في الرسم البياني إلى اليسار (الشكل 6 ، اللوحة اليسرى).
13. وبالمثل ، عندما كانت مختلطة السكان من الخلايا الميتة 50 ٪ مع الخلايا الحية بنسبة 50 ٪ ، لاحظ أيضا تحولات الرسم البياني (الشكل 6 ، اللوحة اليمنى).

المناقشة

بمقارنة أداء الخلية لمكافحة الصولجان النتائج من غيرها من وسائل العد ، نستنتج أن هذا محمول جديد ، ومكافحة خلية الآلي يسلم تعداد خلايا دقيقة وسريعة وموثوق بها على نطاق واسع التشغيل. وظيفة العد الصولجان هو نتيجة لهذه التكنولوجيا جزءا لا يتجزأ من الدقة الهندسية في تلميح وأجهزة استشعار متطورة الفرز القائم على مبدأ كولتر. جودة الأداء يوحي الصولجان العد كطريقة لزيادة السرعة وتحسين استنساخ خلية مقرها المقايسات. تنسيق محمول يسمح الملل السريع مجانا الحق في العد الخلية هود الثقافة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
اسم المادة	شركة	رقم كتالوج	تعليق
الصولجان 2.0 المحمولة خلية مكافحة الآلي مع 40 ميكرومتر مجسات الصولجان	EMD ميليبور	PHCC20040
الصولجان 2.0 المحمولة خلية مكافحة الآلي مع 60 ميكرومتر مجسات الصولجان	EMD ميليبور	PHCC20060
مجسات الصولجان ، و 60 ميكرومتر	EMD ميليبور	PHCC60050	50 حزمة من أجهزة الاستشعار
مجسات الصولجان ، و 40 ميكرومتر	EMD ميليبور	PHCC40050	50 حزمة من أجهزة الاستشعار
محترف عالمي محول	EMD ميليبور	PHCCPOWER
الصولجان يا خاتم كيت	EMD ميليبور	PHCCOCLIP	O - 2 الخواتم وغطاء واحد مرشح