مقالة منهجية

بروتوكول للانتاج من الصليب الوراثية للطفيليات الملاريا القوارض

15K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/2365

⸱

يناير 3, 2011

 ,  , 
1National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 2School of Life Science, Xiamen University

في هذه المقالة

ملخص

يتم تنفيذ الصلبان الجينية لطفيليات الملاريا من خلال إطعام القوارض two الطفيليات متميزة وراثيا لالبعوض. يتم استنساخ المؤتلف من سلالة الدم الماوس بعد السماح لدغة البعوض الفئران المصابة. هذا الفيديو يبين كيفية إنتاج الصلبان الجينية المتصورة yoelii وينطبق على غيرها من طفيليات الملاريا القوارض.

الملخص

الاختلاف في الاستجابة للأدوية المضادة للملاريا وتسببها طفيليات الملاريا من بيولوجية والأهمية الطبية. وقد أدى رسم خرائط لتحديد العلاقة ناجحة من الجينات أو الصفات الكامنة مواضع مختلفة في طفيليات الملاريا من القوارض والبشر 1-3 و 4-6. طفيلي الملاريا المنجلية yoelii هي واحدة من العديد من أنواع الملاريا المعزولة من القوارض البرية وأفريقيا وقد تم تكييفها لتنمو في المختبرات. يستنسخ هذا النوع في كثير من الخصائص البيولوجية للطفيليات الملاريا البشرية ، وقد تم أيضا علامات وراثية مثل الصغرية وتضخيم تعدد الأشكال طول جزء علامات (AFLP) وضعت للطفيلي 7-9. وبالتالي ، يمكن إجراء دراسات الجينية في طفيليات الملاريا القوارض لاستكمال البحث في المنجلية. هنا ، علينا أن نظهر للتقنيات لإنتاج عبر الجينية في P. yoelii التى كانت أول من الدكاترة. Walliker ديفيد كارتر ، ريتشارد ، وزملاؤه في جامعة أدنبرة 10.

الجينية الصلبان في P. وتجرى yoelii وغيرها من طفيليات الملاريا التي تصيب الفئران القوارض العضلة المصحف مع اللقاح يحتوي على اثنين من الحيوانات المستنسخة gametocytes متميزة وراثيا التي تختلف في الظواهر من الاهتمام والبعوض عن طريق السماح لتتغذى على الفئران المصابة بعد 4 ايام من العدوى. وأكد وجود المجهر gametocytes الذكور والإناث في الدم الماوس قبل التغذية. في غضون 48 ساعة بعد الرضاعة ، في المعي المتوسط ​​من البعوض ، علما gametocytes فرداني تفرق في الأمشاج الذكور والإناث ، وتسميد ، وتشكيل لاقحة مضاعفا (الشكل 1). أثناء وضع البويضة الملقحة إلى ookinete ، ويبدو أن الانقسام الاختزالي تحدث 11. إذا مشتق اقحة من خلال التلاقح بين الأمشاج من الطفيليات متميزتين وراثيا ، وتبادل الوراثية (الكروموسومات والاندماج تلك المبالغ عبر بين شقا الصبغي غير شقيقة زوج من الكروموزومات المتماثلة ؛ الشكل رقم 2) قد تحدث ، مما أدى إلى إعادة التركيب المادة الوراثية في مواضع مثلي. يخضع كل اقحة شعبتين النووية المتعاقبة ، مما أدى إلى فرداني النوى الأربعة. لمزيد من ookinete يتطور الى البيضة المتكيسة. بمجرد أن تنضج البيوض المتكيسة ، تتشكل من آلاف sporozoites (على سلالة الصليب) وأطلق سراحه في hemoceal البعوض. ويتم حصاد Sporozoites من الغدد اللعابية وحقنها في الفئران استضافة جديدة ، حيث قبل الكريات الحمراء والكريات الحمراء تطوير المرحلة تأخذ مكان. يتم استنساخ أشكال الكريات الحمر وتصنيفها فيما يتعلق الشخصيات المميزة للخطوط الوالدين قبل رسم خرائط الربط الجينية. تتم العدوى من الحيوانات المستنسخة السيطرة الأبوية الفردية في بنفس طريقة إنتاج عبر الجينية.

البروتوكول

ويجب تطبيق تقنيات التطهير لجميع المواد التي سوف تدار في الحيوانات لتفادي الاستخدام غير المتعمد للعوامل الخارجية في الفئران المعدية التي يمكن أن نخلط النتائج التجريبية.

1. إصابة فئران المختبر مع طفيليات الملاريا في الدم في مرحلة

  1. في درجة حرارة الغرفة ، وذوبان الجليد أن عبرت two قارورة تحتوي على طفيليات الدم الملاريا مرحلة المجمدة. في هذا المثال ، واثنين من سلالات طفيل الملاريا القوارض المستخدمة هي المتصورة المنجلية وyoelii yoelii nigeriensis yoelii.
  2. تناسب المحاقن مع إبرة 22-30 (G) ومقياس رسم 400 ميكرولتر من العقيمة ، برنامج تلفزيوني الصف الصيدلانية (7.4 درجة الحموضة).
  3. استخدام الحقنة نفسها ، ووضع 100 ميكرولتر من دم المصابين إذابة ؛ عكس المحقنة صعودا وهبوطا حتى يتم خلط متجانس المحتوى. (اختياري : يمكن استخدام ماصة لنقل الدم الملوث وPBS في أنبوب جمع قبل نقل إلى حقنة لحقن).
  4. ضخ 200 ميكرولتر من الطفيليات التي تحتوي على حل مباشرة في الصفاق على فأرة الحاسوب. عند الانتهاء ، رفض بن لحقنة في الحادة. (انظر أيضا مواد تكميلية للصيانة من الفئران المختبرية). عموما ، فإن حجم قياسي من اللقاح ما بين 100-500 ميكرولتر ، اعتمادا على مستويات العدوى الطفيلية في المواد المجمدة الأصلي.
  5. حقن سلالات الطفيلي اثنين يتم عبروا الى قسمين كل الفئران. وسوف تصبح إيجابية الفئران المجهر 3 إلى 5 أيام بعد الحقن. عندما تصل إلى ما بين 1-5 parasitemias ٪ ، انتقل إلى الخطوة التالية.

2. العدوى المختلطة استنساخ من الفئران

  1. قبل استنساخ عدوى مختلطة ، وجمع الدم من ذيل الفئران المصابة two المانحة مع السلالات المختلفة للطفيلي بواسطة الفحص المجهري ملطخة بالدم مسحات بالغيمزا رقيقة (الشكل 3) ، ولقياس كثافة خلايا الدم الحمراء (انظر المواد التكميلية لإجراءات تفصيلية) .
  2. حساب حجم المياه المالحة من الفسيولوجية (1.5 ٪ ث / ت سترات ثلاثي الصوديوم ثنائي الهيدروكسيل ، 0.85 ٪ W / V كلوريد الصوديوم) والدم الماوس المطلوبة لإنتاج خليط قيحة ، وذلك باستخدام تطفلن الدم الحمراء وقياسات كثافة خلايا الدم التي تم الحصول عليها في وقت سابق.
  3. ضبط الحل الطفيلي إلى تركيز واحدة أخيرة مليون مصاب في خلايا الدم الحمراء 100μl.
  4. تجمع الدم من المتبرعين المصابين اثنين في نسبة 1:1 للحصول على اللقاح مختلط استنساخ. عند استنساخ two الوالدية تختلف في معدل النمو ، وضبط نسب ل. الأسرع نموا الوالدين لاستنساخ تباطؤ النمو أو الوالدين ل01:02 01:05
  5. ضخ 100 ميكرولتر من عينة مختلطة في كل البريتوني الماوس لتكون مصابة. (انظر أيضا الخطوة 3.9 لتحديد عدد من الفئران التي حقنت)
  6. باستخدام هذا الأسلوب ، تصيب فأرتان مع كل السلالات الأبوية واحد. فإن العدوى واحد استنساخ تسمح بتحديد انتقال الناجح لسلالتين الأبوية.

3. تغذية البعوض

  1. إعداد ثلاثة أقفاص تحتوي على 300-500 الكبار (ذكور واناث) stephensi الأنوفيلة البعوض كل من ، عصر ما بعد 5-7 أيام من ظهور العذراء. وتغطي هذه الحاويات مع المعاوضة آمن بها غطاء من البلاستيك أو المعدن. هي لاثنين من أقفاص الحيوانات المستنسخة التي تتغذى على الوالدين ؛ القفص الثالث لإعداد عبر الجينية.
  2. تبدأ بعد أربعة أيام من العدوى المختلطة استنساخ ، وإعداد بالغيمزا الملطخة بالدم الذيل رقيقة مسحة من الفئران المصابة.
  3. فحص مسحات تحت المجهر من خلال فحص ما لا يقل عن 50 حقلا المجهرية في التكبير 1000x وتحديد ما إذا gametocytes الذكور والإناث موجودة.
  4. gametocytes الذكور والإناث والتمييز بسبب وجود فجوة كبيرة وحبيبات كبيرة (الشكل 3). gametocytes الذكور والإناث والسيتوبلازم الوردي والأزرق ، على التوالي. إذا gametocytes موجودة ، اتبع الخطوة 3.6.
  5. إذا gametocytes غائبة ، والحفاظ على الرصد اليومي حتى تظهر. إذا gametocytes موجودة ، والاستمرار في الخطوة التالية.
  6. ضخ 50 ميكرولتر من مخدر كوكتيل المخدرات التي تحتوي على 33 ملغ / مل من الكيتامين و 3 ملغ / مل من زيلازين في الصفاق من الماوس لتخدير كل فأر مصاب (20 في المائة جرام من وزن الجسم الماوس). الجرعة النهائية من الكيتامين وزيلازين هي 82.5 و 7.5 ملغ / كلغ على التوالي.
  7. مكان الفئران على وجهه على أعلى قفص يحتوي على الكبار الأنوفيلة البعوض stephensi التي تم حرمانها من امدادات السكر لمدة 24 ساعة والسماح للبعوض لتغذية لمدة 30 دقيقة دون انقطاع.
  8. الحفاظ على البعوض في insectary في ظل ظروف قياسية (يتم الاحتفاظ درجة الحرارة بين 24-26 درجة مئوية ، وانظر أيضا أساليب تكميلية لصيانة المختبرات البعوض).
  9. استخدام واحد عن كل فأر مصاب البعوض 5-10 الإناث. الموت ببطء الفئران مباشرة بعد خلع عنق الرحم في حين أن تغذية الفئران لا يزال تحت التخدير.

4. تشريح البعوض MidgUTS والبيضات العد

  1. بعد تسعة أيام من التغذية ، سيتم فحص البعوض للالبيضات في المعي المتوسط ​​للحشرة. وجود البعوض في البيضات التي تتغذى على واحد استنساخ الفئران المصابة يشير إلى أن gametocytes من سلالتين الأبوية معدية.
  2. تشريح البعوض المعي المتوسط ​​، استخدام شفاطة متصلة وعاء صغير لجمع 5-10 البعوض المصابة من القفص.
  3. باستخدام غاز ثاني أكسيد الكربون 2 ، تخدير البعوض ونقلها إلى طبق بيتري الزجاج على الجليد. وتجاهل منفصلة ذكور البعوض. هوائيات من الذكور بشكل ملحوظ bushier بالمقارنة مع الإناث.
  4. ملء two المحاقن مع برنامج تلفزيوني ودمجها مع قياس 26 بوصة ونصف (½ G) الإبر. الودائع حوالي 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني من حقنة على شريحة زجاجية.
  5. نقل 5-10 إناث البعوض تخدير على الهبوط من برنامج تلفزيوني ومكان الشريحة على مجهر تشريح.
  6. استخدام إبر نفسه ، وإزالة كل أجنحة البعوض والساقين ، وبعد ذلك ، عقد الحشرة في الصدر والبطن الخلفي ، وسحب الجسم بعيدا حتى المعي المتوسط ​​، بيضاء تشبه كيس الجسم ، ويتم تحريرها. فصل المعي المتوسط ​​وتجاهل بقية الجسم.
  7. إضافة المزيد من PBS على المعي المتوسط ​​إذا الشرائح جافة. سوف تتدهور إذا ترك المعي المتوسط ​​المجففة. وضع غطاء على زلة midguts.
  8. دراسة midguts تحت المجهر في ضوء التكبير 100X. عد الأرقام من البيضات في كل المعى المتوسط ​​(الشكل 3). البيضات يتم التعرف على الجدران سميكة بنية دائرية التي تقع على السطح الخارجي للmidguts.
  9. عند الانتهاء ، والتخلص من المحاقن والإبر ، والانزلاق في بن الحادة.
  10. إذا البيضات غائبة في midguts والأعلاف البعوض مع الفئران المصابة مع ارتفاع عدد gametocytes وإعطاء وقت أطول للتغذية. درجة الحرارة الحرجة لهذه الخطوة. تأكد من ضبط درجة الحرارة عند درجة مئوية 24-26

5. جمع Sporozoites من البعوض بواسطة الطرد المركزي

  1. إعداد أنابيب جمع حيوان بوغي على النحو التالي : قطع غطاء أنبوب الطرد المركزي نظيفة 0.5 مل وكمة ثقب (0،1-0،2 مم) في الجزء السفلي من الأنبوب باستخدام إبرة ملتهب G 19.
  2. ملء 1 / 3 من الأنبوب مع الصوف الزجاجي. إدراج أنبوب تصفية في أنبوب جمع 1.5 مل (أنبوب واحد يكفي لsporozoites الحصاد من البعوض 100 ~)
  3. على تغذية يوم آخر 17 ، وجمع البعوض (الخطوة 4) من الأقفاص في وعاء صغير باستخدام الشافطة.
  4. استخدام غاز ثاني أكسيد الكربون 2 لتخدير البعوض.
  5. فصل الاناث عن الذكور في البعوض. نقل البعوض تخدير الإناث من الحاوية على طبق بيتري الزجاج على الجليد.
  6. إعداد two المحاقن مع الإبر 26 ½ G مليئة برنامج تلفزيوني. الودائع حوالي 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني من حقنة على شريحة زجاجية.
  7. نقل البعوض على شريحة المجهر. إزالة رأس البعوض "، وأجنحة والساقين والبطن وتشريح تحت المجهر.
  8. باستخدام غرامة ذات الرؤوس ملقط نقل الصدور في برنامج تلفزيوني 0.5 مل في الخالط 1.5 مل (هاون ومدقة). تخزين الصدور على الجليد (حيوان بوغي تبقى معدية لمدة 2-3 ساعة).
  9. التجانس في الصدور على الجليد لاطلاق سراح sporozoites من الغدد اللعابية (انظر الشكل 3) ، ونقل lysates (الخليط) في أنبوب مملوء الصوف الزجاجي (الخطوة 5،1-5،2) باستخدام ماصة الزجاج.
  10. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 إلى 20 ثانية في 1000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  11. جمع التدفق من خلال (تعليق حيوان بوغي المنقى) باستخدام حقنة بإبرة G 22-30. (اختياري : قطرة 10-50 ميكرولتر من التدفق من خلال الشكل ، على شريحة مجهرية ، ضع غطاء الانزلاق وتصور sporozoites يعيشون تحت المجهر الخفيفة القياسية ، 400X التكبير ، وانظر أيضا 3)
  12. حقن IP 0،1-0،5 مل من تعليق حيوان بوغي في الفئران (يمكن حصاده تصل إلى 200000 من البعوض طفيليات واحد ، وانظر المرجع 12). في قضية ناجحة ، سوف يصاب الحيوان 72 ساعة بعد الحقن.

6. النسل الاستنساخ باستخدام التخفيف المحدود

  1. اثنان وسبعون ساعة بعد حقن حيوان بوغي ، وجمع الدم من ذيل الفئران المصابة two المانحة مع السلالات المختلفة للطفيلي بعد الفحص المجهري تلطيخ بالغيمزا من مسحات الدم ورقيقة لقياس كثافة خلايا الدم الحمراء (انظر المواد التكميلية لإجراءات تفصيلية).
  2. اختيار عرض على الماوس تطفلن الدم 0،1-1 ٪ وإصابة خلايا الدم الحمراء تحتوي على طفيليات واحد وغالبا ما تكون الجهات المانحة لإجراء الاستنساخ. كرر الخطوة 6.1 الأيام المقبلة إذا الفئران هي المجهر سلبية. إذا لم يتم إصابة الحيوانات في غضون 14 أيام ، كرر الخطوة 2 إلى 5 و تحديد وجود sporozoites في الخطوة 5.11).
  3. تمييع الدم الذيل المقطوع في حل 01:01 الباردة حل العجل رينغر المصل والثدييات و(2.7 ملي مول كلوريد البوتاسيوم ، كلوريد الكالسيوم 1،8 مم ، 154 مم كلوريد الصوديوم) وذلك للوصول الى يخدعوحدانية من 0،6-1 خلايا الدم الحمراء المصابة لكل 100 ميليلتر ، وتخزين اللقاح على الجليد. في هذه الطريقة ، ينبغي معظم الماوس الفردية تتلقى واحد أو صفر الطفيليات.
  4. حقن في الوريد 100 ميكرولتر من الدم الملوث المخفف في كل من 50 إلى 100 الفئران.
  5. خمسة إلى سبعة أيام في وقت لاحق ، وشاشة الفئران عن وجود الطفيليات في الدم عن طريق فحص المرحلة بالغيمزا الملطخة بالدم مسحة رقيقة. في تجربة ناجحة ، يصاب 20-50 ٪ من الفئران ، وسوف تظهر تطفلن الدم من 0،1-5،0 ٪ في آخر يوم 8 العدوى.

7. توصيف النسل باستخدام علامات وراثية

  1. جمع 20-40 ميكرولتر من الدم ذيل فأر في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل يحتوي على 0.2 مل من محلول سترات مبردة الفسيولوجية المالحة ، لفترة وجيزة الدوامة ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 3000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لخلايا كريات الدم. استخراج الحمض النووي على الفور أو في الحفاظ على بيليه -80 درجة مئوية.
  2. إعداد طفيل DNA باستخدام أي استخراج الحمض النووي القياسية الأساليب. لعزل الحمض النووي السريع ، واستخدام القالب PCR السامية الصرفة إعداد مجموعة (روش العلوم البيولوجية التطبيقية).
  3. ويتم تحديد النسل بعد المؤتلف التنميط الجيني باستخدام الصغرية (MS) ، أو تعدد الأشكال النوكليوتيدات واحد (SNP) على الكروموسومات المختلفة التي يمكن التفريق بين سلالتين من الوالدين الصليب الجينية. وهناك طريقة واحدة مبسطة باستخدام بادئات الفلورسنت ذات العلامات التنميط الجيني لمرض التصلب العصبي المتعدد من P. ويمكن استخدام yoelii (انظر المرجع 8،9).

8. الحفظ بالتبريد من طفيليات الملاريا في الدم في مرحلة

  1. مبردة جمع 0،5-1 مل من الدم الملوث عن طريق إجراء بزل القلب من الماوس مع تخدير تطفلن الدم من 50-20 ٪ في 50-10 مل محلول ملحي الفسيولوجية.
  2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق على 2000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف.
  3. إضافة قطرة من الحكمة حجم 2X من حل 57 Glycerolyte (Fenwal مختبرات) على كريات الدم ومزيج جيد.
  4. نقل إلى تعليق cryotubes (0،2-0،5 مل في أنبوب).
  5. تخزين الدم في cryopreserved -80 درجة مئوية (ما يصل إلى 1 في الشهر) ، أو في النيتروجين السائل.

9. ممثل النتائج :

في تجربة ناجحة ، وسوف 5-10 ٪ من خطوط المستنسخة تكون ذرية المؤتلف مستقلة.

الشكل 1
الشكل 1. تمثيل تخطيطي لدورة الحياة والأحداث خلال بالتعديل الوراثي عبر الجينية. أحداث بالتعديل الوراثي ستجري خلال المرحلة الأولى من التطوير في البعوض. بعد إخصاب الأمشاج "فرداني" من الذكور والإناث من خلفيات وراثية مختلفة في المعي المتوسط ​​في البعوض ، ويتم تشكيل "مضاعفا" بيضات ملقحة. لاقحة يشكل مرحلة ضعفاني فقط من دورة حياة الطفيل ؛ الانقسام الاختزالي في غضون 12 ساعة بعد الإخصاب ، وجميع مراحل لاحقة في البعوض والثدييات يظل فرداني. وأدى تطوير بيضات ملقحة في ookinetes والبيضات. النمو والانقسام الإنقسامية كل البيضة المتكيسة تنتج الآلاف من sporozoites ، والتي تم إصدارها في hemoceal البعوض. sporozoites تلك التي تهاجر إلى الغدد اللعابية هي في وضع يسمح لها أن تنتقل إلى مضيف الثدييات ، حيث تطور الكبد وخلايا الدم الحمراء مراحل تأخذ مكان. أثناء دورات خلايا الدم الحمراء ، يمكن لبعض الطفيليات تفرق في ناضجة gametocytes الذكور والإناث. اكتمال دورة حياة الطفيل عندما تؤخذ هذه gametocytes بنسبة آخر انتقال البعوض إلى إدامته.

الشكل 2
الشكل 2. راثة الجينات النووية في طفيليات الملاريا وإنتاج ذرية المؤتلف. يمكن أن تتولد من خلال بالتعديل الوراثي الاندماج تلك الكروموسومات أو الأحداث كروس. نسل متماثل التي تنتجها إخصاب ذاتي الأمشاج بين الوالدين من استنساخ نفسه 1 أو 2 (A و D) ، على التوالي. B) ذرية متخالف التي تنتجها تلاقح بين الأمشاج من الحيوانات المستنسخة two الأبوية مختلفة ، نوى المؤتلف (الاهليليجات الزرقاء) التي يشكلها الاندماج تلك الكروموسومات وحدها. C) التي تنتج من ذرية متخالف تلاقح بين الأمشاج من الحيوانات المستنسخة two الأصل مختلفة ، نوى المؤتلف (الاهليليجات الحمراء) التي يجري تشكيلها من قبل عمليات الانتقال بين شقا الصبغي غير شقيقة الكروموزومات المتماثلة.

الشكل 3
الشكل 3. المورفولوجيا من القوارض yoelii الملاريا المنجلية الطفيلي. أ) المرحلة الطوق ، B) أتروفة ، C) المتقسمة ، D) merozoites ، E) العرسية الذكور غير ناضجة ، F) العرسية الذكور الناضجة ، G) العرسية الإناث غير ناضجة ، H) العرسية الإناث الناضجة ، I) المعى المتوسط ​​مع البيضات في آخر 10 يوما تغذية (البيضات الناضجة المشار إليها بواسطة الأسهم ؛ 200X التكبير) ، J) الغدد اللعابية للبعوض (التكبير 100X) ، K) sporozoites (400X التكبير).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نبدي تقنيات لإنتاج عبر الجينية في الملاريا المنجلية yoelii القوارض ، وهو ينطبق أيضا على الإنتاج من الصلبان الجينية في malarias القوارض الأخرى. تتم عادة التهابات استنساخ الفئران مع الوالدين واحد لتحديد انتقال ناجحة للطفيليات الوالدين لضمان أن الوالدين هما المختصة في إنتاج الأمشاج وظيفية قبل تنفيذ الصليب.

يتأثر انتقال ناجحة من خلال البعوض عن عوامل متعددة بما في ذلك درجة حرارة insectary ، نوعا من طفيليات ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لأن الكتاب والعاملين في الحكومة وهذا هو عمل الحكومة ، والعمل في المجال العام في الولايات المتحدة. بصرف النظر عن أي اتفاقات أخرى ، والمعاهد الوطنية للصحة تحتفظ بحقها في تقديم العمل الذي PubMedCentral للعرض والاستخدام من قبل الجمهور ، وربما PubMedCentral العلامة أو تعديلها بما يتفق مع العمل ممارساتها العرفية. يمكنك وضع حقوق الانسان من خارج الولايات المتحدة في هذا الموضوع الى حكومة ترخيص استخدام.

شكر وتقدير

نشكر الدكاترة راندي الكينز ، Kastenmayer روبن ، توري تيد ، دان وباري ليمان Tovi لقراءة نقدية للمخطوطات. وأيد هذا العمل من قبل برنامج بحوث جماعية لشعبة بحوث جماعية ، المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية والمعاهد الوطنية للصحة ، والبرنامج الوطني للبحوث الأساسية 973 من الصين ، # 2007CB513103. نشكر NIAID جماعية محرر بريندا راي مارشال للمساعدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

المواد التكميلية :

  • الحفاظ على الفئران المختبرية
  • صيانة المختبرات البعوض
  • الفحص المجهري لمسحة رقيقة ملطخة بالدم بالغيمزا صمة عار
  • قياس كثافة خلايا الدم الحمراء

الحفاظ على الفئران المختبرية

وتستخدم المختبرات الإناث من السلالة الفطرية الماوس BALB / ج ، تتراوح أعمارهم بين 5 إلى 8 أسابيع من العمر ، في هذه الدراسة. ويعيش في قفص الفئران القياسية الصلبة البولي السفلي بسلك بار غطاء ، ومجهزة التغذية وزجاجة ماء. تتم المحافظة على الفئران في درجة حرارة ثابتة (25 ± 1 درجة مئوية) في 12:12 ساعة ضوء : دورة الظلام. ويسمح لتتغذى على الفئران Teklad 2018S هارلان العالمية حمية البروتين القوارض مقذوف 19 ٪ (تعقيمها ؛ من هارلان - Teklad) وإمداده بالمال وبالشهرة أيضا مياه الشرب يحمض الإعلانية. وتجرى التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها لجنة رعاية الحيوان ، واستخدم في المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية في إطار بروتوكول LMVR11E (المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا بولاية ماريلاند).

صيانة المختبرات البعوض

البعوض من مستعمرة مختبريا ولدت من stephensi الأنوفيلة. تمسك البالغين في أقفاص النايلون الاحتفاظ بها في درجة الحرارة والرطوبة الغرفة التي تسيطر عليها (من 23 إلى 25 درجة مئوية لمدة yoelii المتصورة المنجلية وchabaudi ، و 19 إلى 21 درجة مئوية لمدة berghei المتصورة ؛ الرطوبة 80-95 ٪ ، في 12:12 ساعة النور : دورة الظلام). ويتم تغذية البعوض البالغ مع الجلوكوز 10 ٪ و 2.00 ٪ شبه أمينوبنزويك حمض (PABA) يستكمل المحلول المائي. للحصول على نوعية عالية من البالغين ، وتزرع 500 اليرقات في حالة المنخفض الكثافة في 1 لتر من الماء المقطر في طبق 3 1000 سم فتح المرفق مع ما يقرب من 1 ملغ من بيكربونات الصوديوم. بعد الفقس ، ونظرا ليرقات tetramin مسحوق (بتكو) حتى أن تتطور إلى مرحلة الخادرة ويتم نقلها إلى أقفاص البعوض الكبار للناشئة.

الفحص المجهري لمسحة رقيقة ملطخة بالدم بالغيمزا صمة عار

مقص نظيفة باستخدام القصاصة قبالة الطرف (1.0 ملم) من ذيل فأر مصاب. مكان قطرة واحدة (0،5-1،0 ميكرولتر) من الدم على شريحة الذيل عينة نظيفة. ووقف نزيف في الماوس 1-2 دقيقة. مكان شريحة مفرشة نظيفة على رأس قطرة الدم ، والحفاظ عليه في زاوية 45 درجة بالنسبة إلى الشريحة العينة ، والسماح للالدم إلى كثف إلى العرض الكامل للنثر. عقد الشريحة العينات ودفع الشريحة مفرشة بسرعة وسلاسة لإنتاج مسحة رقيقة. السماح للفيلم الدم الجافة ، ومن ثم تزج الشرائح في الميثانول مطلقة. تتيح الشريحة الهواء الجاف مرة أخرى قبل ذلك مع وصمة عار تغطي بالغيمزا (صبغة بالغيمزا 10 ٪ في الماء المقطر). بعد احتضان هذه الأفلام رقيقة في الدم لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وشطف بعناية الشرائح مع ماء الصنبور والسماح لها الهواء الجاف. فحص عدد خلايا الدم الحمراء المصابة (iRBC ؛ انظر الشكل 3 للمورفولوجية RBC المصابة) تحت المجهر الخفيفة بزيت الغمر في التكبير 1000x (مع عدسة الهدف 100X) وحساب تطفلن الدم (عدد iRBC تحسب لكل 100 RBC). سلالات مختلفة من طفيليات الملاريا تختلف في معدل النمو والقدرة الإمراضية. لا يمكن أن يؤديها رصد parasitaemias المرحلة بعد حقن الدم 24hrs ، اعتمادا على جرعة من طفيليات الملاريا في الدم المرحلة. على سبيل المثال ، سوف تكون الفئران المجهر الإيجابية لمدة 24 ساعة عندما حقنوا 10 7 intraperitoneally RBC المصابة أو 10 6 RBC المصابة عن طريق الوريد.

قياس كثافة خلايا الدم الحمراء

مثل مستويات parasitaemias ، خلايا الدم الحمراء (RBC) في كثافة الفئران المصابة يختلف طوال العدوى. وينبغي قياس كثافة RBC في غضون 1-2 ساعات قبل بداية العدوى واحد والمختلط واستنساخ تجارب الاستنساخ. هناك طريقتان لقياس كثافة RBC : أ الفرز اليدوي باستخدام نويباور عدادة الكريات والعد الآلي باستخدام Cellometer (Nexcelom العلوم البيولوجية). في كلتا الطريقتين ، وسحب 1 ميكرولتر من الدم ذيل فأر باستخدام الزجاج الشعرية (VWR) ، وتمييع في 10 مل من برنامج تلفزيوني وتخلط جيدا. لاستخدام عدادة الكريات نويباور ، تحميل 20 ميكرولتر من التعليق على هذه عدادة الكريات. ضع عدادة الكريات على ضوء المجهر مع عدسة الهدف 10X. وعدادة الكريات يحتوي على الشبكة مقسمة الى 9 مربعات كبيرة ، و 4 مربعات كبيرة في الزاوية هي كذلك تنقسم إلى 16 مربعات صغيرة. إحصاء عدد الخلايا في كل من المربعات الصغيرة 16 في الساحات الزاوية الأربعة. عد لتجنب التحيز أو عد الخلايا التي تتداخل خط الشبكة ، كما العد خلية "في" إذا كان تداخل خطوط الأعلى أو إلى اليمين و "الخروج" في حال تداخل خطوط أسفل أو اليسار. ويقدر عدد الخلايا في مربع واحد صغير والقسمة 0.00625 (حجم صغير مربع واحد هو 6.25 NL). غلة هذا العدد من الخلايا لكل ميكروليتر (&مو ؛ L). من هذه البيانات ، حساب نهائي خلايا الدم الحمراء عن طريق ضرب كثافة مع 10،000 (عامل تمييع). شطف زلة تغطية وغرفة الفرز مع الماء المقطر والإيثانول 70 ٪ ؛ الهواء الجاف. بدلا من ذلك ، تحميل 20 ميكرولتر من التعليق على الشريحة Cellometer غرفة الفرز. إدراج الشرائح في غرفة الشريحة Cellometer (القارئ). بدء تشغيل البرنامج Cellometer ، حدد "خلية الدم الحمراء" الخيار ، وإدخال عامل التخفيف من 10،000. سجل كثافة RBC.

المراجع

  1. Hayton, K., Ranford-Cartwright, L. C., Walliker, D. Sulfadoxine-pyrimethamine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi. Antimicrob Agents Chemother. 46, 2482-2489 (2002).
  2. Cravo, P. V. Genetics of mefloquine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi. Antimicrob Agents Chemother. 47, 709-718 (2003).
  3. Hunt, P., Cravo, P. V., Donleavy, P., Carlton, J. M., Walliker, D. Chloroquine resistance in Plasmodium chabaudi: are chloroquine-resistance transporter (crt) and multi-drug resistance (mdr1) orthologues involved? Mol Biochem Parasitol. 133, 27-35 (2004).
  4. Yuan, J. Genetic mapping of targets mediating differential chemical phenotypes in Plasmodium falciparum. Nat Chem Biol. 5, 765-771 (2009).
  5. Su, X., Kirkman, L. A., Fujioka, H., Wellems, T. E. Complex polymorphisms in an approximately 330 kDa protein are linked to chloroquine-resistant P. falciparum in Southeast Asia and Africa. Cell. 91, 593-603 (1997).
  6. Hayton, K. Erythrocyte binding protein PfRH5 polymorphisms determine species-specific pathways of Plasmodium falciparum invasion. Cell Host Microbe. 4, 40-51 (2008).
  7. Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. Congenicity and genetic polymorphism in cloned lines derived from a single isolate of a rodent malaria parasite. Mol Biochem Parasitol. 157, 244-247 (2008).
  8. Li, J. Hundreds of microsatellites for genotyping Plasmodium yoelii parasites. Mol Biochem Parasitol. 166, 153-158 (2009).
  9. Li, J. Typing Plasmodium yoelii microsatellites using a simple and affordable fluorescent labeling method. Mol Biochem Parasitol. 155, 94-102 (2007).
  10. Walliker, D., Carter, R., Morgan, S. Genetic recombination in malaria parasites. Nature. 232, 561-562 (1971).
  11. Sinden, R. E., Hartley, R. H. Identification of the meiotic division of malarial parasites. J Protozool. 32, 742-744 (1985).
  12. Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes. J Parasitol. 70, 831-833 (1984).
  13. Yoeli, M., Most, H., Bone, G. Plasmodium berghei: cyclical transmission by experimentally infected Anopheles quadrimachulatus. Science. 144, 1580-1581 (1964).
  14. Landau, I., Boulard, Y. Life cycles and Morphology. , Academic Press. London/New York/San Franciso. (1978).
  15. Vanderbergh, J. P. Y., M, Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei. J Parasitol. 52, 559-564 (1966).
  16. Gadsby, N., Lawrence, R., Carter, R. A study on pathogenicity and mosquito transmission success in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi adami. Int J Parasitol. 39, 347-354 (2009).
  17. Pattaradilokrat, S., Culleton, R. L., Cheesman, S. J., Carter, R. G. ene encoding erythrocyte binding ligand linked to blood stage multiplication rate phenotype in Plasmodium yoelii yoelii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 7161-7166 (2009).
  18. Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. Linkage group selection: towards identifying genes controlling strain specific protective immunity in malaria. PLoS One. 2, e857-e857 (2007).
  19. Mackinnon, M. J., Read, A. F. Genetic Relationships between Parasite Virulence and Transmission in the Rodent Malaria Plasmodium chabaudi. Evolution. 53, 689-703 (1999).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Plasmodium yoelii

مقالات ذات صلة