قياس الأميلويد البكتيرية الناجمة عن العدوى باستخدام مضان ثيوفلافين تي

الملخص

المصدر: Balczon, R., et al. طرق الكشف عن الأميلويدات السامة للخلايا بعد إصابة الخلايا البطانية الرئوية بالزائفة الزنجارية. J. Vis. خبرة. (2018)

يوضح هذا الفيديو بروتوكول تحديد كمية الأميلويدات في المواد الطافية المزرعة من الخلايا البطانية الرئوية المصابة بالبكتيريا الخبيثة ، باستخدام ثيوفلافين تي ، وهي صبغة فلورية ترتبط بهياكل صفيحة بيتا الأميلويد. تشير الزيادة في التألق مقارنة بخط الأساس إلى وجود الأميلويدات في الطافق المزرعة.

البروتوكول

1. تحليل المواد الطافية السامة للخلايا

1. للقيام بمقايسة ثيوفلافين تي (ThT) ، استخدم مضان ThT لتحديد الأميلويدات في المواد الطافية. لهذه القياسات ، استخدم المواد الطافية المعقمة بالفلتر.
   1. قم بإعداد محلول مخزون (50x) من ThT عن طريق تعليق 8 مجم ThT في 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). بعد الخلط ، قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر لإزالة الجسيمات.
   2. للقياسات ، أضف 20 ميكرولتر من مخزون ThT إلى 1 مل من PBS في كوفيت مقياس الطيف الضوئي سعة 1 مل. ضع العينة المخففة في مقياس الطيف الفلوري.
   3. قم بقياس انبعاث التألق الأساسي باستخدام إثارة 425 نانومتر ومسح انبعاث التألق من 450-575 نانومتر بزيادات قدرها 2 نانومتر.
   4. قم بإجراء مسح ضوئي بفاصل زمني باستخدام إثارة 425 نانومتر وانبعاث 482 نانومتر ، مع الحصول على البيانات كل 0.2 ثانية لمدة 60 ثانية.
   5. تقيس أول 20 ثانية من المسح الضوئي بفاصل زمني التألق في الكوفيت الفارغة. في 20 ثانية ، أوقف المسح مؤقتا وأضف 10 ميكرولتر من المادة الطافية المعقمة بالفلتر إلى الكوفيت. امزج الكوفيت عن طريق الانعكاس ثم ضعه مرة أخرى في مقياس الطيف الفلوري.
   6. استأنف الفحص المستند إلى الوقت ، واحصل على آخر 40 ثانية من البيانات.
   7. عند الانتهاء من مسح الفاصل الزمني، قم بإجراء مسح طيف انبعاث مضان نهائي باستخدام إعدادات متطابقة، كما هو مفصل في الخطوة 1.3.

المواد