تبسيط تنقية DNA البلازميد من ثقافات بروكاريوتيك

ملخص

هذا البروتوكول هو بديل فعالة من حيث التكلفة لتوضيح موازية كفاءة وتنقية البلازميد الحمض النووي من E. القولونية الثقافات. عملية المسبق AcroPrep يبدأ مع لوحة lysate توضيح الأمثل فلتر تنقية تليها على ارتفاع صفيحة سعة ملزم الحمض النووي تصفية ملزمة.

الملخص

نحن تصف العملية الكاملة لتصفية AcroPrep المسبق لوحات لمدة 96 بلازميد التحضيرات ، بدءا من ثقافة بدائية وتنتهي مع الحمض النووي عالية النقاء. على أساس متعدد كذلك الترشيح لإزالة lysate البكتيرية وتنقية الحمض النووي ، وهذا الأسلوب يخلق عملية مبسطة لإعداد البلازميد. ويمكن بسهولة لوحات تحتوي على فلتر السيليكا وسائل الاعلام يمكن معالجتها عن طريق الترشيح أو الطرد المركزي للفراغ ينتج كميات ملحوظة من الحمض النووي البلازميد. تحاليل الحمض النووي تحديد كمية تنقية البلازميد هو دائما ذات جودة عالية مع متوسط ​​نسب _260/280 OD 1.97. عموما ، تقدم عوائد البلازميد الحمض النووي أكثر نقاء للتطبيقات المصب ، مثل الاستنساخ وتسلسلها. هذه طريقة مبسطة لاستخدام لوحات AcroPrep تصفية متقدم يسمح للتجهيز الخط ، وشبه الآلي أو مؤتمتة بالكامل.

البروتوكول

1. Lysate التخليص

1. تنمو E. ثقافات القولونية تحولت مع DNA البلازميد المطلوب في بئر عميقة لوحات (1 مل ​​من ثقافة / جيد) في مرق لوريا مع المضادات الحيوية المناسبة ليلا 37 درجة مئوية مع الهز.
2. بيليه كولاي في لوحة الثقافة في 5000 x ج لمدة 10 دقائق ، ثم طاف صب.
3. Resuspend كل بيليه في 100 مخزن إعادة تعليق ميكرولتر (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 10 ملي EDTA ، 100 ميكروغرام / مل ريبونوكلياز A).
4. إضافة 100 مخزن تحلل ميكرولتر / جيد (200 ملي هيدروكسيد الصوديوم ، SDS 1 ٪) ويهز باستخدام لوحة شاكر لمدة 2 دقيقة.
5. إضافة 100 العازلة تحييد ميكرولتر / جيد (3.0 خلات البوتاسيوم م ، ودرجة الحموضة 5.5) ويهز لمدة 2 دقيقة.
6. نقل lysate الخلية لوحة lysate التوضيح.
7. مكان لوحة الحمض النووي ملزمة لأعلى من 350 لوحة جمع ميكرولتر ومكان في الجزء السفلي من مشعب فراغ. مشعب تجميع فراغ (انظر الشكل 1).
8. لوحة توضيح مكان lysate على رأس جهاز فراغ.
9. تطبيق فراغ في 10 بوصة الزئبق (0.34 بار) وجمع الراشح في الحمض النووي لوحة ملزمة. لا تستخدم فراغ أكبر من 12 بوصة من الزئبق. (0.41 بار).
10. تفكيك متعددة فراغ. 2 مل مكان النفايات لوحة جمع في الجزء السفلي من الجهاز.

2. الحمض النووي ملزم

1. نقل لوحة الحمض النووي ملزمة لأعلى متعددة (انظر الشكل 2).
2. إضافة 300 مخزن ميكرولتر / تجليد جيدا (6 M - الجوانيدين حمض الهيدروكلوريك) وماصة صعودا وهبوطا إلى المزيج.
3. تطبيق فراغ [~ 5 بوصة زئبق (0.17 بار) للفراغ بطيئا] وتجاهل الترشيح. الحمض النووي هو الآن منضما إلى الغشاء.
4. يغسل مع 400 ميكرولتر / اغسل جيدا العازلة (80 ٪ إيثانول).
5. تطبيق فراغ ، ثم رفض الترشيح. تجاهل لا لزوم لها في حالة استخدام لوحة جمع 2 مل أو التصفية مباشرة إلى النفايات.
6. تكرار غسل مرة واحدة.
7. لطخة أسفل لوحة تصفية على منشفة ماصة لتجف.
8. تطبيق فراغ مرة أخرى لمدة 5-10 دقائق لضمان إزالة بقايا الكحول.
9. لطخة أسفل لضمان إزالة قطرات الايثانول.

3. شطف الحمض النووي

1. إضافة 70 العازلة شطف ميكرولتر / جيد (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 1 ملم EDTA). إذا كان المطلوب تركيز أعلى الحمض النووي ، يمكن تخفيض حجم إلى 50 ميكرولتر / جيد ، ولكن متوسط ​​العائد الكلي سيكون أقل.
2. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.
3. يمكن تنقية eluted الحمض النووي من قبل أي فراغ أو الطرد المركزي.
4. أسلوب فراغ : ضع لوحة جمع النظيفة (الدناز ، ريبونوكلياز مجانا) في مشعب فراغ. لوحة مكان تصفية على رأس مشعب الفراغ ، فراغ تنطبق على 15 بوصة من الزئبق (0.5 بار) لمدة 1 دقيقة حتى شطف جميع العازلة مرت لوحة الحمض النووي ملزمة. جمع الحمض النووي النقي (انظر الشكل 3).
5. طريقة الطرد المركزي : ضع لوحة تنقية تصفية على أعلى لوحة النظيفة وجمع الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق.

4. الكمي والنوعي تحليلات

1. OD قياس _{260 / 280} ، وحساب تركيز تنقية الحمض النووي.
2. تحليل أداء agarose هلام من pDNA المنقى.

5. ممثل النتائج

كولاي lysate توضيح باستخدام الطرد المركزي التقليدية وبول لوحات lysate مقدما توضيحا AcroPrep تصفية أظهرت انخفاض ملموس من الحطام من بدء المادية. (الشكل 4).

وقد ارتفعت DNA البلازميد في ثلاثة تجمعات في TE العازلة ومرت عبر لوحة مقدما توضيحا AcroPrep lysate التصفية. مقارنة بين تركيز الحمض النووي البلازميد ، قبل وبعد الترشيح ، يظهر الانتعاش ~ 100 ٪ (الشكل 5) على جميع التركيزات الثلاثة.

للتدليل على الانتعاش من الحمض النووي من توضيح E. وقد ارتفعت lysate القولونية ، DNA البلازميد في lysate الخام وأوضحت ثم عن طريق الترشيح. وأضيف على نفس الحمض النووي البلازميد الى خلية lysate الترشيح التالية. تم تنفيذ الكهربائي على aliquots من كل عينة (الشكل 6). واحد ، والفرقة واضحا من كثافة مماثلة من كل عينة يوضح وجدت القليل من فقدان الحمض النووي خلال الخطوة توضيح الترشيح مقرا لها.

ثقافات E. وكانت تحتوي على الحمض النووي المنقى القولونية pCAT البلازميد من E. القولونية lysates به بال ال 350 مل و 1 ميكروليتر DNA لوحات تصفية ملزمة ، فضلا عن اثنين من الماركات الأخرى من 350 لوحات DNA ميكرولتر ملزمة. وأجريت جميع التنقيات على النحو المحدد في بروتوكول الشركة المصنعة الموصى بها. وينظر الى أعلى تركيز الحمض النووي والمحصول الكلي من بول في المقدمة AcroPrep 1 مل صفيحة تصفية تنقية الحمض النووي (الشكل 7 والجدول 2).

على الرغم من أن المنافس W يظهر أيضا ارتفاع تركيز الحمض النووي (155 نانوغرام / ميكرولتر) ، ومجموع العائد الحمض النووي هو أدنى (4.7 ميكروغرام / أيضا) بسبب انخفاض حجم الانتعاش ، ~ 30 ميكرولتر. أعطى M منافس بأقل تركيز الحمض النووي في 108 نانوغرام / ميكرولتر مع تحقيق عائد إجمالي قدره 5.6 ميكروغرام / أيضا.

آغارويظهر تحليل OSE هلام تنقية الحمض النووي pCAT من لوحات مختلفة three الحمض النووي الملزمة في الشكل 8. تم تعديل حجم العينة التي جمعت كل إلى 65 ميكرولتر لتصحيح الاختلافات في حجم الانتعاش قبل الكهربائي. تظهر supercoiled جميع عينات من الحمض النووي البلازميد ، ولكن يختلف العائد من الحمض النووي من كل من لوحات تصفية.

ويبين الشكل 9 DNA أعد كل شيء في شكل supercoiled وتركيز مماثل.

الشكل 1. التجمع من فراغ المنوع استجلاء Lysate.

الشكل 2. التجمع من أجل ربط كهربائية المنوع الحمض النووي.

الشكل 3. التجمع من أجل شطف المنوع فراغ الفراغ.

الشكل 4. الترشيح يبسط توضيح العينة. عينات من ثلاث نسخ من 300 ميكرولتر من lysate الخام عن طريق الترشيح توضيح الفراغ (350 متقدم لوحة AcroPrep ميكرولتر lysate توضيح التصفية) أو الطرد المركزي التقليدي. OD ₃₂₀ قياسها قبل وبعد التوضيح.

الشكل 5. الاسترداد الكامل للpDNA بعد المرور عبر لوحة AcroPrep lysate المسبق تصفية التوضيح. 300 العازلة TE ميكرولتر ارتفعت مع pCAT في 50 و 25 و 100 ميكروغرام / مل. تركيز الحمض النووي والانتعاش المحسوبة من OD ₂₆₀ قبل وبعد الترشيح ، 2 = ن.

الشكل 6. الانتعاش من الحمض النووي pCAT بعد التوضيح. كميات متساوية من pUC19 ارتفعت الى lysate قبل أو بعد التوضيح ، المخفف ثم 1 إلى 10 في TE العازلة. تحميل 2 ميكرولتر / حارة على 1.2 ٪ Agarose هلام.

الشكل 7. ارتفاع العائد DNA البلازميد بشكل جيد مع الحمض النووي لكل بظلالها Acroprep المسبق لوحة من لوحات تصفية ملزمة منافس. pCAT العائد DNA البلازميد (OD ₂₆₀₎ باستخدام لوحات وأشار تنقية الحمض النووي مع 1 مل (بول والمنافس M) أو 1.5 مل (W المنافس) بين عشية وضحاها من الثقافة DH5α. تنقية باستخدام بروتوكول المصنعة للوحة الموصى بها. أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ المعياري (ن> 6).

الشكل 8. Agarose هلام تحليل الحمض النووي pCAT تنقية الحمض النووي على لوحة تشير ملزمة. 1.2 agarose هلام الكهربائي ٪ من pDNA المنقى. تجميع عينات من ثلاث التنقيات منفصلة ، شطافة تعديلها إلى 65 ميكرولتر 1:10 بعد ، وتنقية المخفف. تحميل 2 ميكرولتر لكل حارة.

الرقم 9. الجودة والانتعاش من الحمض النووي محض مماثل عندما تستخدم أجهزة الطرد المركزي أو فراغ أساليب جمع النهائي الكهربائي شطافة agarose هلام من pDNA المنقى. وأعقب البروتوكول أوصت الشركة المصنعة للحصول على سلفة AcroPrep تصفية لوحات لتنقية pDNA. تم تنفيذ شطف بواسطة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق أو 15 بوصة مع فراغ الزئبق (0.5 بار) لمدة 2 دقيقة.

المناقشة

نحن وصف سطحي ، والبروتوكول مبسطة لوحات AcroPrep تصفية مسبقا أن يوفر العديد من المزايا. هذا الأسلوب يوفر أقصى غلة DNA البلازميد ، عندما يتم معالجتها في كتيب ، وشبه الآلي ، أو مؤتمتة بالكامل ، مقدما نماذج AcroPrep. وprefilter متكاملة عن لوحة إزالة lysate يقدم الترشيح ثابت من العينات ، وحتى تلك التي تحتوي على مستويات عالية من الجسيمات. هندسة جيدا لوحة النتائج في أسرع معدلات الترشيح عبر أكثر اتساقا مع حجم اللوحة اجراء متابعة الحد الأدنى ، وهندسة تلميح يوفر منفذا مباشرا لتدفق العينات في لوحة الاستقبال دون مخاوف من تلوث الصليب. الأهم من ذلك ، تم تحسين قدرات عالية غشاء ملزمة في الحمض النووي لوحة ملزمة للتقدم لوحات AcroPrep تصفية لاسترداد الحد الأقصى من الحمض النووي البلازميد ذات جودة عالية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
لوحة ترشيح AcroPrep Advance	شركة Pall	PN 8175 (1 mL) أو PN 8075 (350 µl)	ألياف زجاجية 3 μm وغشاء Supor® بمسامية 0.2 μm للتنقية
لوحة ترشيح AcroPrep Advance	شركة Pall	PN 8132	للارتباط بالحمض النووي DNA
مجمع تفريغ	شركة Pall	PN 5017
مضخة ضغط تفريغ	شركة Pall	PN 13157