تقييم الفتيل الناجم عن المضادات الحيوية في الإشريكية القولونية باستخدام مقايسة الطلاء وقياس التدفق الخلوي

الملخص

المصدر: Cayron ، J. ، و Lesterlin ، C. تحليل متعدد النطاقات لنمو البكتيريا تحت علاجات الإجهاد. J. Vis. خبرة. (2019)

يوضح هذا الفيديو إجراء تقييم الإشريكية القولونية خيوط وتكرار الحمض النووي تحت العلاج بالمضادات الحيوية المثبطة للانقسام الخلوي باستخدام الطلاء لقياس الجدوى وقياس التدفق الخلوي لتحليل حجم الخلية ومحتوى الحمض النووي.

البروتوكول

1. مقايسة الطلاء

ملاحظه: يقيس مقايسة الطلاء تركيز الخلايا القادرة على توليد وحدة تشكيل مستعمرة (CFU) في عينات الاستزراع. يكشف هذا الإجراء عن معدل انقسام خلية واحدة إلى خليتين قابلتين للحياة ويسمح بالكشف عن توقفات انقسام الخلايا (على سبيل المثال ، زيادة وقت توليد البكتيريا لتحلل الخلية).

1. قم بإعداد مخففات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف حتى ^10-7 من 200 ميكرولتر من عينة الاستزراع في وسط جديد. صفيحة 100 ميكرولتر من التخفيف المناسب على صفائح الاغاروز غير الانتقائية Luria-Bertani (LB) للحصول على ما بين 3-300 مستعمرة بعد الحضانة الليلية عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: يجب إجراء التخفيف التسلسلي في وسط طازج بسرعة للحد من الانقسامات البكتيرية. بدلا من ذلك ، قد يفكر الباحثون في استخدام محلول ملحي بدون مصدر كربون لمنع انقسامات الخلايا أثناء عملية التخفيف.
2. في اليوم التالي ، احسب عدد المستعمرات لتحديد تركيز الخلايا القابلة للحياة (CFU / mL) في كل عينة مزرعة. ارسم CFU / مل كدالة للوقت لمزارع الخلايا غير المعالجة والمعالجة.

2. قياس التدفق الخلوي

ملاحظه: يصف القسم التالي تحضير عينات الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي. تكشف تقنية التحليل هذه عن توزيع حجم الخلية ومحتوى الحمض النووي لعدد كبير من الخلايا. عندما يكون ذلك ممكنا ، يوصى بمعالجة عينات قياس التدفق الخلوي على الفور. بدلا من ذلك ، يمكن الاحتفاظ بالعينات على الجليد (لمدة تصل إلى 6 ساعات) وتحليلها في وقت واحد في نهاية اليوم ، بمجرد إجراء الطلاء والتصوير المجهري.

1. قم بتخفيف 250 ميكرولتر من عينة المزرعة للحصول على 250 ميكرولتر بتركيز ~ 15,000 خلية / ميكرولتر (يتوافق مع OD_{600 نانومتر} ~ 0.06) في وسط طازج عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظه: الحضانة على الجليد ستحد من نمو الخلايا وتعديلها المورفولوجي. بدلا من ذلك ، قد يفكر المستخدم في إجراء تثبيت الخلايا في 75٪ من الإيثانول ، كما هو موصى به عادة لقياس التدفق الخلوي.
2. لتلطيخ الحمض النووي ، امزج العينة البكتيرية بمحلول 10 ميكروغرام / مل من صبغة الفلورسنت DNA (نسبة 1: 1) واحتضان في الظلام لمدة 15 دقيقة قبل تحليل العينة.
3. مرر العينة إلى مقياس التدفق الخلوي بمعدل تدفق ~ 120,000 خلية / دقيقة. احصل على ضوء مبعثر إلى الأمام (FSC) وضوء مبعثر جانبي (SSC) بالإضافة إلى إشارة مضان صبغة الفلورسنت DNA (FL-1) بالإعدادات المناسبة.
4. ارسم الرسوم البيانية لكثافة الخلايا FSC و FL-1 لتمثيل توزيع حجم الخلية ومحتوى الحمض النووي في مجموعات الخلايا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الاغاروز	بيوراد	1613100	البيولوجيا الجزيئية المعتمدة الاغاروز
Attune NxT مقياس الخلايا الصوتي التركيز	ثيرموفيشر العلمي	طائفة A24858	مقياس الخلية
بكتريا قولونية سلالة تحمل إدخال كروموسومي لاندماج hupA-mCherry			تم إنشاؤه بواسطة نقل P1 ل hupA-mCherry في الإشريكية القولونية MG1655
متوسط الاغاروز Luria-Broth	MP Biomedicals	3002232	وسط النمو لمقايسة الطلاء
SYTO9 وصمة عار حمض الفلورسنت الأخضر	ثيرموفيشر العلمي	ط34854	صبغة الفلورسنت DNA