نحن تقرير وضع نظام اختيار سلبية في E. نسج استنادا إلى التعبير المعدلة وراثيا من البروتين خيالية (FCU1) والاختيار مع دواء مساعد 5 - فلوروسيتوزين. البروتين FCU1 هي عبارة عن اندماج نازعة أمين السيتوزين الخميرة واليوراسيل ناقلة الفسفوريبوزيل. نتج تعبير عن زيادة في FCU1 E. نسج الحساسية تجاه فلوروسيتوزين - 5.
مقالة منهجية
وضع علامة سلبية لإختيار a المتحولة الحالة للنسج
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
المتحولة الحالة للنسج هو العامل المسبب لداء الأميبات وتصيب ما يصل الى 10 ٪ من سكان العالم. التقنيات الجزيئية التي مكنت من المتابعة وأسفل تنظيم التعبير الجيني الاعتماد على ترنسفكأيشن من البلازميدات حافظت بثبات. في حين أن هذه قد زادت من فهمنا للعوامل الفوعة المتحولة ، والقدرة على الاندماج في جينوم الحمض النووي الخارجية ، الأمر الذي سيسمح عكس التجارب علم الوراثة ، وسيكون ميزة كبيرة في دراسة هذا الطفيلي. التحديات التي يمثلها هذا الكائن الحي وتشمل عدم القدرة على تحديد للأحداث ، وصعوبة إعادة التركيب مماثل لعلاج DNA البلازميد episomal من النواشط transfected. النتائج في وقت لاحق على خلفية عالية من الحمض النووي الخارجية ، وهي مشكلة رئيسية في تحديد النواشط فيه بحسن نية الحدث التكامل الجينومية حدث. نحن تقرير وضع نظام اختيار سلبية على أساس التعبير المعدلة وراثيا من خميرة نازعة أمين السيتوزين واليوراسيل phosphoribosyl ترانسفيراز خيمر (FCU1) مع دواء مساعد واختيار 5 - فلوروسيتوزين (5 - FC). انزيم تحويل FCU1 غير سامة 5 - FC السامة في فلورويوراسيل - 5 و 5 ، 5' - fluorouridine الأدينوزين هاء. تم العثور على خطوط نسج معربا عن FCU1 ليكون 30 أضعاف أكثر حساسية للدواء مساعد مقارنة سلالة السيطرة.
البروتوكول
1. FCU نظام التحديد السلبية في نسج المتحولة
- تم إنشاء خط السيطرة ناقلات (HM1 / pKT3M) والخط التجريبي (HM1/pKT3M-FCU1) من 1،2 التقنيات الموصوفة سابقا. البذور خطوط قيد الدراسة من أنابيب الأسهم إلى T - 25 قوارير والحفاظ على الاختيار عن طريق إضافة المضادات الحيوية المناسبة (12 ميكروغرام / مل G418) في المتوسط 3 TYI - S - 33. والقوارير وينبغي 70-80 ٪ متموجة بعد 16-18 ساعة من النمو بنسبة 37 درجة مئوية.
- اعداد جديدة من محلول المخزون 50mM فلوروسيتوزين - 5 (5 - FC ، سيغما) في المتوسط TYI - S - 33 الدافئة. دوامة بصرامة لعدة دقائق لإذابة 5 - FC تماما. فلتر تعقيم محلول المخزون بتمريرها من خلال 0،22 ميكرون التصفية.
- النواشط الحصاد بوضع القوارير على الجليد لمدة 3-5 دقائق وجمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200xg لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. Resuspend الكرية في المتوسط TYI الطازجة وعدد الخلايا.
- تصميم تجربة نموذجية يستخدم 0.5 X 10 4 خلايا لكل بئر من 48 لوحة بشكل جيد في الحجم النهائي من 1 مل ، وتكرر ثلاث نسخ لكل حالة اختبار. بالإضافة إلى ذلك ، لتسهيل القياسات الفلورسنت ، وتستخدم لوحة منفصلة لكل سلالة في نقطة زمنية.
- البذور 0.5 X 10 4 خلايا في كل اختبار جيد ل5 - FC التركيز ، في ثلاث نسخ. الحفاظ على ضغط اختيار المضادات الحيوية في المتوسط TYI. الآن إضافة المبلغ المطلوب من 5 FC حل الأسهم والنواشط كل بئر.
- احتضان لوحات في حقيبة اللاهوائي عند 37 درجة مئوية.
2. تحديد اختيار الكفاءة
- إعداد 2 ملغ / مل حل الأسهم الخضراء CMFDA تعقب الخلية (Invitrogen) في DMSO. الحل لجعل العمل تمييع المخزون 1000 - أضعاف في المتوسط TYI المصل الحرة.
- إزالة المتوسطة تماما من لوحات واستبدال ثقافة أتروفة مع 150 ميكرولتر CMFDA TYI المصل خالية تحتوي. تستمر الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- إزالة محلول الصبغة من الآبار وقراءة لوحة في مقياس التألق الطيفي Spectramax microplate M2. يجب تعيين الطول الموجي 492 نانومتر في الإثارة وانبعاث مضان قراءة في 517 نانومتر.
- مقارنة القيم مضان للخلايا السيطرة مقابل transfectants الاختبار.
- مواصلة القراءة لوحات في كل فترة زمنية. الاستخدام الإيجابي المناسب (TYI فقط) والسلبية (25 ميكروغرام / مل هيغروميسين) آبار مراقبة في كل لوحة.
3. ممثل النتائج
وهاء وأظهرت transfectants نسج التعبير القوي للFCU1 كودون الأمثل المؤتلف (الشكل 1) ، وعندما يتبع هذا البروتوكول بشكل صحيح النتائج في القضاء الانتقائي للE. معربا عن الخلايا نسج FCU1 في وجود 0.5 مم 5 - فلوروسيتوزين. الخلايا السيطرة ، في المقابل تستمر في النمو عادة ما يصل الى 5 من تركيز ملي FC - 5 والوصول التقاء بين 72 و 96 ساعة (الشكل 2 - A). وlysed تماما الخلايا FCU1 تحمل في 48 ساعة عندما يتم النظر إلى الآبار التي تمت معالجتها تحت المجهر. هذه أيضا تظهر عندما انخفض مضان ملطخة CMFDA صبغ الحيوية التي تستخدم في الدراسات الكمية التي تنطوي على عدد كبير من العينات (الشكل 2 ب). نظام FCU1/5-FC هو أداة فعالة وقوية لاختيار سلبية E. نسج النواشط.
الشكل 1. جيل من E. نسج HM1 transfectants معربا عن اختيار علامة سلبية
(أ) تم الكشف عن بروتين FCU1 المؤتلف وصمة عار على استخدام الألغام المضادة للغرب ج Myc الأضداد (اللوحة العلوية). كما هو متوقع ، يمكن الكشف عن عصابة 42kDa (الذي أبداه سهم) في مجموع lysate من transfectants FCU ولكن ليس في ناقلات وحدها transfectants السيطرة. لوحة أسفل يظهر نفسه لطخة بحث مع الأضداد المضادة أكتين كعنصر تحكم التحميل. (ب) نتائج PCR الوقت الحقيقي يظهر التعبير عن الكمية FCU1 مرنا محددة لتطبيع lgl4 السيطرة.
الشكل 2. الحساسية المخدرات في المختبر من E. transfectants نسج معربا عن اختيار علامة سلبية
منحنيات بقاء transfectants التحكم (أ) و (ب) transfectants FCU1 معربا عن تربيتها في 48 لوحة جيدا. زرعت الخلايا في وجود تركيزات المتزايد للدواء مساعد - 5 - فلوروسيتوزين ؛ كان كميا بقاء الخلية تلطيخ CMFDA في كل فترة زمنية كما تدل على محور X. ويمثل المحور Y - الوحدات ومضان هو انعكاس مباشر للسكان الخلية على قيد الحياة. يرجى ملاحظة أن التعبير عن transfectants FCU1 أظهرت حساسية كبيرة في تركيز دواء مساعد 0.5mM مقارنة السيطرة. ولوحظ وجود خلايا في نقطة زمنية 120h في هذه الآبار وCOMقلص لنمو متموجة ينظر في آبار المراقبة المقابلة تحت المجهر (لا تظهر البيانات). الرطوبة يدل 25μg / مل هيغروميسين يستخدم كعنصر تحكم سلبية.
المناقشة
وإن كانت هناك تقدما ملموسا في مجال البيولوجية الجزيئية الأدوات المتحولة لا توجد طرق الحالية المتاحة لحذف أو تعطيل الجينات 4. أحرز ضربة قاضية للتعبير جين معين عن طريق استخدام دبوس الشعر من RNAs 5 و 6 صغيرة بالتدخل RNA ، وأعرب عن البكتريا الرنا المزدوج الجديلة 7. لكن هذه الأساليب في حين فعالة للجينات الهدف منها ، والعديد من القيود بما في ذلك استخدام المواد الكيميائية مكلفة ، واختيار المستمرة ضد المضادات الحيوية وضرورة التحقق من صحة مستمر بسبب ارتفاع معدل حدوث انعكاس على مر الزمن (أليسيا ينفورد ، اتصال شخصي) 8.
يمكن لأي البلازميد في تكرار المتحولة كما أن هناك على ما يبدو ليس شرطا التسلسل الدقيق لأصول تكرار الحمض النووي 9 ، ومرة واحدة حتى transfected ، فإنه عادة ما يكون من الصعب علاج البلازميد. وهذا يحد من إمكانية استخدام البلازميدات سليمة في التجارب خروج المغلوب وإعادة التركيب الجيني. علامات التحديد السلبي هي المكونات الرئيسية لاستهداف الجينات والأساليب التي يمكن استخدامها للقضاء على المجموعات السكانية الفرعية المترابطة. أعربنا عنها بنجاح كودون الأمثل FCU1 الجينات المتحولة في نسج واختبار قدرته على اختيار علامة a سلبية. وقد استخدم هذا الانصهار الجين للعلاج بالجينات انتحار الخلايا السرطانية البشرية والتمثيل الغذائي للدواء مساعد 5 - FC في المنتجات السامة الناتجة المصب في تثبيط تخليق الحمض النووي الريبي و10. وقد استخدمت مؤخرا في FCU1 a علامة سلبية في اختيار المتصورة ، وآخر طفيلي ، وتم العثور على الخلايا المنجلية berghei FCU1 معربا عن أن ما يقرب من 1000 مرات أكثر حساسية للدواء مساعد في المختبر والمجراة في المعاملة مع نادي - 5 عن مقتل أكثر من 99،9 ٪ من اصابة الطفيليات المؤتلف في نموذج الفأر الكريات الحمر في المرحلة 11 من الملاريا. E. وأظهرت الخلايا نسج FCU1 فقط التعبير عن حساسية 30 ضعفا متزايدا لدواء مساعد 5 - FC على النقيض من الحساسية التي لوحظت في P. berghei. يمكن أن الأسباب المحتملة لهذا الأمر مجموعة كبيرة من النيوكليوتيدات المتاحة في وسط النمو تتنافس مع الأيضات السامة.
في كلا P. وberghei P. وقد استخدمت علامة FCU1 المنجلية في تعطيل الجينات المستهدفة. دراسات 11،12. ونحن نهدف إلى التلاعب في الجينات المتحولة باستخدام إعادة التركيب مثلي. المصادقة على نظام اختيار السلبية FCU1/5-FC يعد خطوة هامة نحو تحقيق هذا الهدف.
الإفصاحات
وقد رعت إنتاج هذا الفيديو من قبل الدريتش سيغما ، المؤتمر الوطني العراقي ، والتي تنتج بعض الكواشف المستخدمة في هذه المقالة.
شكر وتقدير
نود أن نشكر الدكتور فيليب Erbs لتزويدنا تسلسل FCU1 الجينات. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح منظمة العفو الدولية 26649.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| وسط TYI-S-33 | ATCC | مرجع مدرج في النص | |
| <أداة الربط التشعبي (href)"http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=F7129%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">5-فلوروسيتوزين | Sigma-Aldrich | F7129 | |
| متتبع الخلايا الأخضر CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
| قارئ الأطباق Spectra Max M2 | Molecular Devices |
المراجع
- Olvera, A. Stable transfection of Entamoeba histolytica trophozoites by lipofection. Arch. Med. Res. , 49-51 (1997).
- Saito-Nakano, Y., Yasuda, T., Nakada-Tsukui, K., Leippe, M., Nozaki, T. Rab5-associated vacuoles play a unique role in phagocytosis of the enteric protozoan parasite Entamoeba histolytica. J. Biol. Chem. 279, 49497-49507 (2004).
- Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 72, 431-432 (1978).
- Clark, C. Anaerobic parasitic protozoa : genomics and molecular biology. , Caister Academic. Norfolk UK. (2010).
- Linford, A. S. Short hairpin RNA-mediated knockdown of protein expression in Entamoeba histolytica. BMC Microbiol. 9, 38-38 (2009).
- Solis, C. F., Guillén, N. Silencing genes by RNA interference in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. Methods Mol. Biol. 442, 113-128 (2008).
- Solis, C. F., Santi-Rocca, J., Perdomo, D., Weber, C., Guillén, N. Use of bacterially expressed dsRNA to downregulate Entamoeba histolytica gene expression. PLoS ONE. 4, e8424-e8424 (2009).
- MacFarlane, R. C., Singh, U. Loss of dsRNA-based gene silencing in Entamoeba histolytica: implications for approaches to genetic analysis. Exp. Parasitol. 119, 296-300 (2008).
- Dhar, S. K., Vines, R. R., Bhattacharya, S., Petri, W. A. Ribosomal DNA fragments enhance the stability of transfected DNA in Entamoeba histolytica. J. Eukaryot. Microbiol. 45, 656-660 (1998).
- Erbs, P. In vivo cancer gene therapy by adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase fusion gene. Cancer Res. 60, 3813-3822 (2000).
- Braks, J. A. M., Franke-Fayard, B., Kroeze, H., Janse, C. J., Waters, A. P. Development and application of a positive-negative selectable marker system for use in reverse genetics in Plasmodium. Nucleic Acids Res. 34, e39-e39 (2006).
- Maier, A. G., Braks, J. A. M., Waters, A. P., Cowman, A. F. Negative selection using yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyl transferase in Plasmodium falciparum for targeted gene deletion by double crossover recombination. Mol. Biochem. Parasitol. 150, 118-121 (2006).
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
