التطور التكيفي للبكتيريا باستخدام نظام زراعة القطرات الدقيقة الميكروبية

Abstract

المصدر: جيان ، إكس ، وآخرون ، الزراعة الميكروبية الآلية والتطور التكيفي باستخدام نظام زراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC). J. Vis. خبرة. (2022).

يوضح هذا الفيديو استخدام نظام زراعة القطرات الدقيقة الميكروبية لدفع التطور التكيفي للبكتيريا نحو تحمل الميثانول. من خلال خلط المزارع البكتيرية المصممة هندسيا مع وسط إجهاد الميثانول العالي وتقسيمها إلى قطرات دقيقة ، يختار النظام الطفرات التي تظهر نموا محسنا تحت إجهاد الميثانول. من خلال دورات التخصيب التكراري وعزل المستعمرة ، يتم استزراع السلالات البكتيرية المتكيفة مع الميثانول لمزيد من التحليل أو التطبيق.

Protocol

التطور التكيفي في MMC

1. التحضير للمحلول البكتيري الأولي
   1. اتبع اللوائح القياسية ذات الصلة لتحضير الألواح السائلة المتوسطة والصلبة الخاصة ل MeSV2.2 والأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
   2. قم بزراعة MeSV2.2 باستخدام الصفيحة الصلبة (القطر = 90 مم) في حاضنة بدرجة حرارة ثابتة 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. بعد ذلك ، اختر مستعمرة مستقلة وزرعها في قارورة مخفوقة سعة 50 مل مع 10 مل من الوسط السائل الخاص في حاضنة اهتزاز (200 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
   3. قم بتخفيف محلول MeSV2.2 المزروع بالوسط إلى OD₆₀₀ من 0.1-0.2 (تأكد من أن الحجم الإجمالي لا يقل عن 10 مل) واستمر في زراعته في قارورة المخفوق لمدة 5 ساعات للحصول على محلول البكتيريا الأولي.
      ملاحظه: MeSV2.2 هو سلالة بكتريا قولونية أساسية للميثانول. يحتوي الوسط السائل الخاص على 500 مليمول / لتر من الميثانول ، وهو ضغط قوي ل MeSV2.2 ، مما يؤدي إلى نمو بطيء للغاية.
2. قم بتهيئة MMC.
3. أخرج زجاجتين من الكاشف المعقم ، إحداهما لمحلول البكتيريا الأولي والأخرى للوسط الطازج. حقن محلول البكتيريا الأولي (5 مل) ، والوسط الطازج (12-15 مل) ، وزيت MMC في زجاجات الكاشف.
   ملاحظه: نظرا لأن التطور التكيفي هو عملية طويلة الأجل تتضمن العديد من المزارع الفرعية ، فقم بتخزين أكبر قدر ممكن من الوسط الطازج في MMC. لا يمكن تجديد الوسيط أثناء التجربة.
4. قم بتركيب زجاجتي الكاشف في MMC. قم بتثبيت أحدهما لمحلول البكتيريا الأولي بين موصل C2 و O2 والآخر للوسط الجديد بين موصل C4 و O4.
5. انقر فوق ALE لاختيار وظيفة التطور التكيفي (الشكل 1 ب). في واجهة إعداد المعلمة، قم بتشغيل مفتاح اكتشاف OD.

6. اضبط الرقم على 50 ، والطول الموجي على أنه 600 نانومتر ، والتركيز على أنه 0٪ ، والنوع كوقت ، والمعلمة على أنها 30 ساعة ، والتكرار على أنه 99. انقر فوق ابدأ لبدء توليد القطرات. سيستغرق حوالي 25 دقيقة.
   ملاحظه: هنا ، يشير "التركيز" إلى الحد الأقصى لتركيز العوامل الكيميائية للتطور التكيفي. بالنسبة للقطرات المختلفة ، يمكن تحقيق إدخال تركيزات مختلفة من العوامل الكيميائية في MMC لتوفير ظروف نمو مختلفة. احسب التركيزات المقدمة باستخدام المعادلة التالية:

   

   هنا ، يشير "C" إلى تركيز العوامل الكيميائية التي يتم إدخالها في القطرات. يشير "أ" إلى تركيز العوامل الكيميائية في زجاجات الكاشف بين موصل C4 و O4 ؛ يشير الحرف "ب" إلى تركيز العوامل الكيميائية في زجاجات الكاشف بين الموصل C6 و O6 ؛ ويشير "i" إلى التركيز المتاح. هناك ثمانية تركيزات متوفرة في MMC. نظرا لأن العامل الكيميائي هنا يحتوي على تركيز واحد (500 مليمول / لتر ميثانول) وهو أحد مكونات الوسط ، يتم تثبيت زجاجة كاشف واحدة فقط تحتوي على العامل الكيميائي هنا ، ويتم ضبط التركيز على أنه 0٪. يشير النوع إلى وضع الزراعة الفرعية ، والذي ينقسم إلى ثلاثة أنواع: وضع الوقت ، ووضع قيمة OD ، ووضع التألق. الأول يعني زراعة القطرات لفترة محددة ثم الزراعة الفرعية ، بينما يعني الأخيران زراعة القطرات إلى قيمة OD محددة مسبقا / شدة التألق ثم الزراعة الفرعية. تشير المعلمة إلى المعلمة ذات الصلة المطلوبة عند اختيار طريقة الزراعة الفرعية. تشير التكرارات إلى عدد المزارع الفرعية.

7. قم بإزالة زجاجة الكاشف الموضوعة بين موصلات C2 و O2.
8. لاحظ ما إذا كانت القيم القصوى للتنمية التشغيلية للقطرات خلال كل فترة زراعة فرعية قد زادت بشكل كبير. إذا حدثت الزيادة واستوفت متطلبات التجربة ، فانقر فوق الزر تصدير البيانات لتصدير بيانات OD.
   ملاحظة: هنا ، تعتمد فترة الزراعة الفرعية على المعلمة. على سبيل المثال ، عند تعيين النوع كوقت والمعلمة على أنها 30 ساعة ، تكون فترة الزراعة الفرعية 30 ساعة. خلال كل فترة زراعة فرعية ، هناك حد أقصى لقيم OD للقطرات. تقدير ما إذا كان التطور التكيفي يلبي متطلبات التجربة من خلال زيادة القيم القصوى للتنمية التشغيلية (تعتمد الزيادة على عملية الزراعة الفعلية للسلالة ، على سبيل المثال ، زيادة بأكثر من 20٪). تنبيه: انتبه إلى ما إذا كان الوسط الطازج المخزن قد استنفد. إذا لم تحدث الزيادة الكبيرة حتى بعد استنفاد الوسيط ، فقم باستخراج القطرات الأفضل نموا وقم بإجراء جولة جديدة من التطور التكيفي.
9. استخرج القطرات المستهدفة من MMC.
   1. انقر فوق الزر "الفرز" لاختيار وظيفة استخراج القطرات (الشكل 1 ج). اختر خيار التجميع ، وانقر فوق عدد القطرات المستهدفة ، ثم انقر فوق موافق.
      ملاحظه: يتضمن فحص القطرات "جمع" و "تجاهل" و "استخراج محلول البذور". "محلول استخراج البذور" يعني جمع القطرات المتبقية بعد عملية الزراعة الفرعية.
   2. انتظر حتى تطلب النافذة المنبثقة ، "يرجى سحب الموصل السريع CF ووضعه في أنبوب EP". ضع الموصل السريع CF في أنبوب جهاز الطرد المركزي الدقيق لتجميعه وفقا لموجه البرنامج ثم انقر فوق موافق (الشكل 2D).
   3. بعد 1-2 دقيقة ، ستظهر واجهة البرنامج نافذة جديدة تطالب ، "يرجى إدخال الموصل مرة أخرى والنقر فوق "موافق" إذا انتهي". بعد ذلك ، أدخل الموصل السريع CF مرة أخرى وانقر فوق موافق لجعل MMC يستمر في العمل (الشكل 2D).
      ملاحظه: بعد جمع جميع القطرات المستهدفة ، سيستمر MMC في زراعة القطرات المتبقية. إذا لم تكن الزراعة ضرورية ، فانقر فوق إيقاف لإنهاء العملية مباشرة.
   4. استخرج القطرة باستخدام ماصة 2.5 ميكرولتر ، وقم بإسقاطها على صفيحة الاغاروز مقاس 90 مم ، وافردها بالتساوي باستخدام قضيب توزيع زجاجي مثلث بطول جانبي يبلغ 3 سم. ثم قم بزراعته في حاضنة بدرجة حرارة ثابتة 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
   5. اختر 3-5 مستعمرات مستقلة وزرعها بشكل منفصل في قوارير مخفوقة سعة 50 مل مع 10 مل من الوسط الطازج في حاضنة اهتزاز (200 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 48-72 ساعة. اتبع اللوائح القياسية ذات الصلة لتخزين محلول البكتيريا المستنبت في أنبوب الجلسرين للتجارب اللاحقة.

Results

الشكل 1: واجهة برنامج التشغيل ل MMC. (أ) الواجهة الرئيسية للبرنامج. (1) درجة الحرارة في غرفة العملية. (2) قيمة الإشارة الكهروضوئية للتعرف على القطرات. عندما تمر القطرة ، تكون قيمة الإشارة عالية (>2 فولت). عندما يمر ا...

Materials