تحضير صفيحة ميكروفلويدية تحتوي على خلايا بكتيرية

الملخص

المصدر: سوتليف، أ. ل.، وآخرون. تحليل الخلايا الحية لإجهاد القص على Pseudomonas aeruginosa باستخدام نظام ميكروفلويديك آلي عالي الإنتاجية. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو تحضير صفيحة ميكروفلويدية لدراسات إجهاد القص في المزارع البكتيرية. بعد تمهيد القنوات بالوسط، تدخل الخلايا البكتيرية إلى القناة التجريبية وتحضنها للثبيت. تزال الوسائط المتبقية والثقافة لتحضير النظام لتجارب إجهاد القص اللاحقة.

البروتوكول

1. التحضير الإعلامي

1. حضر وسط بسيط (MM) يحتوي على نسبة جلوكوز 0.25٪. لإنتاج 1 لتر من MM مع 0.25٪ جلوكوز، أضف 200 مل من محلول ملح M9 المعقم، و2 مل من كبريتات المغنيسيوم المعقمة 1 M (MgSO₄)، و100 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم المعقم 1 M (CaCl₂)، و12.5 مل من جلوكوز معقم بنسبة 20٪ (مع حجم/ضج) إلى ماء (dH₂O) عند حجم نهائي 1 لتر.
2. نقل الوسائط المطلوبة إلى زجاجة معقمة باستخدام تقنيات التعقيم. جهز الكمية المطلوبة حسب عدد القنوات المستخدمة. عادة، تتطلب كل قناة 200 ميكرولتر للتحضير، و300 ميكرولتر للبذر، و1300 ميكرولتر لتجربة 24 ساعة.
3. ضع الزجاجة في حاضنة أو حمام ماء مضبوطة على درجة الحرارة التجريبية. يجب أن يكون الوسط في درجة حرارة التجربة قبل الاستخدام لتجنب تكون الفقاعات في القنوات الدقيقة.

2. تحضير زراعة ليلية وتجريبية لسلالة Pseudomonas aeruginosa PA01 التي تعبر عن بروتين فلوري أخضر معزز (PA01-EGFP).

1. ضع 15 مل من الوسائط التجريبية في قارورة معقمة من السلاح الجانبي وقم بتلقيح بمستعمرة أو اثنتين من صفيحة أجار مخططة ب PA01-EGFP. وسع الزراعة لمدة 12-16 ساعة على طاولة الحاضنة/الهزاز عند 37 درجة مئوية و180-220 دورة في الدقيقة.
2. قس جرعة_{الجرعة الزائدة 600} من الزراعة الليلية. عندما يكون OD₆₀₀ أكبر من 0.80، قم بتخفيف الزراعة الليلية إلى OD نهائي 0.8 باستخدام MM طازج. ضع الزراعة التجريبية في حاضنة أو حمام ماء عند 37 درجة مئوية حتى الحاجة لزرع قنوات الميكروفلويد. تحقق من OD₆₀₀ مرة أخرى قبل الزرع مباشرة للتأكد من أنه لم يتغير بشكل كبير عن هدف_{OD 600}، وهو 0.8 في هذه الحالة.

3. بدء تشغيل المعدات

1. قم بإعداد محطة النظام وفقا لدليل المستخدم، مشابها للإعداد في الشكل 1. لتجنب حدوث خطأ في توصيل الجهاز بالبرنامج، قم بتشغيل الجهاز بالترتيب التالي:
   محطة عمل الحاسوب الشخصي
   وحدة الفلورة. تأكد من أن الغالق الفلوري مفعل (الضوء الأزرق بجانب زر الغالق مفعل)
   وحدات التحكم المادية
   متحكم نظام التصوير (انظر جدول المواد)
   كاميرا CCD
   محطة التصوير (المجهر)
   ملاحظة: يجب تعديل درجة حرارة اللوح المسخن لتناسب درجة الحرارة التجريبية المطلوبة.
2. ابدأ تطبيق التحكم وأدخل رقم اللوحة الموجود على الملصق على جانب اللوحة.
   ملاحظة: بعد بدء تطبيق التحكم، سيكون هناك نافذتان منفصلتان للتطبيق، واحدة للبرنامج الذي يتحكم في مجهر/برنامج التصوير والأخرى لوحدة التحكم التي تتحكم في المضخة وواجهة لوحة البئر.

4. تمهيد وزرع صفيحة الميكروفلويديك

ملاحظة: يتم توضيح عملية التمهيد، والبذر، والارتباط بالبكتيريا، والنمو في الشكل 2.

1. قم بإزالة لوحة الميكروفلويديك ذات 48 بئر من العبوة مع التأكد من عدم لمس سطح الزجاج في أسفل اللوحة. نظف شريحة الزجاج في أسفل اللوحة جيدا باستخدام منديل عدسة، أو قطعة قماش خالية من الوبر، أو مناديل منخفضة الوبر.
2. لتحضير قنوات الميكروفلويد، قم بإخراج الماصة بسعة 200 ميكرولتر بدرجة حرارة 37 درجة مئوية في بئر الإخراج، مع الحذر من تجنب الفقاعات. ضع اللوح في مرحلة اللوحة وامسح الواجهة بالإيثانول لتجف، قبل إغلاقها على مرحلة اللوحة.
3. في الوضع اليدوي على وحدة التحكم، قم بتعيين السائل ك
   لوريا-بيرتاني (LB) عند 37 درجة مئوية وقص أقصى عند 5.00 داين/سم^مربع. انقر على آبار الإخراج لتفعيل التدفق من المخرج إلى بئر الإدخال، مع تجهيز القنوات. بعد التحضير لمدة 5 دقائق، أوقف التدفق للتحضير للبذر. قم بإزالة اللوح بعناية من وسط المسرح وبقايا الماصة من المخرج، لكن لا تزيل أي من الوسط من الدائرة الداخلية المؤدية إلى قنوات الميكروفلويد.
4. لزرع القنوات التجريبية، يتم أولا بإخراج 300 ميكرولتر من MM في بئر المدخل، ثم يتم توصيل 300 ميكرولتر من الزراعة البكتيرية إلى البئر الخارجي. أعد اللوح إلى مرحلة اللوحة، مع التأكد من مسح الواجهة قبل وضعها على اللوحة.
5. في وحدة التحكم، ركز على قناة واحدة باستخدام بث الكاميرا الحية بعد وضع مرحلة اللوحة على مرحلة المجهر. أثناء المراقبة البصرية عبر البث المباشر، يستأنف التدفق بسرعة 1.00-2.00 داين/سم^مربع لمدة تقارب 2-4 ثوان للسماح للخلايا بالدخول إلى القناة التجريبية، ولكن ليس في قنوات السيربنتين. اترك اللوح على المرحلة المحكومة بدرجة الحرارة لمدة ساعة واحدة للسماح بتثبيت الخلايا. خلال فترة الحضانة التي تستغرق ساعة واحدة، يمكن إعداد وحدة التحكم وبرنامج المونتاج للتشغيل التلقائي.
   ملاحظة: مدة الزراعة تختلف حسب الوسط والكائنات الحية، لذا يجب مراقبتها عن كثب من قبل البث الحي حتى يتم تحسينها واستخدامها كإطار زمني عام. قد يختلف الزرع في جميع أنحاء الطبق، مما يتطلب وقتا أطول للتدفق المطبق إلى أعمدة معينة من القنوات للبذر الكامل.
6. بعد فترة التوصيل، قم بإزالة اللوح بلطف من المرحلة وقم بعمل ماصة على البكتيريا من المخرجات أولا، لتجنب إزعاج القناة. مع رأس ماصة جديد، أزل الوسائط من آبار الإدخال.

النتائج

الشكل 1: المكونات الفردية لنظام الميكروفلويد. المكونات الفردية مدرجة من اليسار إلى اليمين: 1. كاميرا CCD، 2. مجهر مقلوب عالي الدقة مع مرحلة آلية، وحدة فلورية آلية، ووحدة تركيز تلقائي، 3. مرحلة اللوحة، 4: واجهة نظام التصوير، 5: التحكم اليدوي...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
كلوريد الأمونيوم، ACS	VWR	BDH9208-500G	جزء من التكوين الوسيط الأدنى
BioFlux 1000 48 بئر صفيحة قص منخفضة	فلوكسيون بيوساينسز	910-0047
نظام التصوير الميكروفلويديك BioFlux 1000Z	فلوكسيون بيوساينسز	بي إف 1000Z
ثنائي هيدريد كلوريد الكالسيوم، درجة ACD	VWR	97061-904	جزء من التكوين الوسيط الأدنى
ديكستروز، لامائية، ACS	VWR	BDH9230-500G	جزء من التكوين الوسيط الأدنى
درجة ACS لكبريتات المغنيسيوم	VWR	EM-MX0070-1	جزء من التكوين الوسيط الأدنى
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة، درجة ACS	VWR	BDH9268-500G	جزء من التكوين الوسيط الأدنى
سودوموناس أورجينوزا GFP	ATCC	15692GFP	سلالة بكتيري Pseudomonas aeurinosa PA01 مع تعديل GFP المستخدمة في هذه الدراسة.
كلوريد الصوديوم، ACS	VWR	BDH9286-500G	جزء من التكوين الوسيط الأدنى
فوسفات الصوديوم، أحادي القاعدة، اللامائي، درجة كاشف	VWR	97061-942	جزء من التكوين الوسيط الأدنى