$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. تحضير صفائح وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) لاختبار تأثيرات البكتيريا المختلفة على نفاذية الأمعاء لمرض Caenorhabditis elegans (C. elegans)
- ضع 1.25 جرام من البيبتون، 1.5 جرام من NaCl، 8.5 جرام من الأجار، محرك مغناطيسي، و487.5 مل من الماء المقطر في زجاجة زجاجية بسعة 500 مل.
- اخلط الخليط جيدا، ثم استخدم المعقم لمدة 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية، ثم برد الخليط إلى 55 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 30 دقيقة.
- أزل الوسط من حمام الماء، وأضيف المكونات (0.5 مل من 1 M CaCl2، 0.5 مل من الكوليسترول، 0.5 مل من MgSO4، 12.5 مل من KPO4) إلى NGM، وامزج جيدا.
ملاحظة: يجب أن يتم تعقيم جميع المكونات الفردية باستثناء الكوليسترول (المذاب في الإيثانول المطلق)، ويجب تنفيذ كل خطوة تجريبية على طاولة نظيفة. - وزع 20 مل من الغاز الطبيعي على كل طبق بتري بحجم 90 × 15 مم ودع الأجار يتصلب على طاولة نظيفة في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20 درجة مئوية). يمكن تخزين ألواح NGM لمدة تصل إلى شهر واحد عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. تم تجهيز ألواح NGM المستخدمة في تلوين FITC-dextran (فلوريسين إيزوثيوسيانات-ديكسترون). تم توزيع 10 مل من الغاز الطبيعي على كل طبق بتري بحجم 60 × 15 مم وتركه ليتصلب على طاولة نظيفة في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20 درجة مئوية). - قم بإزالة الزراعة البكتيرية من ثلاجة بدرجة 4 درجات مئوية وقم بتدوير الثقافة جيدا قبل نشرها على ألواح NGM.
- أضف ما مجموعه 800 ميكرولتر من الزراعة البكتيرية إلى كل صفيحة NGM طازجة، ودع الصفائح تجف في حاضنة بدرجة حرارة 20 درجة مئوية طوال الليل.
ملاحظة: في التجربة الأولى (الشكل 1)، تم إعداد لوحين من NGM مع E. coli OP50، ولوحة NGM واحدة تحتوي على P. aeruginosa PAO1، ولوح NGM واحد يحتوي على KCTC3206 E. faecalis . في التجربة الثانية (الشكل 2)، تم تجهيز لوحين من NGM مع E. coli حي OP50، ولوحة NGM حية مع P. aeruginosa PAO1 الحي، ولوحة NGM واحدة مع P. aeruginosa PAO1 المثيل بالحرارة.
3. تحضير C. elegans المتزامنة مع العمر
- ازرع الديدان على صفيحة NGM صلبة وأطعمها بالإشريكية القولونية OP50 حتى يتم الوصول إلى العدد المطلوب.
- قم بمزامنة البيض باستخدام طريقة وضع البيض بالوقت أو علاج محلول التبييض
4. علاج البكتيريا وتغذية FITC-dextran
- حضن البيض المتزامن مع العمر عند 20 درجة مئوية لمدة 64 ساعة على أطباق NGM مع تغذية كطقم حي من الإشريكية القولونية OP50.
- اغسل يرقات L4 المتزامنة مع العمر باستخدام مخزن S وانقلها (أكثر من حوالي 500 دودة) إلى صفائح NGM المعالجة التي تحتوي على بكتيريا ومواد كيميائية مختلفة. حضنها على حرارة 20 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
ملاحظة: يمكن أن يتراوح وقت العلاج بين 24 إلى 72 ساعة، حسب البكتيريا والمواد الكيميائية المستخدمة. يمكن أيضا تقييم التأثير العلاجي أو الوقائي للديدان بمسببات الأمراض مسبقا ثم علاجها ب DIM (التأثير العلاجي) أو عن طريق معالجة الديدان مسبقا ب DIM ثم العلاج بمسببات الأمراض (التأثير الوقائي). - لتحضير الألواح المدعمة ب FITC-dextran، اخلط 2 مل من E. coli OP50 المعطل بالحرارة مع 4 ملغ من FITC-dextran. ثم قسم 100 ميكرولتر من خليط FITC-dextran وE. coli OP50 إلى عشرين لوح أجار NGM طازج (60 مم × 15 مم) واترك الألواح تجف لمدة ساعة واحدة على طاولة نظيفة.
ملاحظة: التركيز النهائي ل FITC-dextran في كل لوحة NGM سيكون 20 ميكروغرام/مل. - جهز خمس ألواح NGM تحتوي على الإشريكية القولونية OP50 بدون FITC-dextran لعلاج التحكم في المركبة. لهذا الغرض، قسم 100 ميكرولتر من إشريكية قولون OP50 معطلة بالحرارة على كل لوح أجار NGM طازج (60 مم × 15 مم) واترك الألواح تجف لمدة ساعة واحدة على طاولة نظيفة.
ملاحظة: لكل تجربة مستقلة، يلزم وجود خمسة عشر لوحة NGM مكملة ب FITC dextran وخمسة ألواح NGM بدون FITC-dextran. - بعد 48 ساعة من المعالجة (من الخطوة 7.2)، غسل الديدان بمحلول S-buffer، وانقل الديدان إلى الألواح المكملة في FITC-dextran وإلى صفائح NGM بدون FITC-dextran، وحضن الألواح طوال الليل (14–15 ساعة).
ملاحظة: لكل مجموعة علاج، يلزم استخدام 5 نسخ من تلوين FITC-dextran (أو تغذية التحكم في المركبة). - اغسل الديدان باستخدام محلول S واتركها تزحف في طبق الأجار الطازج من NGM لمدة ساعة.
ملاحظة: لكل تجربة مستقلة، هناك حاجة إلى ما مجموعه 20 لوحة NGM طازجة. في هذه الخطوة، يمكنك استخدام صفيحة NGM مع أو بدون إشريكية قولون OP50. - أضف 50 ميكرولتر من محلول الفورمالديهايد 4٪ إلى كل بئر من صفيحة سوداء ذات 96 بئر مسطحة القاع. انقل حوالي 50 دودة من كل صفيحة NGM إلى كل بئر لقياس الفلورة. بعد دقيقة إلى دقيقتين، أزل كل الفورمالديهايد من كل بئر وأضف 100 ميكرولتر من وسط التثبيت لتغطية الآبار.
ملاحظة: يستخدم محلول الفورمالديهايد (4٪) لتثبيت وتثبيت الديدان. لكل مجموعة معالجة، تستخدم 5 آبار (5 نسخ) لتحليل الصور.
5. تصوير C. elegans باستخدام نظام تصوير الأوبريتا وتحديد نفاذية الأمعاء بقياس امتصاص الفلورة FITC-dextran
ملاحظة: يمكن استخدام المجهر الفلوري المجسم لتحليل الصور بدلا من نظام الأوبريتا.
- التقاط صور الفلورة وقياس شدتها باستخدام نظام التصوير عالي المحتوى من أوبريتا وتحليل الصور باستخدام برنامج هارموني.
- في برنامج Harmony، اضغط على أيقونة فتح الغطاء لفتح الغطاء ولوضع اللوحة في الجهاز.
- حدد المعايير.
- انقر على الإعداد، واختر نوع اللوحة (96 بئر كورنينغ مسطح-قاع)، وأضف القنوات (قنوات المجال الساطع وقنوات EGFP).
- عدل التخطيط. اذهب إلى اختيار التخطيط، ثم اختر التتبع وضبط المعلمات (الصورة الأولى على 1 ميكرومتر، عدد المستويات 10، المسافة 1 ميكرومتر).
- اختر أحد آبار المعالجة وحقل التقاط واحد واضغط على اختبار للتحقق مما إذا كانت الصور مرضية في قسم تجربة التشغيل .
- إذا كانت الصور مرضية، عد إلى قسم الإعداد واضغط على أيقونة إعادة الضبط في نهاية الشاشة. ثم اختر جميع الآبار المستهدفة وعدد مناسب من حقول الالتقاط.
- اذهب إلى تشغيل التجربة مرة أخرى وأدخل اسم اللوحة، ثم اضغط على بدء لبدء المعالجة.
- لقياس شدة الفلورة، اذهب إلى قسم تحليل الصور وأدخل الصورة. اكتشف الخلية باختيار قناة EGFP (بروتين فلوري أخضر معزز) والطريقة B. اضبط العتبة المشتركة إلى 0.5، والمساحة إلى >200 ميكرومترمربع، وعامل الانقسام إلى 3.0، والعتبة الفردية إلى 0.18، والتباين إلى أكثر من 0.18. ثم احسب خصائص الشدة واختر المتوسط كالمخرج. اضغط على أيقونة التطبيق لحفظ الإعداد.
- اذهب إلى قسم التقييم لقياس الشدة من خلال الحصول على خريطة حرارية وجدول بيانات. اضبط معامل القراءة إلى الخلايا — متوسط الشدة EGFP للخلية — متوسط لكل بئر وابدأ التقييم.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. - لاستخراج البيانات من أوبريتا، اضغط على زر الإعداد واختر إدارة البيانات.
- اختر كتابة أرشيف، ثم افتح التصفح واختر الملف.
- لاختيار الملف، اضغط على إشارة صغيرة + في الزاوية اليسرى، ثم اضغط على القياس واختر اسم اللوحة.
- اختر الملف واضغط موافق.
- اختر المسار لحفظ الملف بالنقر على إشارة التصفح في المسار النشط.
- انقر على Start لحفظ ملف البيانات.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
