تقييم دور مناعة المضيف في عدوى الفطر باستخدام نموذج سمك الزرد

الملخص

المصدر: لوكينن، ه. وآخرون. نمذجة السل في فطريات الزرد البالغة المصابة بفطر الزرد. J. Vis. Exp. (2018).

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بنماذج الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية المحلية ومجلس مراجعة الطب البيطري في JoVE.

1. عدوى M. marinum التجريبية مع الحقن داخل الصفاق

1. قم بطباعة قطرة 5 ميكرولتر من محلول البكتيريا المخفف على قطعة من فيلم بارافيلم واسحب القطرة إلى إبرة أنسولين بسعة 30 جالون.
2. استخدم أسماك البرية من النوع البري والأسماك الطفرية rag1−/−hu1999 للتجربة. قم بتخدير سمك الزرد البالغ في مياه الحوض باستخدام إستر إيثيل بحمض 3-أمينوبنزويك بنسبة 0.02٪ (درجة الحموضة 7.0). ضع الجانب البطني للأعلى في شق على بلاستيك رطب من الرغوة.
   ملاحظة: أسماك الراغ-/- المتحولة لا تستطيع إجراء إعادة تركيب جسدي وتنتج خلايا T وB وظيفية.
3. حقن الإبرة بين زعانف الحوض بزاوية تقارب 45°. حافظ على فتحة الإبرة للأعلى لتلاحظ أن الفتحة بالكامل داخل تجويف البطن. حقن التعليق البكتيري ببطء وقم بإزالة الإبرة بحذر.
   ملاحظة: في حال كان التتبع الأحمر يتسرب من السمك عند الحقن، استبعد السمكة من التجربة.
4. بعد الحقن مباشرة، انقل السمك إلى حوض استعادة مع ماء عذب.
5. خذ عينات من التعليق البكتيري على ألواح 7H10 كل 15 دقيقة من الكوكوت البكتيري المستخدم وحضن البكتيريا على حرارة 29 درجة مئوية لمدة 5 أيام وتحقق من جرعة العدوى بعدد المستعمرات على الأطباق.
6. تحقق من صحة الأسماك بانتظام وقم بالقتل الرحيم لأي سمكة تظهر عليها أعراض العدوى بتركيز يزيد عن 0.02٪ من إستر الإيثيل 3-أمينوبنزويك (pH 7.0).
   ملاحظة: حوالي 7٪ من سمك الزرد البالغ المصاحب ب 34 ± 15 CFU و30٪ من أسماك الزرد المصابة ب 2029 ± 709 CFU قد ظهرت عليه أعراض بحلول 8 أسابيع19. قد تشمل الأعراض السباحة غير الطبيعية، عدم الاستجابة للمس، التنفس العميق، الوذمة أو الهزال الملحوظ.
7. الحفاظ على سمك الزرد وفقا للمعايير الشائعة

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الميكروبكتيريوم مارينوم	مجموعة ثقافة الأنواع الأمريكية	ATCC 927
أجار ميدلبروك 7H10	بكالوريوس الطب العلمي، ثيرمو فيشر العلمي	11799042
إثراء OADC في ميدلبروك	بكالوريوس الطب العلمي، ثيرمو فيشر العلمي	11718173
ميدلبروك 7H9 متوسط	بكالوريوس الطب العلمي، ثيرمو فيشر العلمي	11753473
إثراء ADC في ميدلبروك	بكالوريوس الطب العلمي، ثيرمو فيشر العلمي	11718173
أقراص محلول ملحي مخزنة بالفوسفات (PBS)	سيغما-ألدرتش	P4417-50TAB
الفينول الأحمر	سيغما-ألدرتش	P3532
إبرة 27 G	هينكي ساس وولف	4710004020
حقنة 1 مل	هينكي ساس وولف	4010.200V0
إبرة الأنسولين Omnican 100 30 G	براون	9151133
3-حمض الأمينوبنزويك إيثيل إستر (pH 7.0)	سيغما-ألدرتش	A5040