نموذج تدفق الصفائح المتوازية في المختبرات لدراسة التصاق البكتيريا في خزعة الأنسجة

الملخص

المصدر: ديتكوفسكي، ب.، وآخرون. نموذج في المختبر لنظام تروية موازية لدراسة التصاق البكتيريا بأنسجة الطعم. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو طريقة استخدام غرفة تدفق الصفائح المتوازية لدمج البكتيريا الموسومة بالفلورية فوق أنسجة الطعم الوعائي، مما يمكن من تحليل التصاق البكتيريا وبداية المرض تحت ظروف تدفق القص.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بعينات الحيوانات والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة أخلاقيات الحيوانات المختصة. تجارب التروية في المختبر باستخدام غرفة تدفق الصفائح المتوازية

1. قم بتركيب خزعات أنسجة بقطر 10 مم ونفس السماكة في نظام غرفة تدفق بحيث يكون السطح الداخلي مواجها للأعلى لملامسة التعليق البكتيري.
   ملاحظة: نفس سمك الأنسجة عبر الطعوم المختلفة يضمن الوصول إلى نفس ارتفاع الأنسجة في القناة، مما يسمح بتدفق الطبقات في جميع الظروف. جميع عناصر غرفة التدفق معروضة وموصوفة في الشكل 1.
   1. لبدء البروتوكول، ضع قطعة النسيج الدائرية بين شريحة مجهر مزودة بثقب دائري بقطر 8 مم وحشية مطاطية.
      ملاحظة: تحتوي شريحة المجهر على طبقة سفلية فائقة الرقة للسماح بتوليد ثقب 8 مم. مع الصفيحة المطاطية، يثبت الأنسجة لتمكين الاتصال المباشر بين العينة والوسط المتدفق، كما يمنع خلع الخزعة أثناء التجربة. سطح النسيج المدرج، الذي يتعرض للتدفق (القطر الأصغر)، لا يمكن التلاعب به بواسطة الملقط.
      1. أدخل الحامل مع النسيج في صفيحة الحشية المدمجة في الإطار المعدني السفلي للغرفة.
      2. ثبت الإطار المعدني العلوي مع ورقة الحشية المقابلة في الجزء السفلي من الحجرة باستخدام حامل النسيج الذي تم إدخاله سابقا. بعد ذلك، قم بتركيب الحجرة بالكامل بثمانية براغي وصواميل براغي. تأكد من أن ارتفاع الحجرة دائما متساوي بين الطعم.
         ملاحظة: يجب تحديد ارتفاع الحجرة دائما عند شد البراغي. استخدم مسطرة أو مسطرة.
2. قم بتوصيل غرفة التدفق بمضخة بريستالتيكية وخزان السوائل بالأنابيب.
3. قم بحقن الأنسجة مع تعليقات بمقدار 10⁷ وحدة CFU/mL (تم التحقق منها بواسطة وحدة تشكيل المستعمرات (CFU) ومرتبطة بقياس OD₆₀₀ (الكثافة البصرية)) البكتيريا الموسومة بالفلورسنت في PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) مع إجهاد قص 3 داين/سم² (داين لكل سنتيمتر مربع ضغط) بواسطة مضخة بيريستالتيكية (معدل تدفق 4 مل/دقيقة) لمدة ساعة واحدة باستخدام خزان بكتيريا 400 مل (تصميم داخلي، الشكل 1) مكيف عند 37 درجة مئوية باستخدام منظم حرارة صفيحي (جدول المواد).
4. أعد تدوير تعليق البكتيريا بسعة 100 مل باستمرار باستخدام نفس خزان التجميع.
5. بعد التروية، تفكك الحجرة لتحرير الطعم وغسل قطعة النسيج مرتين باستخدام 4 مل من PBS في صفيحة بسعة 12 بئر باستخدام هزاز المدار المختبري لمدة 3 دقائق لكل منهما. بعد ذلك قطع الجزء الداخلي من الطعم باستخدام ثقب خزعة جلدية بقطر أصغر.
6. ضع كل خزعة نسيج في أنبوب منفصل بحجم 14 مل يحتوي على 1 مل من NaCl المعقم بنسبة 0.9٪. ضع علامة على الأنبوب #1.
7. فصل البكتيريا عن النسيج باستخدام حمام صوتي لمدة 10 دقائق (السعة = 100٪ والتردد = 45 كيلوهرتز).
   ملاحظة: يجب تقييم الانفصال الكامل للبكتيريا عن طعوم الأنسجة عند حضانة البقع طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في وسط سائل TSB (مرق الصويا التريبتيكي) يليه قياسات_{OD 600} مقارنة باللصقات الضابطة المعالجة بمحلول خال من البكتيريا.

النتائج

الشكل 1: صورة لنظام غرفة تدفق تم تطويره حديثا (تصميم داخلي). A. غرفة التدفق (1) مركبة بأبعاد عرض × ارتفاع: 125 مم × 55 مم × 18 مم (البراغي مع صواميل البرغي تثبت أجزاء الحجرة معا وتضغط عبر الإطار المعدني على الحشيات لمنع التسرب); (2) ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
رقعة التامور البقري (BP)، التامور المحيطي المرن	سينوفيس للابتكارات الجراحية، الولايات المتحدة الأمريكية	PC-0404SN
قنوات الأوردة الوداجي البقرية (BJV)	قناة كونتيغرا؛ شركة ميدترونيك، الولايات المتحدة الأمريكية	M333105D001
تشابه الزرع المحمية بالتجميد في CH	البنك الأوروبي للزراعة الجنسية (EHB)	-
أكيو-بانش	أكوديرم إنك، الولايات المتحدة الأمريكية	P850 (8 مم)؛ P1050 (10 مم)
هيومن ألبومين	فليكسبومين؛ باكستر، بلجيكا	BE171464LOT:16G12C
مرق الصويا التريبتيكي (TSB)	فلوكا، شتاينهايم، ألمانيا	22092-500G
مرق حقن القلب (BHI)	فلوكا	53286-500G
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).	جيبكو	14190-094
5(6)-كربوكسي فلوريسين إن-هيدروكسي سكوكسينيميد إستر (CF)	سيغما-ألدريتش، ألمانيا	21878-100MG-F
مضخة التنفس الذاتي (موديل ISM444B)	معيار Ismatec BVP-Z؛ كول بارمر، فيرتهايم، ألمانيا	631942-2
حمام الصوت	منظف بالموجات فوق الصوتية VWR; VWR، رادنور، بنسلفانيا	142-6044	230 فولت/50 -60 هرتز 60 فولت أمام؛ HF45 كيلوهرتز، 30 واط
تركيب برو لونغ الذهبي المضاد للتصبغ	إنفيتروجين من ثيرموفيشر	P36930
أريوم برو VF - ماء فائق نقي - H2O MilliQ	ميليبور	87206462
شرائح مجهرية - غرف زراعة الأنسجة (1-بئر)	سارستيدت	94.6140.102
بئر واحد على لوموكس القابل للفصل	سارستيدت	94.6150.101
الفولاذ المقاوم للصدأ - شفرات جراحية	سوان-مورتون	311
أنابيب سيليكون تايجون، 1/8" ID × 1/4" OD	كول-بارمر	EW-95702-06	نطاق درجات الحرارة: –80 إلى 200°C التصفيق: باستخدام أكسيد الإيثيلين، أو إشعاع غاما، أو المعقم لمدة 30 دقيقة، ضغط 15 رطل لكل بوصة مربعة
أنابيب PharMed BPT	سان غوبان	AY242012	قابل للتلقين 30 دقيقة عند 121°C
أنابيب تايجون LMT-55	سانت جوبين بيرفورمانس بلاستيك™	15312022
منظم الحرارة	BMG BIOMEDIZINTECHNIK	300-0042	230 فولت، 90 فولت أمامي، 50 هرتز