تقييم تثبيط انتشار الفيروس من خلال إسكات الجينوم بوساطة محاكيات microRNA

الملخص

تقييم خصوصية استهداف microRNA: مقايسة انتشار الفيروس باستخدام محاكيات microRNA الاصطناعية ملاحظة: يتم استخدام محاكي microRNA اصطناعي لإثبات خصوصية التفاعل بين microRNA والهدف الخاص به. تتضمن الضوابط لكل مقايسة لتقييم السمية التي يتوسطها microRNA ما يلي: ترانسفكشن وهمي (mock transfection)، ومحاكي microRNA ضابط سلبي، ومحاكي microRNA تجريبي فقط. ومن المثالي أيضاً تضمين ضابط إيجابي (أي جين أو جينوم مستهدف بواسطة microRNA)، حيث إن كفاءة الترانسفكشن المنخفضة لمحاكيات microRNA قد تؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة. يتم توزيع خلايا H1-HeLa في طبق زراعة أنسجة يحتوي على 96 بئراً، بحيث تصل نسبة تلاقي الخلايا (confluency) إلى 80-90% عند وقت الترانسفكشن (بعد 24 ساعة من الاستزراع). توزع الخلايا في وسط DMEM (وسط دولبيكو المعدل من وسط إيجل) المكمل بـ 10% مصل جنين البقر بمعدل 0.1 مل لكل بئر. ملاحظة: تُجرى هذه المقايسة في خلايا تسمح بالتكاثر الفيروسي ولا تعبر عن جزيئات microRNA المتناظرة. تُدفأ كواشف الترانسفكشن لتصل إلى درجة حرارة الغرفة. اخلط 9 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل، ومحلول مخزن من محاكي microRNA بتركيز نهائي 200 نانومولار لكل بئر، و0.18 ميكرولتر من كاشف التعزيز (boost reagent)، و0.18 ميكرولتر من كاشف الترانسفكشن. تُحضن المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين 2 إلى 5 دقائق. ملاحظة: الأحجام المذكورة هي لكل بئر. يُوصى بتجهيز مزيج رئيسي (master mix) لعملية الترانسفكشن لجميع الآبار للحفاظ على الاتساق وتقليل أخطاء الماصة. يختلف التركيز الأمثل لمحاكي microRNA؛ لذا يُرجى مراجعة تعليمات الشركة المصنعة المرفقة مع محاكي microRNA لتحديد تركيز بدئي مناسب، والذي يتراوح عموماً بين 5 و200 نانومولار كتركيزات نهائية. يُسحب الوسط من الآبار ويضاف 92 ميكرولتر من وسط كامل طازج. ملاحظة: في حالة وجود عدد كبير من العينات، تُنفذ هذه الخطوة قبل تجهيز محلول الترانسفكشن، ويُحفظ الطبق عند درجة حرارة 37 مئوية حتى يحين موعد الاستخدام. يُضاف مزيج الترانسفكشن كاملاً إلى الخلايا على شكل قطرات. تُحضن الخلايا عند درجة حرارة 37 مئوية لمدة 6 ساعات. تُعدي كل بئر بمضاعف عدوى (MOI) منخفض لضمان إصابة نسبة منخفضة من الخلايا، وذلك للسماح بتحليل انتشار الفيروس. يستخدم هذا البروتوكول مضاعف عدوى قدره 0.2. تُخفف مخزونات الفيروس في وسط خالٍ من المصل لتصل إلى تركيز مضاعف عدوى = 0.2 لكل 100 ميكرولتر. يُزال الوسط من الآبار ويُضاف 100 ميكرولتر من تخفيف الفيروس لكل بئر. تُحضن الخلايا عند درجة حرارة 37 مئوية لمدة ساعتين. يُسحب الوسط من كل بئر ويُضاف 100 ميكرولتر من وسط كامل طازج. تُحضن الخلايا عند درجة حرارة 37 مئوية لمدة تتراوح بين 20 إلى 22 ساعة. يتم تحديد عيار الفيروس (virus titration) في السوائل الطافية. يُجمع السائل الطافي من كل بئر ويُستبدل بـ 100 ميكرولتر من وسط كامل طازج. ملاحظة: في حال استخدام خلايا معلقة، يُعاد تعليق كتلة الخلايا الناتجة عن الخطوة التالية في 100 ميكرولتر من وسط كامل طازج وتُعاد إلى بئر العينة لإجراء مقايسة الحيوية. تُزال الحطام الخلوي من السوائل الطافية المجموعة عن طريق الطرد المركزي عند 300 x g لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة 4 مئوية. يُنقل السائل الطافي الرائق إلى أنبوب جديد ويتم تعيير الفيروس المعدي على خلايا تسمح بالتكاثر ولا تعبر عن جزيئات microRNA المتناظرة. ملاحظة: تُحفظ جميع العينات على الثلج لمنع فقدان القدرة على العدوى. رويز، أ. ج. وروسيل، س. ج. التنظيم القائم على microRNA لتوجه الفيروسات البيكورنافيروسية. مجلة التجارب المرئية (J. Vis. Exp.) (2017)

يوضح هذا الفيديو استخدام محاكيات microRNA الاصطناعية لتثبيط التكاثر الفيروسي بشكل انتقائي في خلايا مستنبتة شبيهة بالخلايا الظهارية. كما يسلط الضوء على كيفية قيام إسكات الجينوم الموجه بواسطة microRNA بمنع انتشار الفيروس وتأكيد خصوصية الاستهداف من خلال تحليل العدوى اللاحق.

البروتوكول

1. تقييم خصوصية استهداف microRNA: مقايسة انتشار الفيروس باستخدام محاكيات microRNA الاصطناعية

ملاحظة: يتم استخدام محاكي microRNA اصطناعي لإثبات خصوصية التفاعل بين microRNA والهدف الخاص به (microRNA-target).

1. تضمّن ضوابط لعملية ترانسفكشن وهمية (mock transfection)، ومحاكي microRNA ضابط سلبي، ومحاكي microRNA تجريبي فقط في كل مقايسة لتقييم السمية الناجمة عن الـ microRNA. ومن المثالي أيضاً تضمين ضابط إيجابي (أي جين أو جينوم مستهدف بواسطة microRNA) لأن انخفاض كفاءة ترانسفكشن محاكيات microRNA قد يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة.
2. ازرع خلايا H1-HeLa في طبق زراعة أنسجة ذي 96 بئراً بحيث تكون درجة تلاقي الخلايا (confluency) تتراوح بين 80-90% عند وقت الترانسفكشن (بعد 24 ساعة من الاستزراع). ازرع الخلايا في وسط DMEM (وسط دولبيكو المعدل) المكمل بنسبة 10% مصل جنين بقري بمعدل 0.1 mL لكل بئر.
   ملاحظة: أجْرِ هذه المقايسة في خلايا تسمح بالتضاعف الفيروسي ولا تعبّر عن جزيئات microRNA المتوافقة.
3. قم بتدفئة كواشف الترانسفكشن حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. اخلط 9 µL من وسط خالي من المصل، وتركيزاً نهائياً قدره 200 nM لكل بئر من مخزون محاكي microRNA، و0.18 µL من كاشف التعزيز (boost reagent)، و0.18 µL من كاشف الترانسفكشن، ثم امزجهم جيداً. حضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-5 دقائق.
   ملاحظة: الأحجام المذكورة هي لكل بئر. ويُنصح بتجهيز خليط رئيسي (master mix) لعملية الترانسفكشن لجميع الآبار للحفاظ على الاتساق وتقليل أخطاء الماصة. سيختلف التركيز الأمثل لمحاكي microRNA؛ لذا يرجى مراجعة تعليمات الشركة المصنعة المرفقة مع محاكي microRNA لتحديد تركيز بدئي مناسب، والذي يتراوح عموماً بين تركيزات نهائية من 5-200 nM.
4. اشفط الوسط من الآبار وأضف 92 µL من وسط كامل طازج.
   ملاحظة: في حال وجود عدد كبير من العينات، أكمل هذه الخطوة قبل تحضير محلول الترانسفكشن واحفظ الطبق عند 37 °C حتى يحين وقت الاستخدام.
5. أضف خليط الترانسفكشن كاملاً إلى الخلايا قطرة تلو الأخرى.
6. حضن عند 37 °C لمدة 6 ساعات.
7. أصِب كل بئر بمعدل عدوى (MOI) منخفض لضمان إصابة نسبة منخفضة من الخلايا، مما يسمح بتحليل انتشار الفيروس. يستخدم هذا البروتوكول MOI قدره 0.2.
   1. خفف مخزونات الفيروس في وسط خالي من المصل لتصل إلى تركيز MOI = 0.2 لكل 100 µL. أزل الوسط من الآبار وأضف 100 µL من تخفيف الفيروس لكل بئر.
   2. حضن عند 37 °C لمدة ساعتين.
8. اشفط الوسط من كل بئر وأضف 100 µL من وسط كامل طازج.
9. حضن عند 37 °C لمدة 20-22 ساعة.
10. حدد عيار الفيروس (virus titration) في السوائل الطافية.
    1. اجمع السائل الطافي من كل بئر واستبدله بـ 100 µL من وسط كامل طازج.
       ملاحظة: في حال استخدام خلايا معلقة، أعد تعليق كتلة الخلايا الناتجة عن الخطوة التالية في 100 µL من وسط كامل طازج وأعدها إلى بئر العينة لإجراء مقايسة الحيوية.
    2. أزل الحطام الخلوي من السوائل الطافية المجموعة عن طريق الطرد المركزي بسرعة 300 x g لمدة 5 دقائق عند 4 °C.
    3. انقل السائل الطافي المصفى إلى أنبوب نظيف وقم بتقدير عيار الفيروس المعدي على خلايا تسمح بذلك ولا تعبّر عن جزيئات microRNA المتوافقة. 
       ملاحظة: احفظ جميع العينات على الثلج لمنع فقدان القدرة على العدوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ماء خالٍ من النوكلياز	Fisher Scientific	AM9938
كاشف ترانسفكشن TransIT-2020	Mirus	MIR 5404
كاشف ترانسفكشن TransIT-mRNA	Mirus	MIR 2225
أنابيب ذات غطاء لولبي سعة 2 mL	Sarstedt	72.694.005
محاكيات MicroRNA	Dharmacon	Varied
مقايسة MTT لتكاثر الخلايا	ATCC	30-1010K