إنتاج فيروس حصبة مأشوب يشفر بروتيناً محفزاً للمناعة

الملخص

المصدر: Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. فيروسات باراميكسو للتعديل المناعي المستهدف للأورام: التصميم والتقييم خارج الجسم الحي. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو كيفية توليد فيروسات الحصبة المؤتلفة باستخدام الليبوزومات لإيصال البلازميدات التي تشفر الجينوم الفيروسي المضاد والبروتينات المساعدة الأساسية إلى الخلايا المنتجة. يؤدي الحمض النووي الريبوزي (RNA) المنسوخ والمضاعف إلى تكوين جسيمات فيروسية تعبر عن بروتينات محفزة للمناعة وبروتينات مراسلة فلورية. بعد ذلك، يُستخدم المجهر الفلوري لتصور تكوين المدمج الخلوي (syncytia)، مما يؤكد نجاح إنتاج الفيروس المؤتلف.

البروتوكول

ملاحظة: تشير الرموز [O] و [P] و [M] إلى الأقسام الفرعية التي تنطبق على: الفيروسات الحالة للأورام (OVs) بشكل عام، أو (معظم) الفيروسات المخلوية (paramyxoviruses)، أو فيروس الحصبة (MV) فقط، على التوالي. ويشير الرمز [B] إلى الأقسام الخاصة بالجينات المنقولة لمحفزات الخلايا التائية ثنائية الخصوصية (BTE).

1 استنساخ الجينات المنقولة المشفرة للمعدلات المناعية في ناقلات فيروس الحصبة

1. [O] تصميم تسلسل القطعة المدرجة.
   1. [O] تحديد المُعدِّل المناعي المراد دراسته بناءً على البحث في الأدبيات أو على البيانات الاستكشافية مثل المسح الجيني، واستخلاص تسلسل DNA المكمل (cDNA) ذي الصلة من قواعد البيانات المناسبة مثل GenBank، أو الأرشيف الأوروبي للنوكليوتيدات (European Nucleotide Archive)، أو النظام الدولي للمعلومات الجينية المناعية (IMGT).
   2. [O] إضافة ميزات إضافية إلى تسلسل الجين المنقول (الشكل 1). يمكن أن يؤدي وجود تسلسل Kozak سابق وتحسين الكودونات بما يتناسب مع النوع إلى تعزيز التعبير الجيني. تسلسلات الإشارة مطلوبة للإفراز. يجب تضمين تسلسلات تشفر لعلامات بروتينية عند الطرف N و/أو C للكشف والتنقية. كما يجب تضمين مواقع تقييد للإدراج في الناقل.
      ملاحظة: [M] تُعد وحدات النسخ الإضافية (ATUs) التي تحتوي على إشارات بدء وتوقف جين بوليميراز MV ضرورية للتعبير عن الجين المنقول من جينومات MV المؤتلفة. سبق تطوير نواقل cDNA مضادة للجينوم مناسبة، يتم التحكم فيها بواسطة محفزات الفيروس المضخم للخلايا (CMV) وتحتوي على ATUs ذات مواقع تقييد فريدة لإدخال الجينات المنقولة ذات الاتجاه الموجب في مواضع محددة. [P] يُعد الموضع المناسب للجين المنقول أمراً بالغ الأهمية، لأنه يؤثر على التكاثر الفيروسي والتعبير عن الجين المنقول بسبب تدرج التعبير النموذجي لفيروسات Paramyxoviruses. بشكل عام، يؤدي الإدخال في ATU قريبة من الطرف '3 للجين المضاد (أي في موضع القائد أو في اتجاه المصب من الجين P) إلى تعبير عالٍ عن الجين المنقول على حساب تقليل التكاثر الفيروسي. ويمكن توقع زيادة في التكاثر ومستويات أقل من التعبير عن الجين المنقول عند استخدام ATU في اتجاه المصب من الجين H. يتطلب تغليف جينوم العديد من فيروسات Paramyxoviruses، بما في ذلك فيروس الحصبة، ارتباط ستة نوكليوتيدات بكل بروتين غلاف نووي (nucleocapsid protein). ولإدراج الجينات المنقولة في مثل هذه الفيروسات، يجب التأكد من أن عدد نوكليوتيدات الجينوم الكامل يقبل القسمة على ستة؛ وهو ما يُعرف بـ "قاعدة الستة". إذا لزم الأمر، يتم تضمين نوكليوتيدات إضافية في القطعة المدرجة (في اتجاه المنبع من تسلسل Kozak أو في اتجاه المصب من كودون التوقف) دون إحداث إزاحة في إطار القراءة أو كودونات توقف مبكرة. [M] تجنب تسلسلات معينة في الجين المنقول تشبه إشارات بدء (AGGRNCMARGW) وتوقف (RTTAWANAAAA) جين MV وتسلسلات تحرير RNA (AAAAAGGG).
   3. [O] شراء أوليغونوكليوتيدات بالتسلسل المطلوب أو تجميعها من تسلسلات متاحة باستخدام الاستنساخ الجزيئي القياسي.
      ملاحظة: [O] لتضخيم الجين المنقول عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، يتم تصميم بادئ أمامي يتضمن موقع التقييد في اتجاه المنبع وأول 15-20 نوكليوتيد من القطعة المدرجة، وبادئ عكسي يتضمن آخر 15-20 نوكليوتيد من القطعة المدرجة متبوعة بموقع التقييد في اتجاه المصب.
2. [O] استنساخ القطعة المدرجة في DNA الذي يشفر (الـ)جينوم الفيروسي المضاد.
   1. [O] استنساخ القطعة المدرجة في نواقل DNA أو جينومات DNA مضادة لفيروسات RNA باستخدام تقنيات الاستنساخ الجزيئي القياسية (أي التقييد الإنزيمي متبوعاً بربط DNA).
      1. [O] منع إعادة ربط الناقل باستخدام مواقع تقييد غير متوافقة أو عن طريق إزالة الفوسفات قبل عملية الربط.
      2. [O] عزل ناتج الربط عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز ثم تنقية الهلام باستخدام أطقم تجارية متاحة. وبشكل عام، يتم تحقيق الكفاءة المثلى للربط عند نسبة مولية 3:1 من القطعة المدرجة إلى الناقل.
   2. [O] تحويل ناتج الربط إلى بكتيريا كفؤة مناسبة للاستعادة الفعالة للبلازميدات الكبيرة (أي إجراء صدمة حرارية لبكتيريا E. coli) وتحديد المستعمرات البكتيرية التي تحمل DNA الصحيح عن طريق PCR للمستعمرات.
   3. [O] عزل DNA المضخم من مستعمرة بكتيرية واحدة باستخدام أطقم تحضير DNA تجارية متاحة. تأكيد السلامة الجينومية عن طريق الهضم الضابط باستخدام إنزيمات تقييد مناسبة (مثل HindIII لجينومات MV [M]). تأكيد الإدراج الصحيح وسلامة الجين المنقول عن طريق التسلسل.
      ملاحظة: [M] بالنسبة للجينات المنقولة المدرجة في MV H-ATU، يتم إجراء تسلسل سانجر باستخدام البادئات التالية: H-9018 [بادئ أمامي، يرتبط بموضع الجينوم 9018 في إطار القراءة المفتوح (ORF) للجين H]: 5' GTGTGCTTGCGGACTCAGAATC 3'؛ وL-9249+ (بادئ عكسي، يرتبط بموضع الجينوم 9249 في ORF الجين L): 5' CAGATAGCGAGTCCATAACGG 3'.

2. استعادة جزيئات فيروس الحصبة المؤتلف التي تشفر المعدلات المناعية

1. [O] توليد جسيمات فيروسية مؤتلفة من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) الجينومي أو المضاد للجينومي عبر ترنسفكشن (transfection) لخلايا منتجة للفيروس، وفقاً للبروتوكول القياسي الخاص بكل فيروس. يجب اتباع الإرشادات الخاصة بالعمل تحت ظروف معقمة، وإجراء زراعة الخلايا تحت أغطية الحماية، وبوجه خاص تنفيذ جميع الخطوات التي تتضمن الفيروس داخل كبائن السلامة البيولوجية من الفئة الثانية.
   1. [M] لاستعادة فيروسات الحصبة من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين التكميلي (cDNA)، يتم توزيع خلايا إنتاج فيروس الحصبة (خلايا Vero المشتقة من كلية القرد الأخضر الأفريقي) بالتساوي في طبق مكون من 6 آبار قبل 24 ساعة من عملية عفن الخلية (transfection). يتم استزراع 2 × 10⁵ الخلايا في 2 مل من وسط دولبكو المعدل من وسط إيغل (DMEM) المحتوي على 10% من مصل جنين البقر (FBS) لكل بئر، لتحقيق درجة تلاقي تتراوح بين 65% و75% عند وقت عفن التحول (transfection).
      ملاحظة: [P] قلل عدد الخلايا إذا نمت الخلايا بشكل مفرط قبل تكوين المدمجات (syncytia) الناتجة عن الفيروس.
   2. [P] قم بترصيف الخلايا باستخدام الحمض النووي DNA الذي يشفر الجينوم المضاد للفيروس، والبلازميدات المساعدة المطلوبة، وبلازميد يشفر بروتينًا فلوريًا مؤشرًا إذا رغبت في ذلك لتقييم كفاءة الترصيف.
      1. [م] اخلط 5 µg من الحمض النووي ريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) المؤتلف الذي يشفر الجينوم المضاد لفيروس الحصبة، و500 نانوغرام من كل من بلازميدات التعبير الثديية التي تشفر بروتيني N وL لفيروس الحصبة، و100 نانوغرام من كل من البلازميدات التي تشفر بروتين P في حجم إجمالي قدره 200 µL وسط DMEM. وإذا كان المطلوب هو تقييم كفاءة عفن التحول (وفي حال لم يكن موجوداً بالفعل ضمن بنية الجينوم المضاد للفيروس)، يتم إدراج 100 نانوجرام من بلازميد مراسل فلوري.
      2. أضف 18.6 µL من كاشف التعداء الليبوزومي، ثم امزج المكونات فوراً عن طريق نقر الأنبوب، واتركها للحضن لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
      3. [P] استبدل الوسط بـ 1.8 مل من DMEM بتركيز 2% من FBS، 50 µg/mL كاناميسين (أو مضادات حيوية أخرى لمنع التلوث) لكل بئر، ثم أضف خليط عفن الخلية (transfection mix) قطرة تلو الأخرى إلى البئر مع التدوير بعناية. تُحضن الخلايا طوال الليل عند 37 °C، 5% CO2₂استبدل الوسط بـ 2 مل من وسط DMEM الطازج، و2% من مصل جنين البقر (FBS)، و 50 µg/mL الكاناميسين في اليوم التالي؛ وتكرر هذه العملية عندما يصبح الوسط حمضياً.
         تنبيه: [O] تعامل مع الخلايا والمواد وفقاً للوائح السلامة البيولوجية، حيث قد يتواجد الفيروس بدءاً من عملية عفن الخلايا (transfection) وطوال الخطوات التالية. تخلص من النفايات المعدية (المحتملة) بطريقة مناسبة.

النتائج

الشكل 1: تمثيل تخطيطي لجينوم فيروس الحصبة. يتم تشفير البروتين الفلوري الأخضر المحسن (eGFP) في وحدة نسخ إضافية تقع بعد تسلسل القائد (ld). ترمز N وP وM وF وH وL إلى الجينات التي تشفر البروتينات الهيكلية لفيروس الحصبة وهي البروتين النووي، والبروتين P، وبروتين المصفوفة، وبروتين الاندماج، وبروتين الهيموجلوتينين، والبروتين الكبير (البوليميراز) على التوالي، والتي يتم التعبير عنها بشكل متفاوت كما هو موضح أعلاه. يتم إدراج جين ناقل لمحفز الخلايا التائية ثنائي الخصوصية (BTE) في وحدة نسخ إضافية (ATU) تقع بعد إطار القراءة المفتوح H. يشفر الجين الناقل ببتيد قائد للغلوبولين المناعي كابا (Igκ) لضمان الإفراز الفعال، بالإضافة إلى علامات بروتينية من الهيموجلوتينين للإنفلونزا (HA) وسداسية الهيستيدين (His) للكشف والتنقية. ترتبط الجينات التي تشفر نطاقات السلسلة الثقيلة المتغيرة (VH) والسلسلة الخفيفة المتغيرة (VL) للأجسام المضادة التي تستهدف CD3 وCD20 على التوالي، عن طريق تسلسلات رابطة ببتيدية تحتوي على بقايا الجلايسين (G) والسيرين (S). يسبق تسلسل الجين الناقل تسلسل Kozak. وبعد منطقة التشفير، تم تضمين نيوكليوتيدات إضافية كمثال للامتثال لقاعدة الستة. يحيط بكاسيت الإدراج موقعان للقطع التقييدي مما يسمح بالإدراج في وحدة النسخ الإضافية (ATU) المعنية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
إزالة الفسفرة السريعة للحمض النووي DNA & طقم الربط	Roche Life Science، مانهايم، ألمانيا	4898117001
طقم استنساخ CloneJET PCR	Thermo Fisher Scientific، سانت ليون روت	K1231
أجاروز	Sigma-Aldrich، تاوفكيرشن، ألمانيا	A9539-500G
طقم استخلاص الجل QIAquick	QIAGEN، هيلدن، ألمانيا	28704
بكتيريا E. coli كفؤة من سلالة NEB 10-beta	New England Biolabs (NEB)، فرانكفورت/ماين، ألمانيا	C3019I
طقم QIAquick Miniprep	QIAGEN، هيلدن، ألمانيا	27104
إنزيم القطع HindIII-HF	New England Biolabs (NEB)، فرانكفورت/ماين، ألمانيا	R3104S
وسط دولبيكو المعدل من وسط إيغل (DMEM)	Invitrogen، دارمشتات، ألمانيا	31966-021
مصل جنين البقر (FBS)	Biosera، بوسينس، فرنسا	FB-1280/500
FugeneHD	Promega، مانهايم، ألمانيا	E2311	يمكن استبداله بكاشف ترانسفكشن (نقل جيني) من اختيار الباحث
كاناميسين	Sigma-Aldrich، تاوفكيرشن، ألمانيا	K0129
خلايا Vero	ATCC، ماناساس، فيرجينيا، الولايات المتحدة الأمريكية	CCL81
أطباق ذات 6 آبار	Neolab، هايدلبرغ، ألمانيا	353046