إنتاج وحصاد الخلايا الظهارية المنتجة للفيروسات العلاجية

الملخص

المصدر: Heidbuechel, J. P., et al. فيروسات Paramyxoviruses للتعديل المناعي الموجه للأورام: التصميم والتقييم خارج الجسم الحي (Ex Vivo). J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو عملية إصابة الخلايا الظهارية الكلوية بفيروسات معدلة وراثياً لإنتاجها وحصادها من أجل دراسة التكاثر الفيروسي.

البروتوكول

1. تحديد القدرات التضاعفية والسمية الخلوية للنواقل الفيروسية التي تشفر المعدلات المناعية

قارن حركية التضاعف للفيروس المؤتلف الناتج والناقل غير المعدل باستخدام منحنيات النمو (GCs) أحادية الخطوة أو متعددة الخطوات. في منحنيات النمو أحادية الخطوة، يتم تقييم النسل الفيروسي بعد إصابة جميع الخلايا في وقت واحد (نظرياً، إصابة بنسبة 100%). أما منحنيات النمو متعددة الخطوات فتبدأ بنسبة منخفضة من الخلايا المصابة لتتبع عدة جولات من التضاعف الفيروسي.

1. لتحليل حركية تكاثر فيروس الحصبة، يتم استزراع 1 x 10⁵ من خلايا Vero في 1 mL من وسط DMEM (وسط إيغل المعدل من قبل دولبيكو) مع 10% FBS (مصل جنين البقر) لكل بئر في أطباق ذات 12 بئراً قبل يوم واحد من العدوى. يتم تجهيز بئرَين على الأقل لكل نقطة زمنية مرغوبة كمكررات تقنية.
2. يتم إصابة الخلايا بالفيروس بـ MOI (تعددية العدوى) منخفضة لمنحنيات النمو متعددة الخطوات، أو بـ MOI عالية لمنحنيات النمو أحادية الخطوة (0.03 و 3 لفيروس MV أو فيروس الحصبة) للتكاثر على خلايا Vero، على التوالي. يُستبدل الوسط بـ 300 µL من وسط خالٍ من المصل يحتوي على الكمية المقابلة من الفيروس، ويُحضن عند 37 °C و 5% CO₂ لمدة ساعتين على الأقل. يُزال اللقاح، ويُضاف 1 mL من وسط DMEM مع 10% FBS، وتستمر عملية التحضين.
3. في النقاط الزمنية ذات الصلة مثل 12 و 24 و 36 و 48 و 72 و 96 h بعد العدوى، يتم جمع النسل الفيروسي عن طريق كشط الخلايا مباشرة في الوسط. تُنقل محتويات كل بئر إلى أنبوب فردي، وتُجمد سريعاً في النيتروجين السائل، وتُخزن عند -80 °C حتى عملية التعيير.
   ملاحظة: يمكن تجميع العينات المكررة في هذه الخطوة لتحليل متوسطات العيارات.
4. تُجمع العينات من جميع النقاط الزمنية. تُذاب جميعاً في وقت واحد عند 37 °C لتقييم النسل الفيروسي. يتم الرج بمزيج vortex وترسيب حطام الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 min عند 2,500 x g و 4 °C.
5. يتم حساب متوسطات العيارات لكل بنية جينية وكل نقطة زمنية كما هو موضح أعلاه. تُرسم العيارات بيانياً مقابل الزمن. تُقارن منحنيات نمو النواقل مع وبدون الجينات المنقولة المدرجة، أو مع جينات منقولة مختلفة، أو مع جينات منقولة مدرجة في مواقع مختلفة (انظر الشكل 1).

النتائج

الشكل 1: حركية التضاعف والنشاط المحلل للفيروسات الحصبائية المؤشبة. (A) تم إنشاء منحنيات نمو ذات خطوة واحدة بعد إصابة خلايا Vero بفيروس الحصبة (MV) المحلل للأورام غير المعدل أو فيروس الحصبة الذي يشفر رابطًا ثنائي الخصوصية للخلايا التائية (MV-H-mCD3xhCD20) عند MOI قدره 1. تم تقييم عيارات النسل الفيروسي في نقاط زمنية محددة بعد الإصابة، مما يشير إلى حركية تضاعف فيروسية مماثلة. تظهر المتوسطات والانحرافات المعيارية لثماني عينات (أربعة مكررات تقنية لكل من مكررين بيولوجيين لكل نقطة زمنية). (B) تم تقييم حيوية الخلايا في خلايا سرطان القولون والمستقيم الفأرية MC38 التي تعبر بشكل مستقر عن المستضد الجنيني السرطاني البشري ومستقبل فيروس الحصبة CD46 (MC38-CEA-CD46) بعد التلقيح بالوسط فقط (mock) أو الفيروسات المحددة عند MOI قدره 1. تم إجراء مقايسة XTT لحيوية الخلايا في النقاط الزمنية المحددة. لوحظ انخفاض في حيوية الخلايا في نقاط زمنية مبكرة بالنسبة للنواقل غير المعدلة. إن القيم التي تتجاوز 100%، كما تم حسابها لـ MV-H-mCD3xhCD20 عند النقطة الزمنية 12 h، تلاحظ بشكل متكرر بعد فترة وجيزة من الإصابة، وهو ما قد يعود إلى الإجهاد الخلوي أو العوامل المشتقة من الخلايا الموجودة في المعلق الفيروسي. تظهر القيم المتوسطة زائد الانحرافات المعيارية لثلاثة مكررات تقنية لكل نقطة زمنية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen, Darmstadt, Germany	31966-021	يُستخدم لزراعة وإصابة خلايا Vero
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biosera, Boussens, France	FB-1280/500	لتكملة وسط DMEM
Vero cells	ATCC, Manassas, VA, USA	CCL81	خلايا مضيفة لإكثار فيروس الحصبة واختباره
أطباق 12 عين	Neolab, Heidelberg, Germany	353043	لزراعة خلايا Vero (1 × 10⁵ لكل عين)
Opti-MEM (وسط خالٍ من المصل)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany	31985070	لخطوة الإصابة الفيروسية (حضن خالٍ من المصل)
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany	14190-094	لغسل الخلايا وتحضير الأوساط
كاشطة خلايا (Cell lifter)	Corning, Reynosa, Mexico	3008	تُستخدم لكشط الخلايا المصابة عند الحصاد
أنابيب 50 mL	nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany	02-572-3001	لجمع العينات والطرد المركزي
نيتروجين سائل	—	—	للتجميد السريع لعينات الفيروس المحصودة
جهاز طرد مركزي (بقدرة 2,500 × g)	—	—	لترسيب حطام الخلايا
XTT Cell Viability Kit (Colorimetric Cell Viability Kit III)	PromoKine, Heidelberg, Germany	PK-CA20-300-1000	تتضمن كاشف XTT؛ لقياس السمية الخلوية
أطباق 96 عين، ذات قاع مسطح	Neolab, Heidelberg, Germany	353072	لقياس الامتصاصية عند 450 nm
جهاز مطياف ضوئي / قارئ الأطباق الدقيقة	—	—	لقياس الامتصاصية الضوئية عند 450 nm (المرجع 630 nm)
حضانة ثاني أكسيد الكربون	—	—	37 °C، و5% CO₂ لجميع عمليات حضن الخلايا