تقييم النشاط المعدل للمناعة لمحفز ثنائي الخصوصية للخلايا التائية مشفر فيروسياً

الملخص

تقييم الوظائف المناعية للمنظمات المناعية المعزولة. يصف ما يلي بالتفصيل كيفية تقييم السمية الخلوية بوساطة الخلايا والمستحثة بواسطة رابطات الخلايا التائية ثنائية الخصوصية (BTE) عن طريق مقايسة تحرر لاكتات ديهيدروجينيز (LDH). حدد الظروف التي سيتم اختبارها أثناء التجربة (انظر الشكل 1 كمثال). يمكن تنويع النقاط الزمنية (من ساعات إلى أيام)، وتركيزات المنظم المناعي (من pg/mL إلى µg/mL)، ونسب الخلايا المؤثرة إلى الخلايا المستهدفة (E:T) (بين 1:50 و 50:1، على سبيل المثال). قم دائمًا بتحضير العينات في ثلاث مكررات. تضمن العينات عينات بدون بروتين BTE وبدون خلايا مؤثرة، وعينات ضابطة لتحرر LDH التلقائي لأنواع الخلايا المفردة (Tsp و Esp)، وعينة ضابطة للتحلل الأقصى للخلايا المستهدفة (Tmax) مع إضافة منظف قبل القراءة، وعينة ضابطة للوسط الغذائي فقط، وعينة ضابطة للحجم لـ Tmax. ملاحظة: قد تختلف أعداد الخلايا المستهدفة المطلوبة وأوقات التحضين. قم بإجراء تجارب أولية بدون خلايا مؤثرة أو منظمات مناعية لتحديد المعايير المثلى. أضف عينات Tsp و Tmax والعينات الضابطة المقابلة لتقييم أعداد الخلايا والنقاط الزمنية المختلفة. اعزل الخلايا المناعية المؤثرة (على سبيل المثال، عن طريق طرد مركزي بتدرج الكثافة لدم الإنسان للحصول على خلايا الدم المحيطية وحيدة النواة (PBMCs) أو الاختيار السلبي للخلايا التائية الفأرية من خلايا الطحال الفأرية). ازرع الخلايا المستهدفة (على سبيل المثال، 5 × 10³ لكل بئر) في طبق 96 بئراً ذا قاع على شكل حرف U. أضف البروتين المعزول بالتركيزات المطلوبة إلى العينات المحددة. أضف الخلايا المناعية المؤثرة بالنسب المطلوبة. أضف الوسط الغذائي حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 100 ميكرولتر لكل بئر. حضن العينات للمدة الزمنية المحددة، عادة ما تكون بين 4 و 48 ساعة (24 ساعة لخلايا PBMCs غير المحفزة و 48 ساعة للخلايا التائية الفأرية المعزولة حديثًا؛ وقد تطبق أوقات تحضين أقصر للخلايا المناعية المحفزة مسبقًا)، عند 37 درجة مئوية و 5% CO2. قبل 45 دقيقة من جمع العينات، أضف 10 ميكرولتر من محلول التحلل بتركيز 10x إلى الآبار التي تحتوي على عينات Tmax والعينات الضابطة للوسط المقابلة. استمر في التحضين. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 250 x g لمدة 4 دقائق. انقل 50 ميكرولتر من كل سائل طافٍ إلى طبق 96 بئراً ذا قاع مسطح. لا تنقل الخلايا لتجنب LDH المرتبط بالخلايا. حضر محلول الركيزة وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. أضف 50 ميكرولتر إلى كل بئر وحضنها في درجة حرارة الغرفة [RT] في الظلام لمدة 30 دقيقة أو حتى تتحول عينات Tmax إلى اللون الأحمر الداكن. أضف 50 ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر. أزل فقاعات الهواء عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 4,000 x g، وبشكل يدوي باستخدام إبرة مجوفة. قياس الامتصاص الضوئي عند 490 نانومتر. احسب قيم النسبة المئوية للتحلل النوعي لكل عينة. احسب المتوسطات للمكررات الخاصة بالعينات الضابطة للوسط مع وبدون محلول التحلل. اطرح القيم التي تم الحصول عليها من العينات التجريبية ومن عينات Tmax وعينات التحرر التلقائي، على التوالي. استخدم هذه القيم المصححة للخلفية في الحسابات اللاحقة. احسب المتوسطات لعينات Tmax و Tsp و Esp الضابطة المصححة للخلفية. باستخدام هذه القيم المتوسطة، تعطي المعادلة التالية النسبة المئوية للتحلل النوعي لكل عينة: ارسم قيم النسبة المئوية للتحلل النوعي مقابل تركيز البروتين أو نسبة E:T وقارنها بالعينات الضابطة غير المستهدفة. هايدبيوشل، ج. ب.، وآخرونالفيروسات الباراميكسية للتعديل المناعي الموجه ضد الأورام: التصميم والتقييم خارج الجسم الحي. مجلة جوف (J. Vis. Exp). (2019).

يوضح هذا الفيديو مقايسة خلوية لتقييم النشاط المناعي المعدل والمحدد للهدف لبروتين محفز ثنائي الخصوصية للخلايا التائية (BTE) مشفر فيروسياً. يقوم BTE بربط الخلايا الورمية التي تعبر عن مستقبل مستهدف مع الخلايا التائية، مما يؤدي إلى تحلل الورم وإطلاق الإنزيمات. ويشير القياس اللوني، القائم على تحويل المادة الخاضعة للتفاعل، إلى تنشيط الخلايا التائية. وتؤكد شدة اللون الأعلى في العينة المختبرة حدوث الارتباط المناعي النوعي للمستقبل بوساطة BTE.

البروتوكول

1. تقييم الوظيفة المناعية للمنظمات المناعية المعزولة.
   1. يصف ما يلي بالتفصيل كيفية تقييم السمية الخلوية بوساطة الخلايا والمستحثة بواسطة رابط الخلايا التائية ثنائي الخصوصية (BTE) عن طريق مقايسة إطلاق إنزيم LDH (lactate dehydrogenase).
      1. حدد الظروف التي سيتم اختبارها خلال التجربة (انظر الشكل 1 كمثال). يمكن تنويع النقاط الزمنية (من ساعات إلى أيام)، وتركيزات المنظم المناعي (من pg/mL إلى µg/mL)، ونسب الخلايا المؤثرة إلى الخلايا الهدف (E:T) (بين 1:50 و 50:1، على سبيل المثال). قم دائمًا بتحضير العينات في ثلاث مكررات.
      2. تضمين عينات بدون بروتين BTE وبدون خلايا مؤثرة، وعينات ضابطة للإطلاق التلقائي لإنزيم LDH لأنواع الخلايا المنفردة (Tsp و Esp)، وعينة ضابطة للتحلل الأقصى للخلايا الهدف (Tmax) مع إضافة منظف قبل القراءة، وعينة ضابطة للوسط الغذائي فقط، وعينة ضابطة للحجم لـ Tmax.
         ملاحظة: يمكن أن تختلف أعداد الخلايا الهدف المطلوبة وأوقات الحضانة. قم بإجراء تشغيلات تجريبية أولية بدون خلايا مؤثرة ومنظمات مناعية لتحديد المعايير المثلى. قم بتضمين عينات Tsp و Tmax والعينات الضابطة المقابلة لها لتقييم أعداد الخلايا والنقاط الزمنية المختلفة.
      3. عزل الخلايا المناعية المؤثرة (على سبيل المثال، عن طريق طرد مركزي بتدرج الكثافة لدم الإنسان للحصول على الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) أو الاختيار السلبي للخلايا التائية الفأرية من الخلايا الطحالية للفئران).
      4. استزراع الخلايا الهدف (على سبيل المثال، 5 x 10³ لكل بئر) في طبق 96 بئر بقاع على شكل حرف U.
      5. إضافة البروتين المعزول بالتركيزات المطلوبة إلى العينات المعنية. إضافة الخلايا المناعية المؤثرة بالنسب المطلوبة. إضافة الوسط الغذائي ليصل الحجم الإجمالي إلى 100 µL لكل بئر.
      6. الحضانة للإطار الزمني المحدد، وعادة ما يكون بين 4 و 48 h (24 h لـ PBMCs غير المحفزة و 48 h للخلايا التائية الفأرية المعزولة حديثًا؛ يمكن تطبيق أوقات حضانة أقصر للخلايا المناعية المحفزة مسبقًا)، عند 37 °C و 5% CO₂.
      7. قبل 45 دقيقة من جمع العينات، أضف 10 µL من محلول التحلل 10x إلى الآبار التي تحتوي على عينات Tmax وعينات الوسط الغذائي الضابطة المقابلة. استمر في الحضانة.
      8. ترسيب الخلايا بالطرد المركزي عند 250 x g لمدة 4 min. نقل 50 µL من كل سائل طافٍ إلى طبق 96 بئر بقاع مسطح. لا تنقل الخلايا لتجنب LDH المرتبط بالخلايا.
      9. تحضير محلول الركيزة وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. أضف 50 µL إلى كل بئر واحضنها في درجة حرارة الغرفة [RT] في الظلام لمدة 30 min أو حتى تتحول عينات Tmax إلى اللون الأحمر الداكن.
      10. إضافة 50 µL من محلول الإيقاف إلى كل بئر. إزالة فقاعات الهواء عن طريق الطرد المركزي لمدة 1 min عند 4,000 x g، ويدويًا باستخدام إبرة مجوفة. قياس الامتصاص الضوئي عند 490 nm.
      11. حساب قيم نسبة التحلل النوعي % لكل عينة.
          1. حساب المتوسطات للمكررات من عينات الوسط الغذائي الضابطة مع وبدون محلول التحلل. اطرح القيم التي تم الحصول عليها من العينات التجريبية ومن عينات Tmax وعينات الإطلاق التلقائي الضابطة، على التوالي. استخدم هذه القيم المصححة للخلفية في الحسابات اللاحقة.
          2. حساب المتوسطات لعينات Tmax و Tsp و Esp الضابطة المصححة للخلفية. باستخدام هذه القيم المتوسطة، تعطي المعادلة التالية النسبة المئوية للتحلل النوعي لكل عينة:
             
          3. تمثيل قيم نسبة التحلل النوعي % مقابل تركيز البروتين أو نسبة E:T ومقارنتها بالعينات الضابطة غير المستهدفة.

النتائج

الشكل 1: النشاط السام للخلايا لبروتينات BTE المشفرة بفيروس الحصبة. تم تحضين الخلايا الورمية المستهدفة (5 x 10³ من خلايا B16-CD20-CD46 لكل بئر) مع خلايا T الفأرية بنسبة 1:50. تمت إضافة بروتينات BTE (مُحفزات الخلايا التائية ثنائية الخصوصية) التي تم تنقيتها مسبقاً من المادة الطافية لخلايا مصابة بـ MV(فيروس الحصبة)-H-mCD3xhCD20 بتركيزات محددة. تم تقييم التحلل النسبي للخلايا المستهدفة عن طريق مقايسة إطلاق LDH بعد 48 h. استُخدمت الخلايا التي تفتقر إلى المستضد المستهدف لـ BTE (خلايا B16-CD46) كمرجع لتقييم السمية الخلوية النوعية للمستضد. وتظهر في الشكل المتوسطات زائد الانحرافات المعيارية لثلاث مكررات تقنية لكل عينة. تحللت الخلايا التي تعبر عن المستضد المستهدف بشكل نوعي وبطريقة تعتمد على تركيز BTE. وتؤثر نقاوة منتج BTE ومستويات التعبير عن المستضد المستهدف على قتل الخلايا. في هذا المثال، تم تحقيق قتل خلوي نوعي بنسبة 15% عند تركيز BTE مرتفع نسبياً قدره 1 µg/mL. وتعد هذه قيمة نموذجية لمثل هذا الإعداد التجريبي مع فترات تحضين مشتركة طويلة وظروف استزراع غير مثالية للخلايا التائية. وفي إعدادات أخرى، تم تحقيق قتل نوعي يصل إلى 60% باستخدام بروتينات BTE المنقاة من المواد الطافية المصابة بـ MV، حيث وصلت إلى مرحلة الثبات عند تركيزات BTE تبلغ 100 ng/mL أو أعلى. وهذا يشير إلى أنه، وعلى عكس المتوقع، فإن الحد الأقصى لهذه المقايسة أقل من 100% من القتل النوعي، وهو ما يمكن تفسيره باختلاف حركية النمو في ضوابط Tmax مقارنة بعينات الاستزراع المشترك.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
وسط دولبيكو المعدل من وسط إيجل (DMEM)	Invitrogen، دارمشتات، ألمانيا	31966-021
مصل جنين البقر (FBS)	Biosera، بوسنس، فرنسا	FB-1280/500
كاناميسين	Sigma-Aldrich، ت اوف كيرشن، ألمانيا	K0129
B16-CD46/ B16-CD20-CD46	ج. هايدبوخيل، المركز الألماني لأبحاث السرطان في هايدلبرغ		متاحة عند الطلب
طقم قياس حيوية الخلايا باللون III (XTT)	PromoKine، هايدلبرغ، ألمانيا	PK-CA20-300-1000	يتضمن كاشف XTT
محلول دلبكو الملحي المنظم بالفوسفات (PBS)	Gibco Life Technologies، دارمشتات، ألمانيا	14190-094
أعمدة الطرد المركزي QIAquick Ni-NTA	QIAGEN، هيلدن، ألمانيا	31014
أطباق ذات 96 بئراً، قاع على شكل U	TPP، تراسادينجن، سويسرا	92097
أطباق ذات 96 بئراً، قاع مسطح	نيولاب (Neolab)، هايدلبرغ، ألمانيا	353072