استعادة الفيريونات المعدية من الخلايا المنقولة جينياً باستخدام حمض نووي ريبوزي (RNA) تخليقي مشتق من كروموسوم اصطناعي بكتيري

الملخص

تحديد قدرة الحمض الريبوزي النووي (RNA) على إحداث العدوى وحصيلة الفيروس: قم بزراعة خلايا كلية هامستر صغير-21 (BHK-21) في أطباق زراعة قطرها 150 ملم بكثافة 3 × 106 خلية/طبق لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2). ملاحظة: يتم الحفاظ على خلايا BHK-21 في وسط أساسي أدنى ألفا (alpha minimum essential medium) مضاف إليه 10% من مصل الجنين البقري، و2 ملي مولار من الغلوتامين، وفيتامينات، وبنسلين/ستربتومايسين. اشطف الطبقة أحادية الخلايا بـ 10 مل من المحلول أ البارد (137 ملي مولار NaCl، و2.7 ملي مولار KCl، و8.1 ملي مولار Na2HPO4، و1.5 ملي مولار KH2PO4). قم بفصل الخلايا عن الأطباق عن طريق المعالجة بـ 4 مل من تريبسين-إيثيلين ديامين رباعي حمض الأسيتيك (EDTA) بتركيز (0.25%)، واجمعها عن طريق الطرد المركزي عند 270 × g في جهاز طرد مركزي مكتبي لمدة دقيقتين. أعد تعليق كتلة الخلايا المترسبة باستخدام 50 مل من المحلول أ البارد في أنبوب مخروطي سعة 50 مل، وقم بطرد تعليق الخلايا مركزياً عند 270 × g لمدة دقيقتين. كرر إجراء الغسل هذا ثلاث مرات؛ وبعد الغسلة الأخيرة، أعد تعليق كتلة الخلايا المترسبة بكثافة 2 × 107 خلية/مل في المحلول أ. امزج حصة قدرها 400 ميكرولتر من تعليق الخلايا مع 2 ميكروغرام من الحمض الريبوزي النووي (RNA) الاصطناعي في كيوفيت بفتحة 2 ملم، وقم على الفور بإجراء التثقيب الكهربائي للمزيج باستخدام جهاز التثقيب الكهربائي تحت ظروف التثقيب الكهربائي المثلى: 980 فولت، وطول نبضة 99 ميكروثانية، و5 نبضات (الشكل 1C). اترك الخلايا المثقبة كهربائياً في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق، وانقلها إلى أنبوب دقيق سعة 1.7 مل يحتوي على 600 ميكرولتر من وسط زراعة كامل. قم بإعداد تخفيف تسلسلي بمقدار 10 أضعاف للخلايا المثقبة كهربائياً في 1 مل من وسط زراعة كامل، وازرع حصة قدرها 100 ميكرولتر من كل تخفيف على الطبقات أحادية الخلايا من خلايا BHK-21 غير المثقبة كهربائياً (5 × 105) في طبق مكون من 6 آبار. بعد 4-6 ساعات من الحضن، غطِّ الخلايا بطبقة من الأجاروز بتركيز 0.5% في وسط أساسي أدنى يحتوي على 10% من مصل الجنين البقري. احضن الأطباق لمدة 4 أيام عند 37 درجة مئوية مع 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2). قم بتصوير مراكز العدوى (اللويحات) عن طريق التثبيت بـ 7% من الفورمالديهايد والصبغ بـ 1% من البنفسج البلوري في 5% إيثانول (الشكل 2A). اختياري: افحص الخلايا المثقبة بالحمض الريبوزي النووي بعد 18-20 ساعة من ترانسفكشن (نقل الجينات) للكشف عن تعبير بروتين فيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV) عن طريق مقايسات التألق المناعي (الشكل 2B)، واجمع السوائل الطافية من الخلايا المثقبة بالحمض الريبوزي النووي عند 22 و40 ساعة بعد الترانسفكشن لتقدير عيار الفيروس عن طريق مقايسات اللويحات (الشكل 2C). يون، س. وآخرونالكروموسومات الاصطناعية البكتيرية: أداة في الجينوميات الوظيفية لدراسة فيروسات RNA ذات الشريط الموجب. مجلة التجارب المرئية (J. Vis. Exp.) (2015)

يوضح هذا الفيديو كيفية استعادة فيروس التهاب الدماغ الياباني المعدي من RNA اصطناعي تم نسخه من مستنسخ كروموسوم اصطناعي بكتيري. كما يبين كيفية إجراء التثقيب الكهربائي للخلايا باستخدام الـ RNA الاصطناعي، مما يسمح للجينوم الفيروسي بتوجيه إنتاج فيروسات جديدة. وتؤكد اللويحات الناتجة التي تشكلت في طبقات الخلايا أحادية الطبقة المصابة نجاح استعادة الفيروس المعدي.

البروتوكول

1. تحديد القدرة المعدية للـ RNA وإنتاجية الفيروس

1. قم بزراعة خلايا كلية الهامستر الصغيرة-21 (BHK-21) في أطباق زراعة قطرها 150 مم بكثافة 3 × 10⁶ خلية/طبق لمدة 24 ساعة عند 37 °C مع 5% CO₂.
   ملاحظة: يتم الحفاظ على خلايا BHK-21 في وسط ألفا الأساسي الأدنى (alpha minimum essential medium) مضافاً إليه 10% مصل جنين البقر، و2 mM جلوتامين، وفيتامينات، وبنسلين/ستريبتومايسين.
2. اشطف الطبقة أحادية الخلايا باستخدام 10 ml من المحلول أ (Solution A) البارد (137 mM NaCl و2.7 mM KCl و8.1 mM Na₂HPO₄ و1.5 mM KH₂PO₄). افصل الخلايا عن الأطباق بمعالجة باستخدام 4 ml من تريبسين-إيثيلين ديامين رباعي حمض الأسيتيك (EDTA) (0.25%)، واجمعها عن طريق الطرد المركزي عند 270 × g في جهاز طرد مركزي مكتبي لمدة 2 دقيقة.
3. أعد تعليق كتلة الخلايا باستخدام 50 ml من المحلول أ البارد في أنبوب مخروطي سعة 50 ml، ثم قم بطرد معلق الخلايا مركزياً عند 270 × g لمدة 2 دقيقة. كرر إجراء الغسيل هذا ثلاث مرات؛ وبعد الغسلة الأخيرة، أعد تعليق كتلة الخلايا بكثافة 2 × 10⁷ خلية/ml في المحلول أ.
4. امزج حصة مقدارها 400 µl من معلق الخلايا مع 2 µg من الـ RNA الاصطناعي في كيوفيت (cuvette) بفتحة 2 مم، وقم فوراً بإجراء التثقيب الكهربائي للمزيج باستخدام جهاز التثقيب الكهربائي تحت ظروف التثقيب الكهربائي المثلى: 980 V، وطول نبضة 99 µsec، و5 نبضات (الشكل 1C).
5. اترك الخلايا المثقبة كهربائياً في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق، ثم انقلها إلى أنبوب دقيق سعة 1.7 ml يحتوي على 600 µl من وسط زراعة كامل.
6. قم بتحضير تخفيف تسلسلي بمقدار 10 أضعاف للخلايا المثقبة كهربائياً في 1 ml من وسط زراعة كامل، وضع حصة مقدارها 100 µl من كل تخفيف على الطبقات أحادية الخلايا لخلايا BHK-21 غير المثقبة كهربائياً (5 × 10⁵) في طبق يحتوي على 6 آبار.
7. بعد 4-6 ساعات من التحضين، غطِّ الخلايا بطبقة من أغاروز 0.5% في وسط أساسي أدنى يحتوي على 10% مصل جنين البقر. حضّن الأطباق لمدة 4 أيام عند 37 °C مع 5% CO₂.
8. عاين المراكز المعدية (اللقحات/plaques) عن طريق التثبيت بـ 7% فورمالدهيد والصبغ بـ 1% كريستال فيوليت في 5% إيثانول (الشكل 2A).
   1. اختياري: افحص الخلايا المثقبة بالـ RNA بعد 18-20 ساعة من عفن التحول (transfection) للكشف عن تعبير بروتين فيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV) عن طريق مقايسات التألق المناعي (الشكل 2B)، واجمع الطافات من الخلايا المثقبة بالـ RNA بعد 22 و40 ساعة من عفن التحول من أجل معايرة الفيروس بواسطة مقايسات اللقحات (الشكل 2C).

النتائج

الشكل 1. نظرة عامة على استعادة الفيروسات المعدية من حمض نووي متمم (cDNA) كامل الطول لسلالة JEV SA₁₄-14-2 مجمعة في كروموسوم اصطناعي بكتيري (BAC). (A) تحويل قالب cDNA إلى شكل خطي. يتم قطع JEV BAC كامل الطول باستخدام XbaI ومعالجته بنوكلياز فول المونج (MBN). (B) تخليق نسخ RNA. يتم نسخ cDNA الخطي بواسطة RNA polymerase SP6 في وجود نظير القبعة m⁷G(5')ppp(5')A. (C) استعادة فيروسات JEV الاصطناعية. يتم نقل جزيئات RNA المنسوخة in vitro إلى خلايا BHK-21 عن طريق التثقيب الكهربائي، مما ينتج عياراً مرتفعاً من الفيروس الاصطناعي.

الشكل 2. القدرة المعدية النوعية للـ RNAs الاصطناعية المنسوخة من JEV BAC كامل الطول واستعادة الفيروس الاصطناعي. يتم إجراء تثقيب كهربائي وهمي لخلايا BHK-21 (Mock) أو تثقيبها كهربائياً باستخدام نسخ RNA المستمدة من كل من النسيلين المستقلين لـ JEV BAC كامل الطول (Cl.1 و Cl.2). (A) القدرة المعدية لـ RNA. يتم تغطية الخلايا بالأغاروز وتصبيغها بالبنفسج البلوري بعد 4 أيام من عفن التحول. يتم تحديد القدرة المعدية لـ RNA عن طريق مقاييس المراكز المعدية لتقدير كمية RNA المعدي التي تم إدخالها كهربائياً إلى الخلايا (اللوحة اليسرى). كما تظهر صور تمثيلية للمراكز المعدية (اللوحة اليمنى). (B) التعبير البروتيني. يتم زراعة الخلايا في شرائح غرف ذات 4 آبار. يتم تحليل التعبير عن البروتين الفيروسي في الخلايا المثقبة كهربائياً بـ RNA بعد 20 ساعة من عفن التحول (hpt) بواسطة مقاييس التألق المناعي باستخدام مصل أرنب أولي مضاد للبروتين غير الهيكلي 1 (NS1) ومضاد IgG من الماعز مضاد للأرنب ثانوي مقترن بـ Cy3 (باللون الأحمر). يتم صبغ النوى بـ 4',6-diamidino-2-phenylindole (باللون الأزرق). تظهر صور التألق المناعي متراكبة فوق صور التباين التداخلي التفاضلي المقابلة لها. (C) حصاد الفيروس. يتم زراعة الخلايا في أطباق زراعة بحجم 150 مم. يتم فحص إنتاج الفيريونات المعدية المتراكمة في طافات المزرعة للخلايا المثقبة كهربائياً بـ RNA بعد 22 و 40 ساعة من عفن التحول (hpt) بواسطة مقاييس اللويحات.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
وسط ألفا الأساسي الأدنى (Alpha Minimal Essential Medium)	Life Technologies (Gibco)	12561-049
أجاروز (Agarose)	Lonza	50004
أنبوب مخروطي (50 mL)	VWR	21008-242
كريستال فيوليت (Crystal Violet)	Sigma-Aldrich	C0775
طبق زراعة (150 mm)	TPP	93150
كوفيت (فجوة 2-mm)	Harvard Apparatus	450125
مصل بقري جنيني (Fetal Bovine Serum)	Life Technologies (Gibco)	16000-044
فورمالدهيد (Formaldehyde)	Sigma-Aldrich	F1635	سام ومسرطن
جلوتامين (Glutamine)	Life Technologies (Gibco)	25030-081
وسط أساسي أدنى (Minimal Essential Medium)	Life Technologies (Gibco)	61100-061
بنسلين/ستربتوميسين (Penicillin/Streptomycin)	Life Technologies (Gibco)	15070-063
كلوريد البوتاسيوم (Potassium Chloride)	Sigma-Aldrich	P3911
فوسفات بوتاسيوم أحادية القاعدة (Potassium Phosphate Monobasic)	Sigma-Aldrich	P9791
طبق سداسي الفجوات (Six-Well Plate)	TPP	92006
كلوريد الصوديوم (Sodium Chloride)	Sigma-Aldrich	S3014
فوسفات صوديوم ثنائية القاعدة (Sodium Phosphate Dibasic)	Sigma-Aldrich	S3264
تريبسين-EDTA (0.25%)	Life Technologies (Gibco)	25200-056
فيتامينات (Vitamins)	Sigma-Aldrich	M6895
حاضنة CO₂	Thermo Scientific	Heracell 150i
جهاز طرد مركزي مكتبي	Thermo Scientific	ST16R
جهاز تثقيب كهربائي (Electroporator)	Harvard Apparatus	ECM 830