Method Article

باستخدام الفحص ميكروأري عموم الفيروسي (Virochip) إلى الشاشة العينات السريرية لمسببات الأمراض الفيروسية

DOI:

10.3791/2536

⸱

April 27th, 2011

 ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco, 2Division of Infectious Diseases, University of California, San Francisco

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وVirochip هو ميكروأري عموم الفيروسية في وقت واحد تهدف إلى الكشف عن جميع الفيروسات المعروفة فضلا عن الفيروسات الجديدة على أساس التماثل تسلسل الحفظ. نحن هنا لشرح كيفية تشغيل مقايسة Virochip لتحليل العينات السريرية عن وجود الفيروسات المعروفة وغير المعروفة على حد سواء.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشخيص الأسباب الفيروسية العديد من الأمراض المعدية من الصعب نظرا للتنوع الفيروسات الكامنة في التسلسل ، وكذلك ظهور مسببات الأمراض الفيروسية الجارية الرواية ، مثل السارس التاجى و 2009 باء فيروس أنفلونزا H1N1 ، التي لا يمكن كشفها بواسطة الطرق التقليدية. لمواجهة هذه التحديات ، وضعنا في السابق والتحقق من صحة منصة ميكروأري عموم الفيروسي يسمى Virochip لديها القدرة على كشف جميع الفيروسات المعروفة فضلا عن المتغيرات الجديدة على أساس التماثل تسلسل الحفظ 1. باستخدام Virochip ، حددنا مجموعة كاملة من الفيروسات المرتبطة التهابات الجهاز التنفسي ، بما في ذلك حالات الأمراض الخطيرة غير المبررة في المرضى في المستشفى ، مع حساسية يعادل أو يفوق 05/02 التقليدية الاختبارات السريرية. كما تم Virochip المستخدمة لتحديد الفيروسات الجديدة ، بما في ذلك التاجى السارس 6،7 ، وهي رواية فيروسات الانف كليد 5 ، XMRV (أ الارتجاعي مرتبطة بسرطان البروستاتا) 8 ، bornavirus الطيور (سبب مرض الهزال في الببغاوات) 9 ، وcardiovirus الرواية في الأطفال الذين يعانون من أمراض الجهاز التنفسي والإسهال 10. وقد استدار الإصدار الحالي من Virochip إلى منصة ميكروأري اجيلنت وتتكون من 36000 تحقيقات ~ المستمدة من الفيروسات أكثر من 1500 ~ في بنك الجينات اعتبارا من شهر ديسمبر من عام 2009. نحن هنا لشرح الخطوات المتبعة في معالجة مقايسة Virochip من البداية الى النهاية (~ الزمنية 24 ساعة) ، بما في ذلك استخراج عينة الحمض النووي ، PCR التضخيم باستخدام بادئات عشوائية ، إدماج صبغة الفلورسنت ، وتهجين ميكروأري والمسح الضوئي والتحليل.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات للمقايسة Virochip ما يلي : (1) استخراج الحمض النووي من العينات السريرية ، (2) من الحمض النووي الريبي عكس النسخ واستخراج 2 الثانية الجديلة التوليف [كدنا] ، (3) PCR التضخيم من [كدنا] تستعد بشكل عشوائي ، (3) Cy3 التأسيس صبغة الفلورسنت ، (4) التهجين المواد المسمى إلى ميكروأري Virochip ، و (5) المسح والتحليل (الشكل 1). والبروتوكول هو مبين أدناه لشرح استخدام للمقايسة Virochip على عينة مسحة أنفية من طفل مع المرض تشبه الانفلونزا.

متواليات التمهيدي

5' - A التمهيدي GTTTCCCAGTCACGATA - (N 9) -3 "

5' - B التمهيدي GTTTCCCAGTCACGATA - 3 "

1. حمض النووي استخراج

  1. يجب أن يتم تنفيذ حمض النووي استخراج عينات من تحت مستوى السلامة الحيوية السريرية 2 (BSL - 2) أو أعلى الظروف ، حيث أن هذه العينات قد تكون معدية.
  2. ويتم نقل عينة مسحة أنفية في المتوسط ​​عقد الفيروسية. قسامة 200 ميكرولتر من العينة في أنبوب 1.5 مل microcentrifuge إيبندورف.
  3. اختياري : تمرير العينة من خلال مرشح 0.22 ميكرون (لتنقية للجزيئات فيروسية)
  4. اختياري : يمهد للمعالجة مع عينة الدناز (للحط من الحمض النووي الجيني المضيف وتنقية للمحمية ، وحمض النووي الفيروسي encapsidated) باستخدام توربو الدناز مجموعة (Ambion) في تعليمات الشركة الصانعة
  5. استخراج عينة باستخدام ZR الإنزيم الفيروسي RNA استخراج أو طقم أدوات Qiagen الفيروسات Ultrasens فقا لتعليمات الشركة المصنعة.

2. عكس النسخ و 2 الثانية الجديلة التجميعي [كدنا] ("جولة A")

  1. إضافة 1 UL 40 بمول / ميكرولتر التمهيدي ألف إلى 4 UL استخراج الحمض النووي الريبي. الحرارة إلى 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في thermocycler (مثل نظام GeneAmp PCR 9700) ومن ثم السماح لتبرد في درجة حرارة الغرفة 5 دقائق س.
  2. إضافة 5 ميكرولتر من مزيج رئيسية تتكون من 2 ميكرولتر العازلة RT 5X ، 1 ميكرولتر dNTP 12.5 ملم ، 1 ميكرولتر ماء ، 0.5 ميكرولتر DTT 0.1M ، و 0.5 ميكرولتر SSIII RT (Invitrogen). احتضان حوالي 42 درجة مئوية × 60 دقيقة.
  3. في thermocycler للبرمجة ، والحرارة إلى 94 درجة مئوية × 2 دقيقة (لإحباط رد فعل الناسخ العكسي) ، باردة إلى 10 درجة مئوية ، ونبض أجهزة الطرد المركزي ، ثم قم بإضافة 5 ميكروليتر Sequenase مزيج يتألف من 1 ميكرولتر العازلة Sequenase 5X ، 3.8 ميكرولتر المياه ، و 0.15 Sequenase ميكرولتر (USB المؤسسة). 2 الثانية لتجميع حبلا ، منحدر يصل من 10 درجة مئوية إلى 37 درجة مئوية على مدى 8 دقائق ، استمر 8 دقائق ، ثم الحرارة إلى 94 درجة مئوية × 2 دقيقة (لتعطيل Sequenase) وتبرد إلى 10 درجة مئوية (الانتظار).
  4. اختياري : يمكن أن تخزن الثالثة عينة [كدنا] في هذه النقطة -20 درجة مئوية.

3. PCR التضخيم من معبى عشوائي [كدنا] ("جولة باء")

  1. إضافة 5 UL الثالثة من عينة إلى 45 ميكرولتر من مزيج رئيسية تتكون من 5 ميكرولتر العازلة 10X PCR ، 1 ميكرولتر dNTP 12.5 ملم ، 1 ميكرولتر 100 B التمهيدي بمول / ميكرولتر ، 1 ميكرولتر KlenTaq لوس انجليس (سيغما) ، و 37 ميكرولتر المياه.
  2. تشغيل بروتوكول PCR على النحو التالي : 94 درجة مئوية ، 2 دقيقة → (25 دورات من 94 درجة مئوية ، 30 ق / 50 درجة مئوية و 45 ق / 72 درجة مئوية ، 1 دقيقة) → 72 درجة مئوية ، 5 دقائق → 10 درجة مئوية ( الانتظار)
  3. فحص العينة الثانية الثالثة على هلام 1.5 ٪ agarose الكهربائي. ومسحة من حوالي 200 -- ينبغي أن تكون 1000 سنة مضت تصور (الشكل 2A)

4. Cy3 التأسيس صبغ نيون

  1. اختياري : يمكن تسمية عينة أخرى مع الصبغة Cy5 الفلورسنت والمهجنة للميكروأري نفسه.
  2. لدمج AA - dNTP ، إضافة 5 ماي من العينة باء الثالثة إلى 45 ماي من مزيج رئيسية تتكون من 5 UL العازلة 10X PCR ، 1 UL 12.5 ملم AA - dNTP (Invitrogen) ، 1 بمول 100 UL / UL التمهيدي B ، 1 ، 1 UL KlenTaq لوس انجليس (سيغما) ، و 37 الماء المقدس. تشغيل بروتوكول PCR على النحو التالي : 94 درجة مئوية ، 2 دقيقة → (15 دورات من 94 درجة مئوية ، 30 ق / 50 درجة مئوية و 45 ق / 72 درجة مئوية ، 1 دقيقة) → 72 درجة مئوية ، 5 دقائق → 10 درجة مئوية ( الانتظار)
  3. تنظيف العينة الثالثة C مع الحمض النووي النظيفة والمكثف - 5 كيت (الإنزيم للبحوث) في تعليمات الشركة الصانعة. أزل في 10 ميكرولتر.
  4. إضافة 1 UL من بيكربونات 1M (سيغما) و 1 UL Cy5 (GE للرعاية الصحية) إلى نموذج C الثالثة.
  5. احتضان × 1 ساعة في الظلام.
  6. تنظيف العينة Cy3 المسمى مع الحمض النووي النظيفة والمكثف - 5 كيت (الإنزيم للبحوث) في تعليمات الشركة الصانعة. أزل في 12 ميكرولتر.

5. التهجين لميكروأري Virochip

  1. اختياري : استخدام 1.5 ميكرولتر لفحص تركيز [كدنا] وكمية صبغة أدرجت على معمل Nanodrop (لتطبيع عينات)
  2. في أنبوب الشريط PCR إضافة 1 ميكرولتر العازلة تجزئة 25X ، 5 ميكرولتر 5X عازلة تمنع ، 9.5 ميكرولتر (أو مقدار لتطبيع) من العينة Cy3 المسمى ، والمياه إلى وحدة تخزين ما مجموعه 25 ميكرولتر (اجيلنت)
  3. إضافة 25 ميكرولتر من 2X العازلة التهجين GEX (اجيلنت). تدور باستمرار لفترة وجيزة لإزالة الفقاعات.
  4. تحميل 40 ميكرولتر من العينة على الشريحة حشية.
  5. مكان مجموعة Virochip اجيلنت المطبوعة (جامعة Californiأ ، سان فرانسيسكو / اجيلنت) (الجانب ملحوظ "اجيلنت" لأسفل) على أعلى شريحة حشية وربط المسمار بإحكام.
  6. هجن بين عشية وضحاها في الفرن 65 درجة مئوية ، وتحديد السرعة ب 10 دورة في الدقيقة.
  7. لغسل المصفوفات ، سخن العازلة 2 (اجيلنت) إلى 37 درجة مئوية. اتخاذ ما عدا الماء طوقا شطيرة الشريحة / الصفيف في العازلة 1 (اجيلنت). غسل العازلة في 1 × 1 دقيقة. غسل العازلة في محمى 2 × 1 دقيقة. إزالة ببطء شريحة من 2 العازلة ، والحرص على تجنب فقاعات (استخدام kimwipe إلى الفتيل بعيدا رطوبة اضافية الحرص على تجنب ملامسة مباشرة نشطة من جانب مجموعة)
  8. مكان الانزلاق الى حامل الشرائح وإدراجها في مجموعة الماسح الضوئي.

6. Virochip مسح وتحليل

  1. مسح Cy3 المسمى في مجموعة 5 ميكرون أو 2 ميكرومتر وفقا لبروتوكول الصك المسح القياسي (الشكل 2B).
  2. تحليل ميكروأرس Virochip بالمعاينة البصرية ، وتحليل الكتلة ، أو تحليل Virochip البرنامج الآلي ، وتوقع E - 11. كل من هذه الطرق الثلاث ، تم الكشف عن فيروس الانفلونزا بسهولة في عينة مسحة أنفية (من طفل مع المرض تشبه الانفلونزا) (الشكل 2C)

7. ممثل النتائج :

عندما يتم بشكل صحيح البروتوكول ، ينبغي أن ينظر إليه على مسحة agarose هلام إستشراد بعد الخطوة الثالثة (ب) (الشكل 2A). سوف ميكروأري Virochip على منصة اجيلنت يكون من الصعب تحليلها بصريا (الشكل 2B) ، ولكن إذا كان الفيروس موجودا فإنه ينبغي تحديدها بسهولة عن طريق التفتيش البصري ، وتحليل الكتلة ، و / أو E - توقع الشكل (1C). ارتفعت يمكن قياس العينات مع كميات من الحمض النووي من الفيروس المعروفة (مثل فيروس فسيفساء التبغ ؛ MS2 عاثية) لتكون بمثابة مراقبة إيجابية للمقايسة.

figure-protocol-1
الشكل 1. وتتضخم عشوائيا التخطيطي لمعالجة ميكروأري Virochip والتحليل. الحمض النووي المستخرج من عينات سريرية ، المسمى مع الأصباغ الفلورية ، وتهجين للميكروأري Virochip. يتم فحص ميكروأرس في القرار ميكرومتر (2) وتحليلها باستخدام مجموعة متنوعة من الأدوات الحاسوبية ، بما في ذلك البريد التنبؤ بها.

figure-protocol-2
الشكل 2. الخطوات في مقايسة Virochip بعد التضخيم من قبل PCR عشوائي ، مسحة من 200 -- 1000 سنة مضت يمكن أن تصور من قبل الكهربائي للهلام (A) (B) تظهر ثلاثة ميكروأرس Virochip من صفائف 8 / شريحة زجاجية ، مع منطقة صغيرة. واحد في مهب ميكروأري المتابعة في أقحم في أسفل الزاوية اليمنى (C) التحليل الآلي ميكروأري الفيروسية باستخدام E - توقع الكشف عن وجود فيروس الأنفلونزا في العينة السريرية. درجة تشابه عالية (ق = 0.55) يناظر القيمة ع التي هي قريبة من الصفر ، مما يجعل هذا تنبؤ هام للغاية.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول Virochip كما هو موضح هنا أمر معقد ويتطلب البحث الدقيق فني ومهارة. تركيزات الكاشف الصحيح وشروط PCR ، ووضع العلامات ، وتهجين حاسمة. ويمكن للبروتوكول Virochip تعديلها بسهولة لاستيعاب تحليل الأنسجة المريضة عن طريق استخدام أنسجة طريقة استخراج مثل TRIzol (Invitrogen) لاستخراج الحمض النووي. يمكن إضافة أو حذف تحقيقات حسب الضرورة للحصول على الطيف الترددي المطلوب واتساع التغطية ، على سبيل المثال ، يمكن تصميم تحقيقات للكشف عن الأهداف nonviral مثل البكتيريا والفطريات ، وأضاف "على ذبابة". بعض التطبيقات للمقايسة Virochip حاليا قيد التطوير واسع الطيف يشمل التشخيص الفيروسي في المختبرات السريرية ، والتحقيق الفاشية ، وفحص نقاء الأدوية واللقاحات ، واكتشاف العوامل المسببة للأمراض الفيروسية الرواية.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر ديفيد وانغ ، Urisman أناتولي كيستلر آمي فيشر Kael ، تانغ باتريك ، وGreninger الكسندر لتطوير والتحسين الأولي للبروتوكول Virochip. ويدعم هذا العمل عن طريق منحة المعاهد الوطنية للصحة وK08 ابوت جائزة ديسكفري (لCC) ومعهد هوارد هيوز الطبي (لJLD).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف / المواد اسم كاشف / المواد
الاسباني 5' - GTTTCCCAGTCACGATA - (N9) -3 "
B التمهيدي 5' - GTTTCCCAGTCACGATA - 3 "
RT ماجستير ميكس (5 ميكرولتر) 2 ميكرولتر العازلة RT 5X
1 ميكرولتر dNTP 12.5 ملم (Invitrogen)
1 ميكرولتر المياه
0.5 ميكرولتر 0.1M DTT
0.5 ميكرولتر SSIII RT (Invitrogen)
Sequenase ميكس (5 ميكرولتر) 1 ميكرولتر العازلة Sequenase 5X
3.8 المياه ميكرولتر
0.15 Sequenase ميكرولتر (USB شركة)
الثالثة ب PCR ماجستير ميكس (45 ميكرولتر) 5 ميكرولتر العازلة PCR 10X
1 ميكرولتر dNTP 12.5 ملم (Invitrogen)
1 ميكرولتر 100 B التمهيدي بمول / ميكرولتر
1 ميكرولتر KlenTaq لوس انجليس (سيجما)
37 ميكرولتر المياه
الثالثة C PCR ماجستير ميكس (45 ميكرولتر) 5 UL العازلة PCR 10X
1 ميكرولتر dNTP 12.5 ملم (Invitrogen)
1 ميكرولتر 100 B التمهيدي بمول / ميكرولتر
1 ميكرولتر KlenTaq لوس انجليس (سيجما)
37 ميكرولتر المياه
التهجين العازلة (25 ميكرولتر) 1 ميكرولتر العازلة تجزئة 25X (اجيلنت)
5 ميكرولتر 5X العازلة حظر (اجيلنت)
9.5 ميكرولتر (أو مقدار لتطبيع) من العينة Cy3 المسمى
إضافة المياه إلى حجم ما مجموعه 25 ميكرولتر
اجيلنت Virochip ميكروأري المتوفرة من المختبرات تشيو ، UCSF ؛ انتظار الترخيص

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, D. Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).
  2. Chiu, C. Y. Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray. J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).
  3. Chiu, C. Y. Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult. Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).
  4. Chiu, C. Y. Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children. J Pediatr. 153, 76-83 (2008).
  5. Kistler, A. Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity. J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).
  6. Rota, P. A. Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. Science. 300, 1394-1399 (2003).
  7. Wang, D. Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays. PLoS Biol. 1, e2-e2 (2003).
  8. Urisman, A. Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant. PLoS Pathog. 2, 25-25 (2006).
  9. Kistler, A. L. Recovery of divergent avian bornaviruses from cases of proventricular dilatation disease: identification of a candidate etiologic agent. Virol J. 5, e25-e25 (2008).
  10. Chiu, C. Y. Identification of cardioviruses related to Theiler's murine encephalomyelitis virus in human infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14124-14129 (2008).
  11. Urisman, A. E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns. Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Viral Pathogen DetectionVirochip MicroarrayNucleic Acid ExtractionRandom Primer PCRFluorescent Dye LabelingMicroarray HybridizationAgilent ScannerClinical Sample AnalysisBroad Spectrum SurveillanceNovel Virus Discovery

Related Articles