فأري عزل جزيرة البنكرياس

البروتوكول

إعداد كولاجيناز

1. تزن خارج كولاجيناز الى 50 مل العازلة العزلة المخروطية وإضافة إلى جعل تركيز النهائي ، كما هو مبين في الجدول أدناه. حل كولاجيناز بواسطة vortexing.
   
   
   (12 + 2 الفئران الفئران الفئران اضافية = 14 × 5 مل / الماوس = 70 مل حل كولاجيناز الكل)
   
   
   (70 مل س 0.5 ملغ / مل أو 0.3 ملغ / مل = 35 ملغ أو 21 ملغ من مجموع كولاجيناز ف)
   
   
   

   سلالة	عمر	كولاجيناز P (ملغ / مل)	الوقت (دقيقة)
   C3H ، BALB / C ، B6	> 12 أسبوعا	0.8	17
   C3H ، BALB / C ، B6	<= 12 أسبوعا	0.5	13
   NOD والنرويج وNON	> 12 أسبوعا	0.8	17
   NOD والنرويج وNON	<= 12 أسبوعا	0.5	17

   
   
   
2. الاستغناء 2 مل من محلول كولاجيناز في كل قارورة من الزجاج ومكان على الجليد. تحميل كل حقنة 5 مل مع 3 مل من الإبرة كولاجيناز 30G إضافة ومكان في الجليد (في إعداد هود).

نفخ

1. قبل التشريح والتضحية الحيوانية خلع عنق الرحم. رش الجسم كله مع 70 ٪ من ETOH ، مما يجعلها رطبة تماما. جعل V - insision ابتداء من المنطقة التناسلية. تدوير الماوس حتى الذيل تواجه بعيدا عنك.
2. إزالة الأمعاء إلى الجانب الأيسر من الماوس مفتوحة. وسوف يعرض هذا البنكرياس والقناة الصفراوية المشتركة.
3. وضع المشبك مرقئ على جانبي الأمعاء الصغيرة ، حيث تستنزف القناة الصفراوية ، وترك الحل للجيب صغير للدخول كولاجيناز الأمعاء.
4. تضخيم البنكرياس من خلال القناة الصفراوية باستخدام إبرة حقنة 30G و 5 مل تحتوي على 3 مل من محلول كولاجيناز الباردة ، بدءا من المرارة.
5. إزالة البنكرياس من الجسم ووضعه في قارورة تحتوي على siliconized 2 مل من محلول كولاجيناز. وينبغي القيام بهذه الخطوة بسرعة وبطريقة نظيفة قدر الإمكان ، والتقليل من مجموعة من الأنسجة الدهنية والضام.
6. مكان القنينة على الجليد وكرر الخطوة 3 مع الماوس المقبل.

الهضم

1. ختم كل قنينة ووضعه في الحمام 37 درجة مئوية في المياه. لاحتضان 13-17 دقيقة (الوقت يختلف مع سلالة وعمر الحيوان).
2. بعد الوقت قد انقضى ، يهز قنينة بقوة. ينبغي أن ينهار البنكرياس.
3. صب كل هضم من خلال مصفاة كبيرة في بالوعة العقيمة دورق العقيمة مل 1000 و ماصة بقوة خارج الشاشة مع الغسيل العازلة. صرف 50 في هضم أنابيب conicals مل (3 مل أنبوب pancreata/50 : إذا ن = 12 ، واستخدام ما يكفي من غسل العازلة للتأهل الى النهائي حجم 200 مل والاستغناء عن لأنابيب مل 4x50). وينبغي أن يتم التخفيف السريع على الجليد وغير المرغوب فيها لتجنب جزيرة الهضم.
4. تدور باستمرار : بدء تشغيل أجهزة الطرد المركزي. عندما تصل إلى 1300 دورة في الدقيقة ، إيقاف تشغيله.
5. نضح لطاف ، وترك ~ 5 مل. أن يكون حذرا للغاية حتى لا نضح لبيليه.
6. Resuspend بيليه من خلال استغلال بقوة مع يدك ، ثم إضافة 50 مل من غسل العازلة.
7. تدور باستمرار : بدء تشغيل أجهزة الطرد المركزي. عندما تصل إلى 1300 دورة في الدقيقة ، إيقاف تشغيله.
8. Resuspend وبيليه وتغسل مع 5 مل من العازلة الغسيل.
9. نقل 5 مل إلى 15 مل المخروطية وتدور باستمرار ، على النحو الوارد أعلاه.
10. نضح في وطاف ممكن تماما. (قد يتسبب في المخزن المتبقي تغيير كثافة Ficoll).

Ficoll

نفذ بسرعة. على المدى الطويل Ficoll التعرض سامة بالنسبة للجزر.

1. تأكد مكسورة تماما حتى قبل بيليه مضيفا ficoll (الأنسجة مفصول من الصعب resuspend في ficoll).
2. Resuspend الكرية في 7 مل من ficoll ، والكثافة 1.108 ، التي vortexing بقوة.
3. طبقة فوق بعضها كثافة 2ml ficoll كل من الكثافة المتبقية في هذا الترتيب : 1.096 ، 1.069 ، 1.037 ثم.
4. تدور لمدة 15 دقيقة في 1800 دورة في الدقيقة في 4 درجات ، مع قطع!
5. التقاط الجزر من الطبقة الثانية باستخدام spoid (ع العقيمةالشافطة lastic). نقل كافة المجموعات إلى 50 مل تحتوي على 25 مل المخروطية ~ العازلة من البرد.
6. يغسل ، على النحو الوارد أعلاه ، و 3 مرات مع العازلة الغسيل (تكرار الخطوة 12-15).
7. الفشوت Resuspend في 20 مل RPMI - 1640 (التي تحتوي على 10 ٪ FCS والبنسلين والستربتوميسين ، HEPES ، MEM - NEAA) ومزيج بلطف. إزالة 100 UL عينة لفرز الأصوات.
8. نقل 100 UL إلى 35 ملم لوحة الشبكة ، التي تحتوي على 1 مل من وسائل الإعلام وdithizone 1 مل.
9. احتضان الجزر المتبقية في RPMI 1640 ، في 37 درجة مئوية ، و 7 ٪ CO ₂ حاضنة ، في 160 ملم مع لوحات ما مجموعه 30 مل من وسائل الاعلام / لوحة.