ممارسة قادر على إحداث موت الخلايا المبرمج في الخلايا المناعية. هناك حدود القياس المختلفة ، لا سيما فيما يتصل مقدار الوقت اللازم لعزل ومعالجة عينة من الدم قبل التقييم. تظاهر هو إجراء سريع ومينيملي لتحليل ممارسة النشاط الخلايا اللمفاوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الاصبع العصا منهجية أخذ عينات من الدم لتحديد بممارسة المستحثة الأبوطوزيس اللمفاويات
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
هو ممارسة التحفيز الفسيولوجية قادرة على إحداث موت الخلايا المبرمج في الخلايا المناعية. حتى الآن ، وقد تم تحديد أوجه القصور المختلفة مع قياس هذه الظاهرة ، لا سيما فيما يتصل مقدار الوقت اللازم لعزل ومعالجة عينة من الدم قبل تقييم موت الخلايا. وبسبب هذا ، فمن الصعب تحديد ما إذا كان يمكن ساهمت الزيادات التي أعلن عنها في موت الخلايا المبرمج للخلايا المناعية الأثر الفعلي لممارسة على النظام ، أو هي انعكاس للوقت وتجهيزها في نهاية المطاف من الضروري الحصول على هذا القياس. في هذه المقالة أن نبرهن إجراء سريع ومينيملي لتحليل ممارسة النشاط الخلايا اللمفاوية. خلافا لغيرها من التقنيات ، إضافة إلى الدم الكامل وحة الضد فور الحصول على العينة. بعد فترة الحضانة ، وlysed خلايا الدم الحمراء ومستعدون عينات لتحليلها. استخدام إجراء المعاينة الاصبع العصا يقلل من حجم الدم المطلوبة ، ويقلل من عدم الراحة لمواضيع.
البروتوكول
1. الإصبع عصا الدم أخذ العينات
- عادة ما يتم اتخاذ مجموعة من الدم الكامل في بقية لقياس خط الأساس (عادة بعد 10-15 دقيقة بقية الجذور) ، أثناء أو بعد المباراة على الفور وممارسة ، وطوال فترة ما بعد العملية (عادة من 1-3 ساعات بعد وقف ممارسة الرياضة).
- باستخدام الاحتياطات العالمي ، تعقيم لأول مرة مع الإصبع ايزوبروبيل 70 ٪.
- المقبل ، ثقب موقع باستخدام مشرط الآلي أو جهاز مماثل. على الرغم من أننا استخدام مشرط عيار 30 لتوفير الراحة للموضوع ، يمكن استخدام إبرة أكبر قياس.
- يمسح أول قطرة من الدم ، ومن ثم جمع الدم في أنابيب أو الشعرية microvettes تعامل مع الهيبارين لمنع تخثر الليثيوم.
2. Phenotyping الخلية وموت الخلايا المبرمج يلطخ
- أضف 10 ميكرولتر من الدم الكامل heparinized إلى لوحة الضد titred في المخزن 250 ملزم ميكرولتر (انظر الجدول 1 التخطيطي). وقد استخدمنا عامل إضعاف 01:20 مع النجاح ، ولكن ينبغي لكل مختبر عيار الكواشف لتحديد الحل الأفضل العمل.
لوحة جسم الجدول 1. لتحديد ممارسة النشاط موت الخلايا المبرمج في مجموعات فرعية الكريات البيض. وقد تم تعريف الخلايا في وقت مبكر عن طريق التعبير عن Annexin الخامس ، في حين تم تحديد الخلايا في وقت متأخر عن طريق وضع العلامات الايجابية مزدوجة مع Annexin V و 7 AAD. وكانت الخلايا نخرية Annexin V - 7 - وAAD + الخلايا فقط.أنبوب 1 أنبوب 2 أنبوب 3 أنبوب 4 خلايا أنبوب فقط Annexin V -- FITC Annexin V -- FITC Annexin V -- FITC الإنسان CD4 المضادة -- PE CD8 المضادة البشرية -- PE مكافحة الإنسان CD19 -- PE 7 - AAD 7 - AAD 7 - AAD CD45RA المضادة البشرية -- APC CD45RA المضادة البشرية -- APC
7 - 7 - AAD = أمينية أكتينوميسين D ، APC = Allophycocyanin ، CD4 = مساعد الخلايا اللمفية تي ، CD8 = الخلايا اللمفية تي القامع / السامة للخلايا ، CD19 = باء الخلايا اللمفية ، CD45RA خلية ساذجة = فرعية ، FITC ثيوسيانات فلوريسئين = = PE فيكوإيريترين. - يحضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة.
- الطرد المركزي في 1075 x ج لمدة 5-10 دقائق.
- صب ، إضافة 300 ميكرولتر خلايا الدم الحمراء الاحتياطي تحلل ، وتماما الدوامة.
- يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 300 ميكرولتر لوقف برنامج تلفزيوني RBC تفاعل تحلل.
- الطرد المركزي في 1075 x ج لمدة 5-10 دقائق.
- صب ، رف ، وإضافة 50 ميكرولتر العازلة ملزمة.
- تحليل من قبل التدفق الخلوي.
فمن المستحسن أن كحد أدنى ، يمكن الاستفادة من الضوابط التالية : أ الخلايا أنبوب فقط لتكون بمثابة الشاهد السلبي في الكشف عن تألق ذاتي الخلفية ، والأنابيب التي تحتوي على كل فرد ملون تألقي لتعيين التعويض الأولي خلال إعداد للتدفق عداد الكريات. بالإضافة إلى ذلك ، فقد استخدمنا حبات معيار التعويض بنجاح لاقامة تجاربنا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وأظهر جمع العينات مينيملي الداخلي والتحليل اللاحق لتحليل كل من المراحل المبكرة والمتأخرة من ممارسة النشاط الخلايا اللمفاوية. ومن الممكن أيضا أن تستبعد بوضوح تلك الخلايا ، والتي هي نخرية ، وأفكارك لا. هذا الإجراء يتغلب على السلبيات وعدم الراحة المرتبطة بزل الوريد الغازية من المنطقة المرفقية في نقطة زمنية متعددة قبل وأثناء وبعد التمرين مباشرة ، أو تأمين قسطرة لمدة نوبة ممارسة الرياضة. حيث من المحققين ، مثل هذه الإجراءات عادة ما تتطلب تدريبا متخصصا في الفصد ، والتي لا يكون لجميع الأف...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وأيد هذا البحث من قبل منحة كلية جديدة من مجلس المنح الدراسية في كلية جامعة كنتاكي الغربية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
| محلول ربط قياس التدفق الخلوي | eBioscience | 00-4222-26 | ||
| محلول تحلل كريات الدم الحمراء | eBioscience | 00-4333-57 | ||
| جهاز وخز | Accu Check Soft Touch | Roche Group | ||
| أنابيب شعرية | أنابيب شعرية مهبرنة | Chase Scientific Glass, Inc. | 501 | |
| جهاز طرد مركزي | GmC Lab | Gilson, Inc. | PMS-880 | |
| Annexin V-FITC مقترن | Biovision Inc. | K201-400-1 | ||
| CD4-PE مقترن | مضاد بشري، نسخة RPA-T4 | eBioscience | 12-0049-42 | |
| CD8-PE مقترن | مضاد بشري، نسخة OKT8 | eBioscience | 12-0086-73 | |
| CD19-PE مقترن | مضاد بشري، نسخة HIB19 | eBioscience | 12-0199-42 | |
| محلول صبغ الحيوية 7-AAD | eBioscience | 00-6993-50 | ||
| CD45RA-APC مقترن | مضاد بشري، نسخة HI100 | eBioscience | 17-0458-42 | |
| مقياس التدفق الخلوي | C6 | Accuri |
المراجع
- Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans. Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).
- Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes. Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).
- Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise. J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).
- Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes. Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).
- Wang, J. -S., Huang, Y. -H. Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men. Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).
- Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status. Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).
- Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise. Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
