نصف في هذا البروتوكول طريقة تتيح تصوير الميتوكوندريا في العصبونات الحية عبر المجهر الفلوري لفترات طويلة. ويتم تحقيق التصوير لفترات ممتدة من خلال التعبير عن بروتين فلوري مستهدف للميتوكوندريا بوساطة الفيروس البطيء (lentivirus)، وباستخدام حاضنة اقتصادية توضع فوق منصة المجهر تم تصميمها وبناؤها في مختبرنا.
مقالة منهجية
تعديل العمليات العصبية والنقل الميتوكوندريا : تصوير مباشر في الخلايا العصبية الحصين خلال فترات طويلة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لفهم العلاقة بين النقل الميتوكوندري والوظيفة العصبية، من الضروري مراقبة سلوك الميتوكوندريا في الخلايا العصبية المستنبتة الحية لفترات ممتدة1-3. أصبح هذا الأمر ممكناً الآن من خلال استخدام الأصباغ الحيوية والبروتينات الفلورية التي يمكن بواسطتها وسم مكونات الهيكل الخلوي والعضيات والهياكل الأخرى في الخلايا الحية، ومن ثم تصورها عبر مجهر الفلورة الديناميكي. على سبيل المثال، تم توصيف حركة الميتوكوندريا في الخلايا العصبية الودية للجنين في الدجاج باستخدام الصبغة الحيوية rhodamine 1234. وفي دراسة أخرى، تم تصور الميتوكوندريا في الخلايا العصبية في الدماغ الأمامي للجرذ عن طريق تعداء eYFP الموجه للميتوكوندريا5. ومع ذلك، فإن تصوير الخلايا العصبية الأولية على مدار دقائق أو ساعات أو حتى أيام يطرح عدداً من المشكلات، أبرزها: 1) الحفاظ على ظروف الاستنبات مثل درجة الحرارة والرطوبة والرقم الهيدروجيني pH خلال جلسات التصوير الطويلة؛ 2) الحصول على إشارة فلورية قوية ومستقرة لضمان جودة الصور المكتسبة والقياس الدقيق لشدة الإشارة أثناء تحليل الصور؛ 3) الحد من أوقات التعرض أثناء اكتساب الصور لتقليل التبييض الضوئي وتجنب التسمم الضوئي.
نصف هنا بروتوكولاً يسمح بمراقبة وتصوير وتحليل حركة الميتوكوندريا في الخلايا العصبية المزروعة من الحصين بدقة زمنية عالية وتحت ظروف مثالية لدعم الحياة. لقد قمنا بتصميم حاضنة ميسورة التكلفة توضع فوق منصة المجهر توفر تنظيماً جيداً لدرجة الحرارة وتدفقاً للغازات الجوية، كما تحد من درجة تبخر الوسط الغذائي، مما يضمن استقرار الـ pH والأسمولية. تتصل هذه الحاضنة، عبر خراطيم إدخال وإخراج، بحاضنة زراعة أنسجة قياسية توفر مستويات رطوبة ثابتة وجواً يحتوي على 5-10% CO2/هواء. يقدم هذا التصميم بديلاً فعالاً من حيث التكلفة للحاضنات المجهرية الأكثر تكلفة بكثير والتي لا تضمن بالضرورة حيوية الخلايا على مدى ساعات عديدة أو حتى أيام. ولتصوير الميتوكوندريا، نقوم بإصابة الخلايا بفيروس لينتي (lentivirus) يشفر بروتيناً فلوريسنتياً أحمر يستهدف الميتوكوندريا. يضمن ذلك الحصول على إشارة قوية ومستمرة، والتي تتيح لنا، بالتزامن مع استخدام مصدر ضوء زينون مستقر، تقليل أوقات التعرض أثناء التقاط الصور ومنع التبييض الضوئي والسمية الضوئية بشكل شبه تام. وتسمح فتحتا حقن في الجزء العلوي من الحاضنة الموجودة فوق المنصة بالإعطاء الحاد للنواقل العصبية والكواشف الأخرى التي تهدف إلى تعديل حركة الميتوكوندريا. باختصار، فإن التعبير عن بروتين فلوريسنتي أحمر مستهدف لعضية خلوية بوساطة فيروس لينتي، والجمع بين حاضنتنا فوق المنصة، ومجهر فلوريسنتي مقلوب تقليدي، وكاميرا CCD، ومصدر ضوء زينون، يسمح لنا بالتقاط صور زمنية (time-lapse) لنقل الميتوكوندريا في الخلايا العصبية الحية لفترات أطول من تلك الممكنة في الدراسات التي تستخدم الأصباغ الحيوية التقليدية وأنظمة دعم الحياة الجاهزة.
البروتوكول
1. وصف للحاضنة المثبتة فوق المنصة والمصنعة معملياً
يطرح الحفاظ على الخلايا الحية على منصة المجهر لفترات طويلة ثلاثة تحديات رئيسية: 1) التحكم في درجة الحرارة المحيطة وتنظيمها؛ 2) التحكم في الرطوبة، أي الحفاظ على محتوى الرطوبة في الغلاف الجوي البيئي؛ 3) الحفاظ على الرقم الهيدروجيني pH المناسب في وسط الزرع. وتعد قضايا "دعم الحياة" هذه بالغة الأهمية في التجارب التي تتضمن الملاحظة طويلة المدى للعصبونات المستزرعة، وهي خلايا حساسة بشكل خاص للتغيرات في درجة الحرارة والرقم الهيدروجيني pH. ونصف أدناه حاضنة بسيطة مصنعة مختبرياً توضع فوق المنصة، قمنا بتصميمها وبنائها للتصوير الحي للعصبونات على مدى فترات طويلة. وتتصل هذه الحاضنة، عبر دائرة مغلقة، بحاضنة قياسية لزراعة الأنسجة (Thermo Scientific, Asheville, NC)، والتي توفر غلافاً جوياً مستقراً ومسخناً (37°C) ورطباً بنسبة 10% CO2/90% هواء.
- غلاف الحاضنة: تم تصنيع جسم الحاضنة (الشكل 1(I, II)؛ A) باستخدام آلة تفريز C&C محوسبة من قطعة صلبة من بلاستيك الديلرين الأسود. تبلغ قياساته 97.74mm (طول) x 73.60mm (عرض) x 28.58mm (ارتفاع)، (بأبعاد داخلية تبلغ 96.74mm x 72.60mm x 27.58mm) مما يوفر حجماً مغلقاً يبلغ حوالي 19,370cm3. تم حفر ثقبين عند كل طرف من أطراف الغلاف وتزويدهما بوصلات نحاسية مسننة لاستيعاب خراطيم الدخول والخروج من/إلى حاضنة زراعة الأنسجة. تم تفريز فتحة مستطيلة بقياس 70.0mm x 43.0mm في الجزء العلوي من الغلاف للسماح بوضع نافذة من بلاستيك البولي كربونات (الشكل 1(I, II)؛ B). قاعدة الحاضنة (الشكل 1(I, II, III)؛ C؛ يظهر العرض العلوي والمقطع الجانبي بالتفصيل في أعلى اليسار)، المفرزة من سبيكة ألومنيوم مقاس 3/16"، تبلغ قياساتها 159.77mm (طول) x 109.86mm (عرض) x 3.175mm (عمق)، وهي مصممة لتناسب تجويف الإدراج في منصة Leica الآلية ذات الـ 3 أطباق (Model 11-522-068, Leica GmBh, Leipzig, Germany). تم تثبيت أربعة قوائم فولاذية ذات أسنان داخلية في زوايا القاعدة بواسطة براغي مسطحة الرأس مثبتة بشكل غاطس. وتوفر هذه القوائم نقاط تثبيت متينة لغلاف الحاضنة، الذي تم ثقبه عند كل زاوية لاستقبال القوائم (الشكل 1(II, III)؛ D). تم قص وتركيب حشية من السوربوثان (McMaster Carr, Inc., Elmhurst, IL) على القاعدة لتوفير سدادة عند الواجهة بين الغلاف والقاعدة. تُستخدم أربعة براغي نحاسية يدوية ذات تسنين يطابق تسنين القوائم لتثبيت الغلاف بالقاعدة (الشكل 1(II, III)؛ D). تم قطع ثقب بقطر 35.1mm مع حافة غاطسة رقيقة في مركز قاعدة الحاضنة لاستيعاب GBMs مقاس 35mm (الشكل 1(III)؛ E؛ التفصيل في أعلى اليسار)؛ كما تم تصميم قواعد إضافية لاستيعاب أحجام أخرى من أطباق الزرع.
- عناصر التسخين: تم تثبيت مقاومتين لتشتيت الحرارة بقيمة 10 Kohm (Digi-Key Corp., Thief River Falls, MN) على الجدران الداخلية لغلاف الحاضنة. وهذه المقاومات موصلة بمحول تيار مستمر 9V DC، 500mA متصل بمنظم درجة حرارة أحواض Alife بقوة 1000W (Carolina Pet Supply, Irmo, SC). يقوم مسبار سلكي موضوع عبر حشية في نافذة البولي كربونات لغلاف الحاضنة بالكشف عن درجة الحرارة المحيطة الداخلية وتحديد تدفق التيار إلى المقاومات. وبالتزامن مع حاضنة زراعة الأنسجة، توفر المقاومات إجراءً إضافياً للتحكم في درجة الحرارة المحيطة.
- نظام الغلاف الجوي ذو الدائرة المغلقة: لتوفير غلاف جوي مرطب ومسخن وثابت بنسبة 10%CO2/90% هواء، يتم توصيل الحاضنة الموجودة فوق المنصة، عبر خراطيم دخول وخروج (الشكل 1(I)؛ F, G)، بحاضنة زراعة أنسجة قياسية ذات غلاف مائي (الشكل 1(I)؛ H)؛ من طراز Forma Scientific Model 3154; Thermo Scientific, Inc., Asheville, NC). وقبل التوصيل مباشرة بالحاضنة الموجودة فوق المنصة، يمر خرطوم الدخول (الشكل 1(I)؛ F) عبر مضخة أحواض سمك قياسية (الشكل 1(I)؛ I؛ Lifegard QuietOne Model 1200, Pentair Aquatics, El Monte, CA) تم وضعها داخل صندوق بلاستيكي محكم من مادة ABS (الشكل 1(I)؛ J؛ Model 1150, Pelican Products, Inc., Torrance, CA) للحفاظ على دائرة مغلقة. تعمل هذه المضخة على تعزيز تدفق الهواء المستمر من حاضنة زراعة الأنسجة إلى الحاضنة الموجودة فوق المنصة. وبعد مرحلة المضخة، يمر خرطوم الدخول إلى دورق إرلنماير سعة 1500ml (الشكل 1(I)؛ K) يعمل كمخمد لتقليل انتقال الاهتزازات من المضخة إلى الحاضنة الموجودة فوق المنصة. ويزود خرطوم الخروج (الشكل 1(I)؛ G) الممتد من الحاضنة الموجودة فوق المنصة إلى حاضنة زراعة الأنسجة (الشكل 1(I)؛ H) بمروحة كمبيوتر مغلقة (الشكل 1(I)؛ L)، والتي تهدف أيضاً، مثل المضخة، إلى تعزيز تدفق الهواء المستمر.
- غطاء غشاء PFTE لـ 35mm GBM: قبل وضع المزرعة العصبية في الحاضنة الموجودة فوق المنصة للتصوير، يتم تزويد 35mm GBM بغطاء غشائي خاص (الشكل 1(II, IV)؛ M؛ التفصيل موضح في أعلى اليمين) للسماح بتبادل الغازات وفي الوقت ذاته تقليل تبخر وسط الزرع. يتكون هذا الغطاء من حافة بلاستيكية من الديلرين وورقة مقصوصة مسبقاً من غشاء PFTE (Teflon; American Durafilm Co., Inc., Holliston MA) تم شدها فوق الحافة وتثبيتها بواسطة حشية فيتون تنزلق في قناة غاطسة على طول جانب حافة بلاستيك الديلرين.
- منافذ الحقن: تم حفر ثقبين في نافذة البولي كربونات (الشكل 1(II)، التفصيل المركزي، الأسهم الصفراء بالقرب من B) للحاضنة الموجودة فوق المنصة. وتم تزويد هذه الثقوب بنهايات محاقن Hamilton من الفولاذ المقاوم للصدأ لتوفير منافذ حقن لإعطاء 5-HT و DA ومختلف محفزات ومثبطات المستقبلات، وكواشف أخرى أثناء تجربة معينة.
2. تحضير المزارع الأولية لخلايا الحصين
يتم تنفيذ جميع الأعمال إما في غطاء تدفق صفائحي من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية (BSL2) أو في طاولة تدفق صفائحي. يتم عزل العصبونات الحصينية الأولية من أجنة الجرذان في اليوم الجنيني E18 وفقاً للإجراءات القياسية6-7، وتُزرع في وسط خالٍ من المصل تم تكييفه بواسطة الخلايا النجمية القشرية الأولية. يتم تحضير الخلايا الدبقية وفقاً للطرق المنشورة7. يتكون الوسط المكيف من DMEM منخفض الجلوكوز، مضافاً إليه البرولين (1.76 ug/ml)، والأسبرجين (0.83 ug/ml)، وفيتامين B12 (0.34 ug/ml)، والجلوكوز (20mM)، وBSA الغني بالدهون (0.5 mg/ml)، و2% من B278-10. لا تُضاف أي مضادات حيوية إلى الوسط لأنها قد تتداخل مع عملية نسخ الجينات العصبونية.
- قم بتغطية الجزء المركزي من الغطاء الزجاجي لطبق زراعة ذي قاعدة زجاجية (GBM) بمقاس 35mm بمحلول poly-D-lysine بتركيز (0.05 mg/ml في PBS)، واتركه لمدة ساعتين عند درجة حرارة 37°C. ثم اسحب محلول poly-D-lysine، واتركه ليجف لمدة 20 دقيقة داخل غطاء تدفق صفائحي من المستوى BSL2. قم بتغطية جزء الغطاء الزجاجي المطلي بـ poly-D-lysine في الـ GBM بمحلول laminin بتركيز (0.01 mg/ml في PBS)، واتركه لمدة 40 دقيقة كحد أدنى قبل إزالة محلول laminin الزائد. ثم اتركه جانباً لمدة 20 دقيقة.
- قم بتشريح منطقة الحصين (hippocampi) من أدمغة أجنة الجرذان في اليوم الجنيني E18، وقم بتفكيك الخلايا كما هو موضح في Current Protocols in Neuroscience6.
- خفف الخلايا المفككة في وسط نمو لتحقيق كثافة تبلغ 110,000 خلية لكل GBM. احسب التركيز المطلوب للخلايا في الخليط الرئيسي بناءً على عدد أطباق GBM التي ستقوم بتحضيرها.
- ضع أطباق GBM المزروعة في حاضنة مضبوطة عند درجة حرارة 37°C وفي خليط غازي يتكون من 10% CO2/90% هواء.
- بعد مرور ثلاثة إلى خمسة أيام، اعتماداً على ظروف نمو العصبونات، أضف arabinoside C بتركيز (0.14 ng/ml) إلى المزارع لتثبيط تكاثر الخلايا الدبقية.
- اترك المزارع لتنمو لمدة أسبوعين قبل إصابتها بالفيروس البطيء (lentivirus). خلال هذه الفترة، استبدل ثلث حجم الوسط في كل GBM بوسط نمو جديد كل ثلاثة أيام. لا تتجاوز هذه الكمية من الوسط، لأن ذلك قد يؤدي إلى صدمة أسموزية وموت الخلايا.
3. تحضير الفيروس lentivirus المؤتلف الذي يشفر البروتين الفلوري الأحمر
بالنسبة للباحثين الذين لا تتوفر لديهم مرافق لإنتاج الفيروسات البطيئة المؤتلفة، فإن خيار الإنتاج المخصص من خلال جهة تجارية، مثل System Biosciences (Mountain View, CA)، يعد خياراً متاحاً.
يتم إدراج جين لبروتين فلوري أحمر مستهدف للمتقدرات (MitoTurboRFP؛ Axxora LLC, San Diego, CA) في فيروس نقص المناعة لدى القطط المؤتلف ذاتي التعطيل، تحت التحكم النسخي للمعزز من محفز الجين المبكر الفوري الرئيسي للفيروس المضخم للخلايا11. ويتم إنتاج الفيروسات البطيئة المؤتلفة عن طريق تعداء خلايا 293T عابرًا.
- يتم زراعة خلايا 293T بكثافة تبلغ ~75,000 cells/ cm2، وفي اليوم التالي، تُجرى عملية ترنسفكشن مشتركة للخلايا باستخدام بلازميدات تشفر الناقل الفيروسي المؤتلف، وجينات FIV gag و pol، وجين البروتين السكري G لفيروس التهاب الفم الحويصلي (vesicular stomatitis virus)، وذلك باستخدام PolyJet (SignaGen Laboratories, Gaithersburg, MD). يُستخدم إجمالي 12 ug من DNA (4.8 μg من الناقل الفيروسي، و 4.8 μg من بلازميد gagpol، و 2.4 μg من بلازميد VSV G) لكل طبق زراعة مقاس 10cm من خلايا 293T.
- بعد مرور 24 ساعة، يتم سحب وسط الزراعة وغسل الخلايا بمحلول هانكس الملح المتوازن (Hanks balanced salt solution) الخالي من الفينول الأحمر لإزالة DNA المتبقي. يُضاف 10ml من الوسط العصبي القاعدي الخالي من المصل والمكمل بـ 50μg/ml من BSA الغني بالدهون و Glutamax.
- في اليوم التالي، يتم جمع السائل الطافي، وترشيحه عبر مرشح بمسامية 0.2 micron منخفض الارتباط بالبروتين، ثم إضافته إلى وحدة ترشيح فائق من البولي إيثر سلفون Vivaspin 20 (Sartorius, Concord, USA). تُعالج وحدة Vivaspin مسبقاً عن طريق الغسل المتسلسل باستخدام إيثانول 70%، ومياه مخصصة للزراعة النسيجية، ومحلول ملحي منظم بالفوسفات. يتم تركيز السائل الطافي المحتوي على الفيروس بمقدار ~50 ضعفاً عن طريق الطرد المركزي عند 1500xg لمدة 30 دقيقة. يتم تقسيم مستحضر الفيروس إلى حصص (aliquots) وتخزينه في N2 السائل.
- يُقدر مقدار الفيروس عن طريق إصابة خلايا جرذ B104 بحصة من الفيروس المركز، وقياس تعبير البروتين الفلوري بواسطة قياس التدفق الخلوي (flow cytometry) بعد 72 ساعة. توفر نسبة الخلايا الموجبة تقديراً لمقدار الفيروس، أي حجم الفيروس المركز اللازم للحصول على تعبير البروتين الفلوري في عدد معين من العصبونات الأولية.
4. عدوى العصبونات المستزرعة
يتم إصابة مستنبتات العصبونات الحصينية في اليوم 14 من الزراعة in vitro ببساطة عن طريق إضافة كمية الفيروس المقدرة لإصابة ما يصل إلى 50% من جميع العصبونات بناءً على بيانات قياس التدفق الخلوي. لا يتم استخدام مادة polybrene. يتم الحفاظ على المستنبتات لمدة 3 أيام قبل التحقق من تعبير البروتين الفلوري. إذا كانت الإشارة ضعيفة جداً، يتم إعادة المستنبت إلى حاضنة زراعة الأنسجة وإعادة اختباره بعد عدة أيام.
5. الصيانة العامة لنظام دعم الحياة ذي الدائرة المغلقة
- للحفاظ على الرطوبة المناسبة، تأكد من فحص الغلاف المائي للحاضنة بشكل دوري وملئه عند الضرورة. واحرص على وضع صينية من الفولاذ المقاوم للصدأ أو الألومنيوم داخل الحاضنة تحتوي على حجم صغير من الماء (بعمق 25mm) ومادة مضادة للطحالب.
- عند الضرورة، قم بتنظيف خراطيم المدخل والمخرج لدائرة غلاف الحاضنة الجوي عن طريق تفريغ المياه المتجمعة من أنابيب التجميع. قم بشطف الخراطيم دورياً باستخدام 70% ethanol.
6. تركيب غطاء الغشاء على GBM والوضع في الحاضنة ذات الرؤية العلوية
- قبل وضع وحدة GBM داخل الحاضنة المثبتة أعلى المنصة، استبدل الغطاء البلاستيكي بالغطاء المغطى بالغشاء داخل غطاء زراعة الأنسجة. وبمجرد إتمام ذلك، يمكنك نقل وحدة GBM المغطاة إلى المجهر.
- ضع وحدة GBM ذات الغطاء المغطى بالغشاء بعناية في الفتحة الغائرة الموجودة في قاعدة الحاضنة المثبتة أعلى المنصة. ولتجنب هز وحدة GBM، تأكد من أن القاعدة مثبتة بالفعل في مكانها على منصة المجهر؛ وبما أن تثبيت القاعدة في المنصة يتم بصعوبة نوعاً ما، فمن الأفضل وضع وحدة GBM بعد استقرار القاعدة في موقعها.
- قم بمحاذاة غطاء الحاضنة مع الأعمدة الفولاذية الموجودة في قاعدة الحاضنة ثم أنزل الغطاء فوق القاعدة. أحكم ربط براغي التثبيت اليدوية حتى يتم تحقيق إغلاق محكم بين الغطاء والقاعدة.
7. الحصول على الصور
لاحظ أن غالبية منصات برمجيات التصوير المتاحة تمتلك وظائف مماثلة عبر مجموعة واسعة من المجاهر والأجهزة ذات الصلة. تتوفر مجموعة متنوعة من منصات برمجيات الحصول على الصور وتحليلها، بما في ذلك MetaMorph والبرامج المصممة لأنواع محددة من المجاهر، مثل Leica Application Suite وNIS-Elements من شركة Nikon وAxioVision من شركة Carl Zeiss. في هذا البروتوكول، نصف إجراءات الحصول على الصور وتحليلها التي أجريناها باستخدام Slidebook 5 (Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO). ومع ذلك، يمكن تكييف الخطوات المكونة لكل عملية موصوفة في هذا البروتوكول بسهولة لتناسب استخدام مجموعة متنوعة من البرامج الأخرى.
وصف المجهر الفلوري المقلوب، وتكوينات المرشح، وكاميرا CCD، ومصدر ضوء الزينون، وبرنامج التصوير:
للتصوير الديناميكي للنقل الميتوكوندري في عصبونات الحصين، نستخدم مجهراً فلورياً مقلوباً من طراز Leica DMI-6000B ومنصة آلية طراز Model 11-522-068 (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Germany) مجهزة بكاميرا Cooke Sensicam EQ CCD (The Cooke Corporation, Romulus, MI)، وعجلة مرشحات ووحدة تحكم من طراز Sutter Lambda 10-2 (Sutter Instrument Company, Novato, CA)، ومصدر ضوء زينون بقدرة 300W من طراز Sutter DG-4. ولتصوير الميتوكوندريا المَصْبُوغَة بالبروتين الفلوري MitoTurbo Red، نستخدم مزيجاً من مرشح 555nm عند مصدر الضوء DG-4 للإثارة، ومرشحات 600nm (الذروة؛ Sedat Quad Beamsplitter Model 86100bs مُركَّب في مكعب مرشحات Leica DM series، Chroma Technology Corp., Bellows Falls, VT) و617nm عند المجهر وعجلة المرشحات، على التوالي، للانبعاث.
لغرض الحصول على الصور وتحليلها، نستخدم حزمة برمجيات التصوير المجهري الرقمي Slidebook 5. وتعد هذه الحزمة نظاماً شاملاً يتيح التحكم الآلي الكامل في المجهر، والمنصة، وعجلة المرشحات، والكاميرا، ومصدر الضوء أثناء عملية الحصول على الصور، بالإضافة إلى توفير مجموعة متنوعة من وحدات معالجة وتحليل الصور.
نقدم أدناه تعليمات محددة وخطوة بخطوة لالتقاط صور الفاصل الزمني للميتوكوندريا المتحركة في عصبونات مُعلمة بالفلورسنت باستخدام برنامج Slidebook 5.
- تأكد من تشغيل المجهر، ووحدة تحكم عجلة المرشحات، ومصدر الضوء، وكاميرا CCD قبل فتح برنامج Slidebook 5.
- للتصوير الحي للميتوكوندريا، انتقل إلى عدسة شيئية غمر زيتية بقوة 63X، ثم اخفض برج العدسات بما يكفي لتوفير إمكانية الوصول إلى العدسة الشيئية أسفل منصة المجهر (والحضّانة الموجودة أعلى المنصة)، ثم ضع الزيت بعناية مباشرة على سطح العدسة الشيئية. افتح نافذة التركيز بالنقر على أيقونة 'Focus Window' في شريط أدوات Slidebook. في نافذة التركيز، قم بتشغيل مصباح المجال المضيء عن طريق تحريك المنزلق المسمى 'lamp' لضبط كثافة المجال المضيء إلى مستوى مناسب. ثم قم بضبط التركيز على مجال من الخلايا وابحث عن الخلية المستهدفة.
- من علامة التبويب 'Scope'، اختر الفلور 'CY3'. باستخدام العينات العينية، وتحت الإضاءة الفلورية، حدد مستوى التركيز للميتوكوندريا في الخلايا التي تم وسمها ببروتين Mito TurbRed. بمجرد ضبط التركيز عبر العينات العينية، انتقل إلى كاميرا CCD وأعد ضبط التركيز إذا لزم الأمر.
- افتح نافذة التقاط الصور بالنقر على أيقونة 'Image Capture' في شريط أدوات Slidebook. بدءاً من وقت تعرض أولي قدره 100ms، حدد وقت التعرض الأمثل باستخدام زري 'Test' و'Find Best'؛ أو بدلاً من ذلك، يمكنك استخدام زر 'Once'. تذكر أن وقت التعرض يجب أن يوفر توزيعاً كافياً للكثافة عبر مجال الصورة بالكامل (على سبيل المثال 0-2500؛ كما يظهر في المدرج التكراري أسفل نافذة التقاط الصور) خلال أقل مدة زمنية ممكنة (على سبيل المثال 200-800ms).
- قبل بدء التقاط الصور بفاصل زمني (time-lapse)، افتح نافذة 'Advanced' بالنقر على علامة التبويب 'Advanced' الموجودة داخل نافذة التقاط الصور. ابحث عن علامة التبويب 'Focus'، وقم بتفعيل خيار 'Autofocus during time-lapse/multipoint captures'، واضبط إعدادات التركيز التلقائي لالتقاط الصور بفاصل زمني. بشكل عام، نستخدم المعايير التالية للتركيز التلقائي: تحديث التركيز كل 2-3 إطارات؛ واختيار الفلور المستخدم لتصوير الميتوكوندريا الموسومة (أي CY3) كقناة للتركيز التلقائي؛ ونطاق بحث إجمالي قدره 2 um للتكبير 63x.
- في نافذة 'Capture'، وضمن مربع 'Capture Type'، قم بتفعيل خيار 'Timelapse' وحدد فاصل التصوير المطلوب ومدة جلسة التصوير ضمن خيارات 'Timelapse Capture'. في دراساتنا حول تأثيرات المعدلات العصبية على نقل الميتوكوندريا، تم إجراء التصوير بفاصل زمني في جلسات مدتها ساعة واحدة، تم خلالها التقاط ما مجموعه 360 صورة بفواصل زمنية قدرها 10 ثوانٍ بين الصور.
- ابدأ التقاط الصور بفاصل زمني بالنقر على زر 'Start' الموجود في أسفل الجانب الأيمن من نافذة 'Capture'.
- بعد جلسة التصوير الأولية أو الضابطة، قم بإعطاء النواقل العصبية والكواشف الأخرى عبر المنافذ العلوية للحضّانة الموجودة أعلى المنصة وابدأ جلسة تصوير جديدة.
8. تحليل الصور
- افتح ملف الصورة الذي تم حفظه بعد جلسة التصوير الأخيرة.
- يمكن تمييز الميتوكوندريا الفردية في سلسلة صور الفاصل الزمني إما تلقائيًا أو يدويًا من خلال استخدام وظائف القناع (masking functions) المتوفرة في برنامج Slidebook 5.
- من قائمة 'Mask'، اختر 'Segment' من شريط القوائم. ومن خلال تحريك خطي العتبة الدنيا والعليا في أداة 'histogram'، يتم تظليل جميع الجسيمات باللون الأزرق في الصورة بأكملها، بما يغطي جميع الميتوكوندريا الموجودة في العينة، مع الحفاظ على الجسيمات منفصلة قدر الإمكان. ثم قم بتطبيق القناع على سلسلة الصور بأكملها.
- قم بإنشاء قناع ثانٍ (من قائمة 'Mask'، اختر 'Create') يغطي الصورة بأكملها باستثناء العملية المستهدفة التي تم تمييز الجسيمات فيها بواسطة القناع السابق. يتم تنفيذ ذلك أولاً باستخدام أداة 'pencil' بأقصى سمك لتحديد حدود المناطق الواقعة خارج العملية، ثم باستخدام أداة 'paint bucket' لملء المناطق المحددة. قم بتطبيق هذا القناع على سلسلة الصور بأكملها.
- ضمن قائمة "Mask"، اختر "Mask Operations" ثم قم بإجراء عملية "Minus"؛ أي طرح القناع الثاني من القناع الأول (الصورة بأكملها باستثناء العينة المعالجة). سيؤدي ذلك إلى إنشاء قناع ثالث يتم فيه إبراز العينة المعالجة محل الاهتمام فقط. لاحظ أنه سيتم تطبيق هذا القناع الجديد على سلسلة الصور بأكملها.
- ضمن "التوضيحات" (Annotations)، حدد "معرفات الكائنات" (Object IDs).
- تحقق من استمرارية التعيينات الرقمية للميتوكوندريا الفردية المقنعة من خلال المراجعة اليدوية لسلسلة الصور (في برنامج Slidebook 5، يمكن استخدام أزرار "تشغيل" و"الإطار التالي" و"الإطار السابق" الموجودة أسفل نافذة الصورة لهذا الغرض).
- اختر علامة التبويب 'Mask' من شريط القائمة. ومن قائمة 'Mask'، اختر 'Particle Tracking' ثم قم بتشغيل 'Basic Particle Tracking' لإنشاء 'Path Statistics'، بما في ذلك إحداثيات المركز الهندسي لكل ميتوكوندريا محجوبة.
- يتم حساب المسافة التي قطعتها كل ميتوكوندريا بين إطارين متتاليين من الصور بناءً على إحداثيات كل جسيم في كل إطار.
- في دراساتنا السابقة حول تأثير المُعدِّلات العصبية على حركة الميتوكوندريا، حددنا ثلاث مجموعات متميزة من الميتوكوندريا: "ساكنة"، و"تذبذبية"، و"متحركة اتجاهياً". فإذا تحركت الميتوكوندريا مسافة أقل من 0.2 ميكرومتر (أو 2 بكسل، تحت تكبير 63X؛ حيث 1 بكسل = 0.10235 ميكرومتر) خلال ساعة واحدة، تُصنف على أنها "ساكنة". أما إذا تحركت الميتوكوندريا مسافة 0.2 ميكرومتر على الأقل، ولكن أقل من 2.5 ميكرومتر، في دورة أمامية-رجعية، فتُعرف بأنها "تذبذبية". وأخيراً، إذا قطعت الميتوكوندريا مسافة صافية تزيد عن 2.5 ميكرومتر في اتجاه واحد، تُصنف على أنها متحركة اتجاهياً. وموضح في الشكل ٢ مدرج تكراري يوضح حركة جميع الميتوكوندريا الموُسمة في تجربة نموذجية، بالإضافة إلى مخطط دائري يوضح التوزيع المئوي للمجتمعات الثلاثة المتميزة من الميتوكوندريا.
- تُحسب السرعة المتوسطة لكل ميتوكوندريا وفقاً لإجمالي المسافة المقطوعة خلال جلسة تصوير محددة. ويُحسب متوسط سرعة مجموعة الميتوكوندريا عن طريق جمع السرعات الفردية وقسمتها على العدد الإجمالي للميتوكوندريا التي تم تتبعها.
- يمكن إنشاء المخططات الزمنية المكانية (Kymographs) باستخدام وحدة برمجية متوفرة في Slidebook 5. باستخدام وظيفة "القناع" (Mask)، ارسم خطًا رفيعًا يمتد عبر كامل طول الاستطالة المعنية (مثل المحور العصبي)؛ مع الحرص على أن يمر الخط عبر أكبر عدد ممكن من المراكز الميتوكوندرية. انتقل إلى علامة تبويب "القناع" (Mask) في شريط القائمة، واختر "العمليات المتقدمة" (Advanced Operations)، ثم "تحليل المنحنى السلس" (Smooth Curve Analysis). استخدم الإعدادات الافتراضية لتحليل المنحنى السلس أو قم بتخصيصها حسب الرغبة. قم بتشغيل وحدة تحليل المنحنى السلس. وفي نهاية التحليل، سيظهر المخطط الزمني المكاني لجلسة التصوير.
- انتقل إلى شريط القائمة واختر 'عرض' (View)، ثم 'تصدير TIFF' (Export TIFF).
- افتح ملف .tif المحفوظ الذي يحتوي على المخطط الزمني المكاني (kymograph) في برنامج Photoshop أو أي برنامج مشابه لمعالجة الصور، وقم بتحويل الصورة إلى تدرج رمادي معكوس.
9. النتائج التمثيلية
من خلال تتبع وتحليل حركة الميتوكوندريا في الخلايا العصبية المستزرعة في الحصين، أثبتنا وجود صلة بين التعديل العصبي ونقل الميتوكوندريا. وتحديداً، وجدنا أن السيروتونين (5-HT) أو ناهض مستقبل 5-HT1A، وهو 8-OH-DPAT، يحفز حركة الميتوكوندريا (الشكل 2A-C)8، بينما يثبط الدوبامين (DA) أو ناهض مستقبل D2، وهو البروموكريبتين، حركة الميتوكوندريا (الشكل 2D-G)9.
الشكل 1. تصميم نظام حاضنة أعلى المنصة ذات الدائرة المغلقة. تظهر المكونات التالية لنظام الحاضنة: غطاء من بلاستيك الديلرين المقاوم للحرارة (A)؛ فتحة مستطيلة لنافذة من بلاستيك البولي كربونيت (B)؛ قاعدة ألومنيوم للحاضنة (C)؛ ثقوب لاستيعاب القوائم الفولاذية للقاعدة (D)؛ ثقب بقطر 35.1mm مع حافة غائرة رقيقة في مركز قاعدة الحاضنة لاستيعاب أطباق GBM مقاس 35mm (E)؛ خراطيم Nalgene (الوصلات بين حاضنة الزرع النسيجي وحاضنة أعلى المنصة؛ ومصايد الرطوبة) (F,G,N)؛ حاضنة الزرع النسيجي (H)؛ مضخة حوض أسماك (I)؛ صندوق بلاستيكي من مادة ABS محكم الإغلاق (مبيت لمضخة حوض الأسماك) (J)؛ دورق إرلنماير سعة 2000ml (كاتم لتقليل الاهتزاز في الخرطوم قبل حاضنة أعلى المنصة) (K)؛ غطاء بلاستيكي لمروحة التبريد (L)؛ إطار بلاستيكي لغطاء GBM مقاس 35mm (M)؛ موقع صمامات الإيقاف البلاستيكية (O). يشار إلى مواقع المنافذ الخاصة بإضافة الكواشف بواسطة الأسهم الصفراء في (II).
الشكل 2. نتائج نموذجية: تنظيم النقل الميتوكوندري. أ. محور عصبي لعصبون نموذجي من حصين جرذ مستزرع. تظهر الميتوكوندريا الموصومة ببروتين فلوري مشفر بواسطة فيروس لنتي (lentivirus) باللون الأخضر؛ وتظهر المحاور العصبية الموصومة مناعياً بجسم مضاد للفوسفورونيوفلامينت (phospho-neurofilament) باللون الأحمر. يشار إلى مدى المحور العصبي برؤوس أسهم صفراء. تتكون الصورة من أربع صور مجهرية متداخلة. ب. مثال لسلسلة صور بفاصل زمني توضح التغيرات في حركة الميتوكوندريا بعد إعطاء 5-HT. تم الحصول على الصور عبر مجهر فلوري مقلوب وتخزينها كسلاسل تم تحويلها لاحقاً إلى مقاطع فيديو بصيغة Quicktime. تظهر سلسلة نموذجية من الصور ميتوكوندريا فردية في نقاط زمنية مختلفة قبل (اللوحة اليسرى) وبعد (اللوحة اليمنى) إعطاء 8-OH-DPAT، وهو ناهض لمستقبل 5-HT1A. يبرز المستطيل الأحمر الرأسي ميتوكوندريا ثابتة (يساراً) وميتوكوندريا تذبذبية (يميناً) عبر نقاط زمنية متعددة. الميتوكوندريا التذبذبية المشار إليها (اللوحة اليسرى) تتحرك نحو النهاية المحورية بعد المعالجة بـ 8-OH-DPAT (اللوحة اليمنى؛ رؤوس أسهم بيضاء ذات إطار أحمر). يشير الخط الأصفر الرأسي (اللوحة اليمنى) إلى الموضع الابتدائي للميتوكوندريا المتحركة. تظهر الفواصل الزمنية في الزاوية السفلية اليمنى من كل إطار. يشار إلى التكبير (63×) في الزاوية السفلية اليمنى من اللوحة اليمنى. ج، د. مخططات توضح التغيرات في حركة الميتوكوندريا بعد إعطاء 5-HT. يتم عرض التغيرات في حركة الميتوكوندريا قبل (ج) وبعد (د) إعطاء 5-HT كمخططات للسرعة (المحور X) مقابل المواضع الابتدائية للميتوكوندريا الفردية على طول المحور العصبي (المحور Y). يتم تمثيل السرعة ونسبة الميتوكوندريا الثابتة (الأحمر)، والتذبذبية (الأزرق)، والمتحركة اتجاهياً (الأخضر) في المخططات والمخططات الدائرية (إدراجات فوق المخططات)، على التوالي. تشير الخطوط الحمراء المنقطة الممتدة من المناطق المظللة في الرسم التخطيطي للمحور العصبي إلى المحور Y لكل مخطط إلى الموقع التقريبي ومدى قطعة المحور العصبي التي تم تصويرها. هـ، و. مخططات توضح التغيرات في حركة الميتوكوندريا بعد إعطاء DA. يتم عرض التغيرات في حركة الميتوكوندريا قبل (هـ) وبعد (و) إعطاء DA كمخططات للسرعة (المحور X) مقابل المواضع الابتدائية للميتوكوندريا الفردية على طول المحور العصبي (المحور Y). يتم تمثيل السرعة ونسبة الميتوكوندريا الثابتة (الأحمر)، والتذبذبية (الأزرق)، والمتحركة اتجاهياً (الأخضر) في المخططات والمخططات الدائرية (إدراجات فوق المخططات)، على التوالي. تشير الخطوط الحمراء المنقطة الممتدة من المناطق المظللة في الرسم التخطيطي للمحور العصبي إلى المحور Y لكل مخطط إلى الموقع التقريبي ومدى قطعة المحور العصبي التي تم تصويرها. ز، ح. صور كيموغرافية (kymographs) نموذجية توضح حركة الميتوكوندريا في عصبون مستزرع قبل (ز) وبعد (ح) إعطاء البروموكريبتين، وهو ناهض لمستقبل D1R. تم تصوير العصبون لمدة ساعة واحدة قبل (ز) وساعة واحدة بعد (ح) إعطاء البروموكريبتين.
المناقشة
من خلال توظيف التعبير بوساطة الفيروس البطيء (lentivirus) لبروتين فلوري يستهدف الميتوكوندريا في العصبونات المستزرعة والمصابة، وباستخدام حاضنة اقتصادية مصنعة مخبرياً توضع فوق منصة المجهر وتسمح بتصوير الخلايا الحية لفترات ممتدة، تمكنا من استقصاء العلاقة بين حركة الميتوكوندريا وإشارات التعديل العصبي، مثل السيروتونين (5-HT)، والدوبامين (DA)، والأستيل كولين (ACh). وقد ساعدت دراساتنا في توضيح مسار تأشيري يربط، لأول مرة، انتقال الميتوكوندريا بالتغيرات في نشاط العصبونات -التي يتم تعديلها بواسطة ناقلات عصبية مثل 5-HT و DA- والتي تقع في صلب الوظيفة العصبية. ووجدنا أن استخدام البروتينات الفلورية المستهدفة يسمح بمراقبة الميتوكوندريا الموصومة في العصبونات المستزرعة الحية لفترات ممتدة قد تكون أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية من الفترات القصيرة جداً الممكنة عند استخدام الأصباغ الحيوية. علاوة على ذلك، تتيح لنا كثافة إشارة البروتين الفلوري الحفاظ على أزمنة تعريض قصيرة أثناء التقاط الصور، مما يقلل من احتمالية حدوث التبييض الضوئي أو السمية الضوئية. وأخيراً، فإن وجود حاضنة بسيطة وغير مكلفة توضع فوق منصة المجهر وتحافظ على درجة الحرارة المحيطة، والرطوبة، ومستويات CO2، مع تقليل تبخر الوسط الغذائي، يسمح لنا بتتبع حركة الميتوكوندريا في العصبونات الحية على مدى ساعات أو حتى أيام. ولا يحتاج الباحثون الراغبون في تصنيع حاضنة لمنصة المجهر للملاحظات طويلة المدى للميتوكوندريا في العصبونات الحية إلى اتباع التفاصيل الدقيقة لتصميمنا، شريطة أن تكون خصائص المواد المستخدمة (على سبيل المثال، غشاء نفاذ للغازات لتجنب تبخر الوسط الغذائي) والمبادئ المطبقة (على سبيل المثال، التحكم في درجة الحرارة والرطوبة، وموازنة pH، والحفاظ على الأسمولية) متوافقة بشكل عام مع ما هو موصوف في هذا البروتوكول.
الإفصاحات
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نود أن نشكر دونالد هاتسون على مساهمته بخبرته الفنية ومهارته العالية خلال تصميم وتصنيع الحاضنة الموضوعة فوق المنصة. كما نعرب عن امتناننا لـ آيدا دشتايي على مساعدتها الفنية المتميزة. وقد حظيت جميع الأعمال بدعم من مؤسسة أبحاث العلوم العصبية (Neurosciences Research Foundation).
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| (1) حاضنة زراعة الأنسجة (H) | |||
| (1) غلاف بلاستيكي مقاوم للحرارة (A) | (من مادة delrin أو ما يكافئها) | ||
| (1) إطار بلاستيكي لغطاء GBM مقاس 35mm (M) | (لتثبيت الغشاء في طبق بتري) | ||
| (1-2) قدم طولي من PFTE الشفاف (Teflon) | مادة الغشاء | ||
| (4) براغي تثبيت نحاسية | |||
| (2) مقاومات تشتيت حرارية صغيرة بقيمة 10kOhm | تستخدم كعناصر تسخين داخل غلاف الحاضنة المثبتة أعلى المنصة | ||
| (1) محول | لتزويد المقاومات بتيار بقيمة 9V | ||
| (1) وحدة تحكم في درجة حرارة التيراريوم ومجس | تنظيم ثرموستاتي للطاقة الواصلة إلى مقاومات التشتيت الحرارية عبر المحول | ||
| (1) دورق إرلنماير سعة 2000ml (K) | كاتم لتقليل الاهتزازات في الخرطوم قبل الحاضنة المثبتة أعلى المنصة | ||
| (1) لوح سوربوثان سمك 1/8" | مادة حاشية لقاعدة الحاضنة المثبتة أعلى المنصة | ||
| (1) صندوق بلاستيكي محكم الإغلاق من ABS (أو ما يكافئه) (J) | مبيت لمضخة حوض الأسماك | ||
| (1) مضخة حوض أسماك (I) | |||
| (1) مروحة تبريد كمبيوتر صغيرة | |||
| (1) غلاف بلاستيكي لمروحة التبريد (L) | |||
| (1) محول 9V لمروحة تبريد الكمبيوتر | |||
| (20-30 قدم) خرطوم Nalgene أو سيليكون (F,G,N) | توصيلات بين حاضنة زراعة الأنسجة والحاضنة المثبتة أعلى المنصة؛ ومصائد للرطوبة | ||
| (2) صمامات بلاستيكية (O) | لفتح وإغلاق تدفق الهواء قبل وبعد الحاضنة المثبتة أعلى المنصة | ||
| (4) وصلات خراطيم نحاسية مسننة | لتوصيلات الخراطيم من وإلى الحاضنة المثبتة أعلى المنصة ومبيت مضخة حوض الأسماك | ||
| (2) قارنات نحاسية سريعة | لتوصيلات الخراطيم من وإلى الحاضنة المثبتة أعلى المنصة | ||
| (2) قارنات نحاسية سريعة | لتوصيلات الخراطيم من وإلى الحاضنة المثبتة أعلى المنصة | ||
| الجدول 1. أجزاء الحاضنة المثبتة أعلى المنصة: | |||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
| laminin | Roche Group | 11243217001 | |
| أطباق ذات قاع زجاجي مقاس 35 mm | MatTek Corp. | P35GC-0-14-C | |
| DMEM | Life Technologies | 10567 | |
| B27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| BSA غني بالدهون | Life Technologies | 11020-021 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | A8381-100G | |
| فيتامين B-12 | Sigma-Aldrich | V2876-100MG | |
| 5-HT | Sigma-Aldrich | H9523-25MG | |
| 8-OH-DPAT | Sigma-Aldrich | H8520-25MG | |
| Dopamine | Sigma-Aldrich | H8502-5G | |
| Bromocriptine | Sigma-Aldrich | B2134-25MG | |
| SKF38393 | Sigma-Aldrich | D047-100MG |
المراجع
- Ligon, L. A., Steward, O. Movement of mitochondria in the axons and dendrites of cultured hippocampal neurons. J Comp Neurol. 427, 340-350 (2000).
- Miller, K. E., Sheetz, M. P. Direct evidence for coherent low velocity axonal transport of mitochondria. J Cell Biol. 173, 373-381 (2006).
- Macaskill, A. F. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. J Cell Biol. 131, 1315-1326 (1995).
- Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
- Crawley, J. N. Current protocols in neuroscience. , J. Wiley. (1999).
- Fedoroff, S., Richardson, A. Protocols for neural cell culture. , 3rd edn, Humana Press. (2001).
- Chen, S., Owens, G. C., Crossin, K. L., Edelman, D. B. Serotonin stimulates mitochondrial transport in hippocampal neurons. Mol Cell Neurosci. 36, 472-483 (2007).
- Chen, S., Owens, G. C., Edelman, D. B. Dopamine inhibits mitochondrial motility in hippocampal neurons. PLoS One. 3, e2804-e2804 (2008).
- Chen, S., Owens, G. C., Makarenkova, H., Edelman, D. B. HDAC6 regulates mitochondrial transport in hippocampal neurons. PLoS One. , e10848-e10848 (2010).
- Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors. Mol Ther. 1, 31-38 (2000).
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
