وصفت وسيلة فعالة للحصول على تخصيبه بدرجة الكسور الانتصافي قابلة للحياة من خصية الفأر ، الذي يجمع بين المكرر الخلية تفارق بروتوكول مع الفلورسنت الفرز تنشيط الخلية (FACS). هذا الأسلوب تستفيد من الاختلافات في المحتوى وكثافة النووية DNA الكسور الانتصافي منفصلة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
كانت الطبيعة غير المتجانسة من أنواع الخلايا في الخصية وعدم وجود نماذج الانتصافي خلية ثقافة عقبات كبيرة لدراسة البرامج التمايز الفريدة التي تظهر خلال الانقسام الاختزالي. وقد وضعت اثنين من الطرق الرئيسية لتنقية ، بدرجات متفاوتة ، وكسور مختلفة من كلا الانتصافي الكبار والحيوانات غير ناضجة : تصويل أو Staput (الترسيب) باستخدام جيش صرب البوسنة و / أو تدرجات percoll. كل من هذه الأساليب تعتمد على حجم الخلية وكثافة لفصل الخلايا الانتصافي 1-5. عموما ، باستثناء عدد قليل من السكان الخلية 6 ، هذه البروتوكولات لا تسفر نقاء كافية للسكان الخلية الانتصافي العديدة والتي هي ضرورية لإجراء تحليلات مفصلة الجزيئية. وعلاوة على ذلك ، يمكن مع مثل هذه الأساليب يمكن تنقيته عادة نوع واحد من الخلايا الانتصافي في وقت معين ، والذي يضيف مستوى إضافي من التعقيد فيما يتعلق استنساخ والتجانس عند مقارنة عينات الخلايا الانتصافي.
هنا ، نحن تصف طريقة المكرر الذي يسمح للمرء أن يتخيل بسهولة ، وتحديد ، وتنقية الخلايا الانتصافي من الخلايا الجرثومية الى أرومة النطفة في الجولة ، وذلك باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية جنبا إلى جنب مع تلوين 33342 هويشت 7،8. هذا الأسلوب يوفر لقطة الكلي للعملية برمتها الانتصافي ويسمح احد لتنقية عالية خلايا قابلة للحياة من معظم مرحلة الانقسام الاختزالي. ويمكن بعد ذلك تنقية هذه الخلايا يتم تحليلها بالتفصيل عن التغييرات التي تصاحب التقدم الجزيئية من خلال الانقسام الاختزالي ، على سبيل المثال التغيرات في التعبير الجيني 9،10 وديناميات الإشغال في المناطق الساخنة من النيوكليوسومات تأشب الانتصافي 11.
البروتوكول
ويمكن فصل هذا البروتوكول في خطوتين رئيسيتين : (1) التفكك وهويشت 33342 من خلايا الخصية تلطيخ الماوس تليها ، إذا لزم الأمر ، (2) FACS الفرز من الكسور في الانتصافي ذات الصلة ، بما في ذلك جميع مراحل الانقسام الاختزالي ، من الخلايا الجرثومية الى جولة أرومة النطفة. جمعها مرة واحدة ، يمكن استخدام هؤلاء السكان التخصيب الانتصافي لمجموعة واسعة من التحليل. يصف هذا البروتوكول تفارق الكبار للخصية واحدة ، ويمكن تكييفها وفقا لحجم الأحداث أو الخصيتين إضافية.
1. خصية التفكك
- مكان واحد الخ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
البروتوكول المقدمة في هذه الوثيقة يسمح احد لتنقية واحد من الفئران الذكور البالغين مجموعة كاملة من الخلايا مرحلة الانتصافي مع درجة نقاوة عالية جدا ، مما يسمح للمحققين لدراسة ديناميات هذه العملية الأساسية. ويمكن استخدام الخلايا النقية للعديد من التطبيقات بدءا من استخراج الحمض النووي الريبي 9،10 ، ورسم خرائط النيوكليوسومات 11 ، المؤتلف اكتشاف جزيء ، ويحلل البروتين ، وغيرها الكثير. ومع ذلك ، طرق الكشف يجب أن تتكيف مع كمية من الخلايا الانتصافي المنقى. علاوة على ذل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وقد أيد هذا المشروع في جزء من الأموال من ولاية فلوريدا لسكريبس وأرقام وR21HD061304 R01GM085079 جائزة من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة والمعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية ، على التوالي. هذا هو الرقم 20917 مخطوطة من معهد سكريبس للأبحاث.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كولاجيناز من النوع 1 (Collagenase Type-1) | Worthington Biochemical | CLSS1 | يُذاب بتركيز 12,000U/ml في محلول GBSS، ويُحفظ في درجة حرارة 4°C |
| تريبسين (Trypsin) | Worthington Biochemical | TRL3 | يُذاب في 1mM HCl بتركيز 50mg/ml، ويُحفظ في درجة حرارة 4°C |
| H–chst 33342 | Acros Organics | 230001000 | محلول مشبع (10mg/ml في DMSO)، ويُحفظ في درجة حرارة 4°C |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | يُذاب في الماء/50% جليسرول بتركيز 1mg/ml، ويُحفظ في درجة حرارة -20°C |
| محلول جيه بالانس الملحى (Gey’s Balance Salt Solution) | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| ماصة نقل بطول 6" | Fisher Scientific | 137119D |
المراجع
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
