Method Article

الداخلي للهندسة الرئة

DOI:

10.3791/2651

⸱

March 8th, 2011

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Duke University, 3Department of Anesthesia, Yale University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بتطوير مصفوفة الرئة decellularized خارج الخلية ومفاعل حيوي رواية بيوميمتيك التي يمكن استخدامها لتوليد أنسجة الرئة وظيفية. قبل البذر الخلايا في المصفوفة والتثقيف في مفاعل حيوي ، ونحن توليد أنسجة الذي يوضح التبادل الفعال للغاز عند زرعها في الجسم الحي لفترات قصيرة من الزمن.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أنسجة الرئة ، بما في ذلك سرطان الرئة وأمراض الرئة المزمنة مثل مرض انسداد الشعب الهوائية المزمن ، حساب تراكمي لبعض الوفيات 280000 سنويا ؛ مرض انسداد الشعب الهوائية المزمن هو رابع سبب رئيسي للوفاة في الولايات المتحدة (1). المساهمة في هذه الوفيات هو حقيقة أن الرئتين لا إصلاح أو تجديد عموما يتجاوز المستوى المجهري الخلوية. لذا ، لا أنسجة الرئة التي تضررت من انحطاط أو العدوى ، أو أنسجة الرئة التي هي محل مقطوعة جراحيا وظيفيا في الجسم الحي. لاستكشاف ما إذا كان يمكن أن تتولد أنسجة الرئة في المختبر ، نعامل الرئتين من الفئران البالغين باستخدام إجراء من شأنه أن يزيل المكونات الخلوية لإنتاج رئة خارج الخلية ديكي مصفوفة السقالة. هذه السقالة يحتفظ الهياكل الهرمية المتفرعة من المجاري الهوائية والأوعية الدموية ، فضلا عن الغشاء القاعدي سليمة إلى حد كبير ، الذي يضم الكولاجين الرابع ، laminin وفبرونيكتين. هي التي شنت على سقالة في مفاعل حيوي صمم لتقليد الجوانب الحاسمة في الفيزيولوجيا الرئة ، مثل التهوية الضغط السلبي والتروية الوعائية نابض. ظهارة بواسطة زرع بطانة الأوعية الدموية الرئوية وداخل مفاعل حيوي سقالة محمولة ، ونحن قادرون على توليد أنسجة الرئة التي هي مماثلة لأنسجة الرئة phenotypically المحلية والتي هي قادرة على المشاركة في تبادل الغازات لفترات زمنية قصيرة (45-120 دقيقة). هذه النتائج مشجعة ، وتشير إلى أن إعادة تعمير مصفوفة الرئة هو استراتيجية قابلة للتجديد الرئة. هذا الاحتمال فرصة ليس فقط للعمل من أجل زيادة المعروض من أنسجة الرئة للزرع ، ولكن أيضا لدراسة الخلية في الجهاز التنفسي والبيولوجيا الجزيئية في المختبر لفترات أطول في المكروية وأكثر دقة مما كان ممكنا في السابق.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الجمعية مفاعل حيوي

وتقدم شخصية مفصلة (ليالي) من تصميم مفاعل حيوي والتجمع لكل من decellularization والثقافة في أرقام 1 و 2 على التوالي. ويجب تعقيم جميع مكونات قبل الجمعية العامة للمفاعل حيوي. يشار إلى أن النقاط المحددة التالية :

الاتصالات :

  1. قنية في الشرايين تتكون من تركيب luer قفل متصلة Y - الخائن بواسطة قطعة صغيرة من الأنبوب. يتم إرفاق موصل luer قفل لأنابيب التروية ، ويرتبط الجزء من Y التي لم يتم تخييط إلى الشريان الرئوي وصمام باتجاه واحد. صمام باتجاه واحد هو المنحى يمكن استخلاصها من هذا القبيل أن السائل يصل الى الأنبوب (في الاتجاه المعاكس كما التروية) ، ولكن خلال كل جهاز نضح المتوسطة يصب في الرئة.
  2. قنية في القصبة الهوائية يتكون أيضا من موصل luer قفل مرتبطة Y - الخائن مع الأنابيب. وluer قفل يتصل حلقة التنفس بين الخزان والقصبة الهوائية الغرفة الرئيسي. يرتبط أيضا جزء من الرابط - Y لا تخاط إلى القصبة الهوائية لصمام باتجاه واحد. صمام باتجاه واحد هو المنحى في الشكل نفس قنية الشرياني.

وظائف :

  1. وتستخدم الصمامات في اتجاه واحد في الشرايين والقصبة الهوائية حقنة عادية لمسح فقاعات الهواء في أنابيب من خلال تمكين عكس التدفق في الأنابيب والسماح بالتالي لإزالة فقاعات الهواء.
  2. "حلقة في التنفس" تضم اثنين في اتجاه واحد الصمامات ، ووضع من هذا القبيل أن المتوسط ​​يتبع مسارا مختلفا من والى الرئة. وتقدم وصفا أكثر تفصيلا من هذه الميزة في منشور مسبق من 2 مختبرنا.
  3. وتقدم نضح الأوعية الدموية باستخدام مضخة الدوارة. هو perfused المتوسطة في الشريان الرئوي عبر قنية المرفقة ، والتدفقات من خلال الأوعية الدموية الرئوية ، والخروج من الوريد الرئوي مباشرة في مفاعل حيوي الرئيسية ، حيث يتم رسمها المتوسطة للحصول على الارواء.

2. الجهاز الحصاد

  1. الموت ببطء الكبار (3-6 أشهر من العمر) 344 فيشر الفئران عن طريق جرعة زائدة من الصوديوم بنتوباربيتال ، وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية (60 ملغم / كغم IP). ملاحظة : حل بنتوباربيتال يتضمن 100 وحدة في الهيبارين / مل التخثر.
  2. رذاذ أو مسح الصدر والبطن مع الايثانول 70 ٪.
  3. فتح التجويف الصدري ، مما يعرض القلب والرئتين ، مع الحرص على عدم الاضرار الرئتين. جعل بعناية نافذة صغيرة من خلال الحجاب الحاجز إلى تجويف الصدر ، مما تسبب في الرئتين إلى التراجع ، ومن ثم توسيع هذا الشق أفقيا لفضح أسس الرئتين. جعل اثنين من الشقوق عموديا عبر الأضلاع ، والتراجع عن قفص الصدر للكشف عن القلب والرئتين.
  4. إعداد نظام الارواء الجاذبية ، أي استخدام حقنة مع إزالة المكبس ، ومحبس 3 الطريق ، و~ 20cm من الأنابيب مع إبرة عيار 21 1.5inch. الحفاظ على حقنة في ~ 20cm فوق الحيوانية باستخدام موقف الدائري. ضمان أن تتم إزالة كل الهواء من الأنابيب الارواء.
  5. قطع الأذين الأيمن لاستنزاف الدم ، ومنعه من العودة إلى الرئتين. قد قطع الأذين الأيسر للسماح سهلة الصرف من الدم وسائل الإرواء من الرئتين يكون من المفيد أيضا ، ولكن ليس ضروريا.
  6. ادخال الإبرة في قاعدة البطين الأيمن وفتح محبس ليروي الرئتين بمحلول نتروبروسيد الهيبارين والصوديوم (50U/ml و1ug/ml ، على التوالي) في برنامج تلفزيوني. تأكد من أن الشريان الرئوي يملأ بسائل التروية ، وهذا هو تطهير الدم من الرئتين. إذا لزم الأمر ، إعادة ملء الحقنة بسائل نضح إضافية. عادة فقط مطلوب 10ML ~.
  7. تستمر حتى نضح الرئتين واضحة من الدم ، ثم توقف التروية.
  8. تشريح الحرة القصبة الهوائية ، وتصل إلى الرقبة إلى أقصى حد ممكن. يتم فصل ضمان من القصبة الهوائية والمريء. تشريح كافة الاتصالات المتبقية إلى القلب والرئتين والقصبة الهوائية ، وإزالة جملة.
  9. باستخدام مقص أو مشرط حاد ، وقطع ذروة القلب ، وتعريض البطينين الأيمن والأيسر.
  10. يقني ؛ يدخل القنية الجذع الرئوي عبر البطين الأيمن ، وخياطة في مكانها. إزالة أي فائض نسيج البطين الأيسر.
  11. يقني ؛ يدخل القنية القصبة الهوائية وخياطة في مكانها. تأكد من أن يتم وضع كل حقنة عادية القصبة الهوائية والرئة الشرايين مثل عدم وجود إجهاد الالتواء على القصبة الهوائية والرئتين والأوعية الدموية الكبرى أو (الشكل 1).
  12. ضمان عدم وجود فقاعات الهواء في قنية شريانية ، منذ فقاعات الهواء المحتبسة في النظام قد منع تدفق مستمر من خلال الجهاز. في بعض الحالات ، وهي فقاعة الهواء يمكن أن توقف تماما flow.To سائل تحقيق هذا الهدف ، وضع كتلة القلب / الرئة في وعاء يحتوي على برنامج تلفزيوني. استخدام المحاقن مع إبرة لحقن كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني في قنية القلب لطرد أي فقاعات.
  13. غسيل الشعب الهوائية مع PBS 4-5 مرات ، لإزالة الهواء بقدر الإمكان من الرئة.
  14. بعد الخطوة غسيلليالي كاملة ، مع تضخم الرئة تحتوي على الصوديوم PBS نتروبروسيد (SNP) في 1ug/ml. وضع سدادة على قنية القصبة الهوائية ، وبالتالي فإن الحل يبقى في الرئة. السماح للرئة لاحتضان لمدة تصل إلى 30 دقيقة ، ونفس الحل يمر عبر الأوعية الدموية عن طريق الشريان الرئوي ، للسماح لتوسع الأوعية.
  15. ربط القلب / الرئتين إلى قبعة باستخدام مفاعل حيوي الاتصالات luer قفل مرتبطة Y حقنة عادية الشكل ، وصفها في "الجمعية تفاعلات الاحيائية" أعلاه. (الشكل 1).

3. الجهاز Decellularization

  1. ربط غطاء (مع الرئتين المرفقة) لجهاز decellularization (الشكل 1). ينبغي للقنية توصيل الشريان الرئوي إلى خط التروية ، والقصبة الهوائية وينبغي قنية التعويم الحر. ضمان أن جميع خطوط واضحة من الهواء. كما هو موضح أعلاه ، يمكن للخطوط الجوية في أن تكون مصدرا للdecellularization الفقيرة من خلال منع تدفق السوائل decllularization. يمكن الهواء المحبوس في نظام تستمر أيضا في وقت والثقافة ، وعندما قد يكون لها أثر سلبي على بقاء الخلية 3.
  2. تضخم الرئة مع PBS / SNP حتى الرئتين والكامل ، ولكن لا تبالغ في تضخيم. قبعة على الفور بحيث قنية القصبة الهوائية في الرئة لا تزال مرتفعة.
  3. يروي الرئة مع PBS / SNP مدة لا تقل عن 15 دقيقة في ~ 15 مم زئبق (20cm H ضغط O 2). بعد 15min أو أطول ، وإزالة سدادة من قنية القصبة الهوائية للسماح ليدحض الرئة.
  4. مع استمرار التروية PBS / SNP ل30min. إذا لزم الأمر ، الملء PBS / SNP لضمان الحفاظ على ضغط التروية 10-15 مم زئبق.
  5. تبدأ الارواء بمحلول decellularization (الفصلان 8MM ، 1M كلوريد الصوديوم ، EDTA 25mM في برنامج تلفزيوني 1X). الحرص على ضمان أن جميع خطوط واضحة من الهواء. قد يكون من المفيد فراغ النظام لتوفير الشفط.

يروي حتى مع حل decellularization 500ml من الحل perfused من خلال الرئة. الضغط الأمثل هو <15 مم زئبق (~ 20 سم H 2 O). هذا سوف يتطلب عادة 2.5 ساعة. معدلات التدفق وعادة ما تكون بطيئة جدا (0.2-0.5ml/minute) في البداية ، وزيادة سريعة خلال الساعة الثانية تقريبا 1ml/minute أو أكبر. دوريا ، وإزالة السوائل المستخدمة decellularization من مفاعل حيوي ، وضمان ما يكفي من السوائل يبقى لدعم الرئة والقصبة الهوائية قنية.

4. جهاز شطف وتعقيم

  1. نقل الرئة والأنسجة مفاعل حيوي لغطاء الثقافة. تبدأ الشطف مع برنامج تلفزيوني العقيمة عن طريق إزالة جرة 500ml التي تحتوي على السائل decellularization والاستعاضة مع جرة العقيمة التي تحتوي على ما يصل الى 1L من برنامج تلفزيوني العقيمة. استخدام شفط فراغ لضمان خطوط واضحة من الهواء.
  2. يروي برنامج تلفزيوني عن طريق الأوعية الدموية في 10-15 مم زئبقي ، وبنفس الطريقة لdecellularization. دوريا ، وإزالة النفايات من مفاعل حيوي في برنامج تلفزيوني واستبدالها و / أو إعادة ملء جرة مع برنامج تلفزيوني في برنامج تلفزيوني ، طازجة العقيمة. فمن المستحسن استخدام تقنية معقمة.
  3. يستمر الشطف حتى لا يقل عن 2.5 لتر من برنامج تلفزيوني العقيمة وperfused الرئة.
  4. نقل الرئة إلى نظام جديد ومعقمة تحتوي على مفاعل حيوي في برنامج تلفزيوني جديد. ضمان سد كل حلقة نضح كامل والخطوط الهوائية بأكملها مع السوائل. فإن جميع الخطوات اللاحقة استخدام مضخة نابض ليروي في الرئتين 5ml/min.
  5. تعقيم سقالة ، إما عن طريق نضح ليلا مع برنامج تلفزيوني + حل FBS 10 ٪ القلم بكتيريا أو + 10 ٪ لمدة 3 ساعات مع حمض البيروكسي 0.1 ٪ في برنامج تلفزيوني. وهذه الأخيرة تتطلب الشطف الرئة مع 3 تغييرات PBS 250ml خلال عدة ساعات لإزالة حمض المتبقية. لكل الشطف ، ينبغي تهوية الرئة وكذلك perfused لضمان أن يتم شطف جميع أجزاء من الأنسجة وافية.
  6. نقل الرئة إلى الحاضنة 37 درجة مئوية مع ويروي PBS الذي FBS 10 ٪ و 10 ٪ البنسلين / الستربتوميسين ل~ 1hr أو حتى درجة الحرارة المتوازنة ، وذلك استعدادا لتلقي العلاج benzonase.
  7. علاج سرطان الرئة مع لإزالة بقايا benzonase الحمض النووي :
    1. تدفئة العازلة benzonase (انظر جدول الكواشف) إلى 37 درجة مئوية.
    2. لكل الرئة ، وملء أحد حقنة 10ML مع العازلة benzonase فقط واحد مع حقنة 10ML benzonase 90U/ml في العازلة.
    3. وقف نضح في الرئة.
    4. تضخيم الهوائية مع benzonase العازلة.
    5. السماح ليدحض الرئة (لمدة دقيقة 1 ~). ثم ، مع تضخم الرئة الحل benzonase. خلال التضخم مع العازلة benzonase وbenzonase ، في محاولة لتجنب أي حقن الهواء في الرئة.
    6. السماح للجلوس في الرئة دون نضح أو التهوية على 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة بعد تضخيم مع benzonase.
  8. استئناف نضح مع FBS PBS 10 ٪ + 10 ٪ البنسلين / الستربتوميسين موجود بالفعل في مفاعل حيوي ، وتستمر طوال الليل. في اليوم التالي ، ويمكن لسرطان الرئة يتم تخزينها في 4 درجات مئوية (لمدة تصل إلى 3 أشهر) أو معدة للزرع الخلايا.
  9. لإعداد سقالة لإعادة تعمير الخلوية ، واستبدال PBS / FBS / benzonase حل مع ~ 250ml متوسطة الثقافة. يروي ما لا يقل عن ساعة واحدة قبل أن يتم عرض الخلايا ، وهوالثانية مع استبدال مستنبت خلايا جديدة مباشرة قبل البذر.

5. Recellularization

ترك اختيار مصدر الخلية لإعادة زرع النبتة الجهاز حتى المحققين الفردية. ويمكن استخدام الخلايا مصادر عديدة ، بما في ذلك السكان المتاحة تجاريا ، معزولة حديثا الخلايا الرئوية حديثي الولادة أو الجنين ، والخلايا الجذعية الجنينية ، أو من مصادر الخلية متاحة تجاريا. ويمكن الاطلاع على بروتوكولات محددة لعزل هذه الخلايا في أماكن أخرى من السكان 4،5،6. هنا ، ونحن نقدم على تعليمات حول كيفية البذور على حد سواء السكان الخلية البطانية والظهارية.

البطانية البذر :

  1. إعداد تعليق المطلوب السكان الخلية البطانية ، في مستنبت المناسبة. تعليق تصفية خلية خلية من خلال مصفاة لإزالة كتل 40um الخلية. ومن شأن بذر نموذجية البطانية في مختبرنا الاستفادة من حوالي 30 مليون جرذ الرئة الخلايا البطانية في الاوعية الدموية الدقيقة 60ml المتوسط ​​الثقافة.
  2. الاستغناء عن التعليق الخلية في خزان صغير أدرج مؤقتا في حلقة نضح من مفاعل حيوي (الشكل 2). التأكد من أن أنابيب من هذا الخزان والحلقة نضح بأكمله هو واضح من فقاعات الهواء.
  3. غرس الخلايا في الشريان الرئوي في 3ml/min باستخدام مضخة الدوارة.
  4. بعد التسريب الخلية ، مع استمرار التروية المتوسطة تعميمها من مفاعل حيوي الرئيسي في معدل المرجوة.
  5. على أساس يومي ، تأكد من أن الأنبوب هو واضح من نضح فقاعات الهواء.
  6. ينبغي الاستعاضة المتوسطة مع المتوسطة الطازجة بانتظام ؛ ويتم ذلك غالبا كل يوم 3-4.

الظهارية البذر :

  1. إعداد تعليق خلية من الخلايا الظهارية السكان المطلوب. في المختبر لدينا ، وهذا يتكون عادة من حوالي 5-10 خلايا الفئران حديثي الولادة الرئوي. تصفية السكان من خلال مصفاة الخلية 40um وتعليق في 15ml المتوسطة الثقافة في حقنة. ملء خزان الهوائية مع 80ml المتوسط ​​الثقافة.
  2. مكان مفاعل حيوي في 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة ، وتوصيل مضخة محقنة للتهوية. ضمان التهوية جميع خطوط واضحة من الهواء.
    1. بذور الخلايا في الرئة عن طريق حقن 15ml التعليق الخلية بوصفها بلعة واحدة في القصبة الهوائية قنية.
    2. يبدأ على الفور واحدة ، والتنفس البطيء باستخدام مضخة الحقنة. ويدير هذه النفس من خلال سحب الهواء 60ml من مفاعل حيوي الرئيسي في 3ml/minute ودائم وبالتالي ما يقرب من 20 دقيقة. ضمان توج مرشحات الهواء على مفاعل حيوي الرئيسي على الفور بعد وقف حقن الخلايا وقبل البدء في التنفس بطيئا.
  3. السماح للجلوس الرئتين بشكل ثابت ل18hrs تقريبا ، ثم تبدأ الأوعية الدموية نضح بطيئة (حوالي 0.5 مل / دقيقة).

6. هيئة الثقافة

على الرغم من أن تفاصيل التروية والتهوية سوف تختلف بناء على التصميم التجريبي ، وأشار إلى النقاط التالية :

  1. خلال ثقافة البطانية ، ويجري في العادة في الارواء 1-3 مل / دقيقة باستخدام مضخة الدوارة. خلال ثقافة الظهارية ، يتم توفير التهوية عادة بمعدل التنفس المستمر من 1 في الدقيقة باستخدام مضخة الحقنة. مطلوب عادة انسحاب 10ML - 5 من الهواء من مفاعل حيوي الرئيسي لإحداث تهوية الرئة في وحدة تخزين المد والجزر الطبيعية. نظرا لضرورة الحفاظ على مفاعل حيوي محكم خلال التهوية ، ينبغي أن توقف التهوية اليومية ، وينبغي أن يتم تبادل الهواء في الغرفة الرئيسية. جميع الهواء في نظام هواء الغرفة ، وهو ما يقرب من 21 ٪ أوكسجين تحت ضغط جزئي. ويستند انسحاب 5 - 10ML من الهواء من مفاعل حيوي (والذي يؤدي الى الالهام 5 - 10ML من السوائل من الرئة) على حجم الرئة وكيفية العديد من فصوص يجري تربيتها (ويمكن ربط قبالة فصوص للتحليل ، في حين أن فصوص المتبقية الاستمرار في الثقافة). يتم اختيار سحب كمية من الهواء بواسطة مضخة محقنة لتقريب "حجم المد والجزر" من الرئة مثقف.
  2. يجب تغيير المتوسطة تقريبا كل 3-4 أيام خلال الثقافة.
  3. خلال ثقافة مشتركة من كل من الظهارة والبطانة ، والتجارب المختبرية في البذور أول ظهارة عادة لعدة أيام 4-8 ، خلال الوقت الذي يتم تهوية الأنسجة هندسيا. غير المصنف ثم البطانة عبر التروية ، وبعد ذلك النسيج على حد سواء perfused والتهوية.

7. ممثل النتائج :

Decellularization

عندما يتم تنفيذ البروتوكول بشكل صحيح ، يجب الرئتين المستخرجة حديثا دون تسرب الهواء الاستمرار. يمكن تضخيم لهم الهواء بينما المغمورة في سائل التحقق من ذلك -- ينبغي ألا يكون هناك أي فقاعات تشير إلى تسرب الهواء. ينبغي أن يسمح لاحقة decellularization ~ 500ml من السوائل decellularization تتدفق في الرئتين على مدار 2.5 -- 3 ساعات عند 37 درجة مئوية ، وينبغي أن يكون في نهاية المطاف برنامج تلفزيوني قادرة على التدفق من خلال الرئتين في حوالي 10 مل / دقيقة (تحت ~ 15 ملم زئبق في الضغط الهيدروليكي) في نهاية الشطف. بعد العلاج مع حمض البيروكسي 0.1 ٪ وbenzonase ، يمكن تخزين الرئتين عند درجة 4 لتصل إلى 3 أشهر ، ومازالت مناسبة لrecellularization.

وينبغي أن المصفوفة خارج الخلية decellularized النهائية تكون خالية تماما من المواد الخلوية ، والإبقاء على الخصائص الإجمالي ، المجهرية والتركيبية للرئة الأم. قد decellularization غير كافية أو نتيجة الشطف في بقايا الحمض النووي "الشائكة" على السقالة ، والتي يمكن تصور مع الهيماتوكسيلين القياسية وصمة عار يوزين (انظر الشكل 3 للمقارنة).

إعادة تعمير مصفوفة ديكي وثقافة أنسجة الرئة

إذا تم عزل خلايا طازجة من 7 ايام العمر الجراء الفئران حديثي الولادة ، كما هو موضح في الملحق المرافق للعمل على الانترنت من قبل بيترسن وزملاؤه 4 ، يمكن للمرء أن يتوقع تحقيق عائد خلية من خلايا الملايين 120-150 في القمامة من 10 الجراء (أكثر من 10 ملايين الخلايا في الوليد).

وينبغي أن الظروف المثلى لزراعة الخلايا والثقافة لاحقة من الرئة في مفاعل حيوي محصول جيد وزعت في جميع الخلايا 5 من فصوص الرئة ، وينبغي توفير تغطية ما يقرب من 70 ٪ من سقالة المصفوفة خارج الخلية (الشكل 3). سيصل عدد سكان الخلية المثقف أن يكون إيجابيا لمفتاح علامات الخلية في الجهاز التنفسي مثل الموالية للبروتين C - إفرازي (SPC) ، كلارا بروتين الخلية الإفرازية (CCSP) ، وaquaporin 5 (AQP) ، وذلك من الوفرة النسبية (الشكل 4).

figure-protocol-1
الشكل 1. حقنة عادية ومواقف مفاعل حيوي decellularization

figure-protocol-2
الشكل 2. تفاعلات الاحيائية المستخدمة في البذر وثقافة أنسجة الرئة هندسيا

figure-protocol-3
الشكل 3. الأنسجة من decellularized ، مسقط رأسه ، والرئة إسكانها

figure-protocol-4
الشكل 4. تلطيخ المناعي للعلامات الرئة الرئيسية

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدم أهم جوانب النظام وتشمل الصيانة هنا من العقم ، والرصد الدقيق من الضغوط التي تمارس على السرير الأوعية الدموية في جميع مراحل عملية إعداد وبذر السقالة وزراعة الرئة إسكانها. يتم الاحتفاظ أفضل العقم بواسطة التعقيم جميع المواد قبل استخدامها ، وتركيب الرئة في نظام مغلق ، وبعد فترة وجيزة يزدرع تجنب خرق لاحق من هذا الحاجز. بعد المصفوفة decellularized تشطف جيدا ونقلها الى مفاعل حيوي للثقافة عقيمة ، لا ينبغي غطاء سيليكون والأختام وغيرها من الاتصالات ان ينزعج أو إزالتها. للحفاظ على الضغط في الاختيار ، وتدفق مدفوعا الجاذبية هي الأفضل كلما أمكن ذلك. عندما يطلب إلى مضخة لإعادة تدوير السوائل ، تبدأ بعد الشطف مع استمرار برنامج تلفزيوني وخلال الثقافة ، ونوصي قياس الضغط مباشرة قبل قليل من السائل يدخل في الشريان الرئوي مع محول الضغط. وينبغي أن حجم الضغوط التي مورست لا تتجاوز ال 15 ملم زئبق.

يمكن تربيتها Recellularized الرئتين لفترات متفاوتة الزمن ، تتراوح عادة من 4 أيام لتصل إلى 3 أسابيع. عادة ما يتم إنجاز نضح في الأوعية الدموية 1-3 مل / دقيقة خلال ثقافة البطانية ، بينما يتم تطبيق التهوية عادة بمعدل 1 التنفس / دقيقة خلال ثقافة الظهارية. خلال فترات الثقافة مجتمعة ، في وقت واحد ، ونضح التهوية المناسبة. لا يمكن أن يؤديها إما مع التهوية المتوسطة السائل أو الهواء.

على مدى العقود العديدة الماضية ، قامت عدة مجموعات عمل مهمة هندسة الأنسجة تظهر جدوى التفريق ظهارة الرئة في المختبر ، وتكرار العديد من جوانب microanatomy الرئة 7،8،9 ، 10. ومع ذلك ، حتى وقت قريب ، لم يكن احد منهم 4،5 من هذه المحاولات لمهندس نسيج الرئة أدى إلى زرع الجهاز الذي كان قادرا على الحفاظ على الفصل بين الدم والتنفس والمقصورات التي يمكن أن تشارك في تبادل الغازات. لذا ، على الرغم من الأساليب المذكورة ليست سوى خطوة أولى نحو هدف طويل الأجل لتوليد أنسجة الرئة وظيفية ، وهذا العمل هو خطوة مشجعة نحو إمكانية زيادة كمية أنسجة الرئة المتاحة للزرع. وعلاوة على ذلك ، فإن هذا العمل بالتفصيل العمل الذي قام به أوت آخرون وUYGUN وزملاؤه 11،12 ، مما يدل على نجاعة المصفوفة خارج الخلية decellularized بوصفها سقالة لهندسة الأنسجة هياكل ثلاثية الأبعاد المعقدة ودعم النمو والبقاء على قيد الحياة لأنواع مختلفة من الخلايا . هذا العمل هو أيضا كبير لمساهمتها في الجهاز التنفسي أرممنتريوم الخلية والبيولوجيا الجزيئية. من خلال توفير فريدة من نوعها ، ثلاثي الأبعاد البيئة التي يمكن أن توفر أيضا مؤثرات الميكانيكية المناسبة ، والتي لا تشترك في المخاطر المصاحبة للتمايز دي السريعة التي يمكن للمرء أن تواجهها عند زراعة ظهارة القوارض في المختبر مع أكثر الأساليب التقليدية 13 ، يمكن استخدام العلماء لدينا نظام لاكتساب المعرفة الجديدة في التفاعلات خلية خلية وخلية المصفوفة التي تلعب دورا في تمايز الخلايا ووظيفتها. هذه المعرفة قد تكون قوية خاصة إذا ما استخدمت كوسيلة ضغط لتوجيه مصير السكان من مختلف الخلايا الجذعية ، ومجموعة Cortiella وأثبتت الدراسات الأولية في 14.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
LEN يحمل الأوراق المالية في Humacyte ، وهي شركة الطب التجديدي. لم لا Humacyte تمويل هذه الدراسات ، ولم تؤثر على تصميم ، والتفسير ، أو الإبلاغ عن أي من التجارب أو الأساليب المذكورة. وقد قدم كتاب (LEN ، THP ، EAC) وجامعة ييل طلب البراءة المتعلقة بالهندسة أنسجة الرئتين.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر Maegan باء Colehour للمساعدة في تطوير مفاعل حيوي. وتم تمويل هذه الدراسات من جانب جامعة ييل قسم التخدير والمعاهد الوطنية للصحة 098220 HL منحة (لLEN). كان مدعوما من قبل THP T32 NIH GM007171.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة فهرس العدد تعليقات (اختياري)
قتل رحيم
الهيبارين سيغما الدريخ H4784
نتروبروسيد الصوديوم Fluka 71778
Euthasol القتل الرحيم الحل Virbac ه 710101 يجب تخفيفه 390 ملغ / مل الأسهم الصوديوم بنتوباربيتال حل مناسب لإدارة الملكية الفكرية
Decell الحل
الفصلان سيغما الدريخ C3023
كلوريد الصوديوم الأمريكية Bioanalytical AB01915
EDTA سيغما E5134
هيدروكسيد الصوديوم JT بيكر 3722-01
1X PBS Gibco 14190
مكونات مفاعل حيوي
480 مل جرة كول Parmer EW - 3460560
سدادة السيليكون ، حجمها 14 كول parmer EW - 06298-26
Y - الموصلات كول Parmer ED - 30614-08 تستخدم لحقنة عادية الشرايين والقصبة الهوائية
سيليكون أنابيب Masterflex 96420-14 ؛ 16 L / S 14 و 16
الضغط المحولات ادواردز Lifesciences PX - 212
فحص الصمام كول Parmer EW - 98553-20 في اتجاه واحد صمام
4 طريقة الصمامات ادواردز Lifesciences 594WSC
حقنة التصفية كول Parmer 2915-08 السليكوون ، 0.2μm
Decell apparati والشطف (الإضافات إلى مفاعل حيوي)
500 مل و 1000 زجاجات من الزجاج كورنينج 1395-500 ؛ - 1L تستخدم لdecell والشطف بواسطة الجاذبية
Benzonase المعاملة
البنسلين / الستربتوميسين Gibco 15140122
FBS Hyclone SH30071.03
تريس ، حمض الهيدروكلوريك الأمريكية Bioanalytical AB14043 1M ، ودرجة الحموضة 8.0
MgCl 2 JT بيكر 2444-01
BSA سيغما A9647
Benzonase Nuclease سيغما E1014 نوكلياز داخلية تستخدم لإزالة بقايا الحمض النووي من مصفوفة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lung Disease Data. , (2008).">American Lung Association. Lung Disease Data. , (2008).
  2. Bioreactor for the Long Term Culture of Lung Tissue. Cell Transplant. , (2010).">Petersen, T. H., Calle, E. A., Colehour, M. B., Niklason, L. E. Bioreactor for the Long Term Culture of Lung Tissue. Cell Transplant. , (2010).
  3. Mechanisms of surface tension induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. J Appl Physiol. 94, 770-783 (2003).">Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface tension induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. J Appl Physiol. 94, 770-783 (2003).
  4. Tissue-Engineerined Lungs for in Vivo Implantation. Science. 329, 538-5341 (2010).">Petersen, T. H. Tissue-Engineerined Lungs for in Vivo Implantation. Science. 329, 538-5341 (2010).
  5. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 16, 927-9233 (2010).">Ott, H. C. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 16, 927-9233 (2010).
  6. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (2010).">Cortiella, J. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (2010).
  7. Reconstruction of alveolus-like structure from alveolar type II epithelial cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. Am J Pathol. 142, 783-7892 (1993).">Sugihara, H., Toda, S., Miyabara, S., Fujiuyama, C., Yonemitsu, N. Reconstruction of alveolus-like structure from alveolar type II epithelial cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. Am J Pathol. 142, 783-7892 (1993).
  8. Extracellular matrix remodeling by dynamic strain in a three-dimensional tissue-engineered human airway wall model. American Journal Respiratory Cell Molecular Biology. 35, 306-306 (2006).">Choe, M. M., Sporn, P. H., Swartz, M. A. Extracellular matrix remodeling by dynamic strain in a three-dimensional tissue-engineered human airway wall model. American Journal Respiratory Cell Molecular Biology. 35, 306-306 (2006).
  9. Tissue-enginered lung: an in vivo and in vitro comparison of polyglycolic acid and pluronic F-127 hydrogel/somatic lung progenitor cell constructs to support tissue growth. Tissue Engineering. 12, 1213-1213 (2006).">Cortiella, J. Tissue-enginered lung: an in vivo and in vitro comparison of polyglycolic acid and pluronic F-127 hydrogel/somatic lung progenitor cell constructs to support tissue growth. Tissue Engineering. 12, 1213-1213 (2006).
  10. Development of a Decellularized Lung Bioreactor System for Bioengineering the Lung: The Matrix Reloaded. Tissue Eng Part A. , (2010).">Price, A. P. Development of a Decellularized Lung Bioreactor System for Bioengineering the Lung: The Matrix Reloaded. Tissue Eng Part A. , (2010).
  11. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).">Ott, H. C. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
  12. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).">Uygun, B. E. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
  13. Functional differentiation of alveolar type II epithelial cells in vitro: effects of cell shape, cell-matrix interactions and cell-cell interactions. Biochim. Biophys. Acta. 931, 143-156 (1987).">Shannon, J. M., Mason, R. J., Jennings, S. D. Functional differentiation of alveolar type II epithelial cells in vitro: effects of cell shape, cell-matrix interactions and cell-cell interactions. Biochim. Biophys. Acta. 931, 143-156 (1987).
  14. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng Part A. , (2010).">Cortiella, J. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng Part A. , (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lung Tissue EngineeringDecellularization ProcedureExtracellular Matrix ScaffoldBioreactor CulturePulmonary Epithelium SeedingVascular Endothelium CultureImmunofluorescence MicroscopyNegative Pressure VentilationPulsatile Vascular PerfusionGas Exchange Analysis

Related Articles