علينا إثبات وجود في الجسم الحي بروتوكول electroporation transfecting لمجموعات واحد أو عقدة صغيرة من الخلايا الشبكية (RGCs) وغيرها من أنواع الخلايا الشبكية في الفئران بعد الولادة أكثر من مجموعة واسعة من الأعمار. القدرة على التسمية والتلاعب وراثيا RGCs بعد الولادة في الجسم الحي هو أداة قوية للدراسات الإنمائية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة في الجسم الحي Electroporation
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
استهداف وتنقيح التوقعات RGC إلى الدماغ المتوسط هو نظام النموذج الشعبي وقوية لدراسة أنماط كيفية الربط الدقيق لشكل العصبية خلال التنمية. في الفئران ، ويتم ترتيب التوقعات retinofugal بطريقة الطبوغرافية وشكل العين طبقات معينة في النواة الركبية الجانبية (dLGN) من المهاد وأكيمة فخمة (SC). وعادة ما يتم وضع هذه الأنماط دقيقة من الإسقاطات التي يدرسها retinofugal وسم سكان RGCs مع الأصباغ الفلورية واستشفاف ، مثل الفجل البيروكسيداز 1-4. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب الخشنة جدا لتوفير نظرة ثاقبة التغييرات التنموية في التشكل الفردية RGC محواري الشجرة التي هي أساس تشكيل الخريطة شبكي التوضع. كما أنها لا تسمح للتلاعب الجيني للRGCs.
في الآونة الأخيرة ، أصبح electroporation وسيلة فعالة لتوفير تحكم دقيق المكاني والزماني للتسليم من الجزيئات المشحونة في شبكية العين 11/05. البروتوكولات الشبكية الحالية electroporation لا تسمح للتلاعب الجيني وتتبع التوقعات retinofugal من كتلة واحدة أو قليل من RGCs في الفئران بعد الولادة. فقد قيل أن في فترة ما بعد الولادة electroporation فيفو ليست طريقة سليمة للtransfecting RGCs منذ كفاءة منخفضة للغاية وضع العلامات ، وبالتالي يتطلب تستهدف الأعمار الجنينية عند الأسلاف RGC تشهد التمايز والانتشار 6.
في هذا الفيديو تصف لنا في بروتوكول electroporation فيفو لتسليم المستهدفة من الجينات ، shRNA وdextrans الفلورسنت لRGCs الفئران بعد الولادة. هذا الأسلوب يوفر فعالة من حيث التكلفة وسريعة وسهلة نسبيا منصة لفحص كفاءة المرشحين من الجينات تشارك في العديد من جوانب التنمية بما في ذلك تراجع المحوار العصبية ، المتفرعة ، التصفيح ، وتجديد وتشكيل المشبك في مراحل مختلفة من التطوير الدائرة. باختصار نحن هنا وصف أداة قيمة التي ستوفر مزيدا من الإيضاحات عن الآليات الجزيئية الكامنة وراء الحسي التنمية الخريطة.
البروتوكول
1. معدات لانشاء Electroporation
- الأقطاب : نحن دومون تعديل رقم 5 لاستخدام الملقط والأقطاب الكهربائية.
- منفصلة وتحطيم ملقط.
- سلك لحام في نهاية كل أوسع الشق. التفاف الأسلاك المرفقة وشوكات مع الشريط العازل ترك ما يقرب من 25-30 ملم من غيض من شوكات المكشوفة.
- تعديل وضع ملقط معا مرة أخرى مع أي هل البلاستيك المناسبة (مثل زر) بين اثنين إلى توفير شوكات عمل ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا الفيديو إثبات وجود لنا في بروتوكول electroporation المجراة أن النتائج في مجموعات واحدة من العلامات أو صغيرة من الخلايا العصبية للشبكية في الفئران بعد الولادة مع الحمض النووي الترميز يبني البروتينات الفلورية. مستنسخة مجموعات صغيرة من إسقاطات RGC fluorescently المسمى إلى dLGN وSC أنماط مماثلة لإسقاط الدراسات السابقة باستخدام العلامات RGC مع الأصباغ محبة للدهون ، مشيرا إلى أن electroporation لم تتدخل العادي RGC صقل جذع محور عصبي. وقد استخدمت ونحن على هذا البر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
كان البلازميد pCAG - gapEGFP هدية من الدكتور س. ماكونيل (ستانفورد ، كاليفورنيا). وكان pCAG - tdTomato البلازميد هدية من الدكتور محمد فيلر (بيركلي ، كاليفورنيا). نشكر الدكتور إدوارد Ruthazer لاقتراح استخدام استراتيجية ثنائية البلازميد لوصفها خلية واحدة وSchohl آن (مونتريال ، QC) للتثبت من صحة اثنين البلازميد لجنة المساواة العرقية / loxP استراتيجية في الدراسات التجريبية وأفراد المختبر Crair للدعم التقني. بدعم من R01 MH62639 (MC) ، NIH R01 EY015788 (MC) ، والمعاهد الوطنية للصحة P30 EY000785 (MC).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| المواد | شركة | فهرس العدد | |
| دومون # 5 الملقط | أدوات العلوم غرامة | 11252-20 | |
| محفز كهربائي | العشب آلات | نموذج S4 | |
| مرسمة الذبذبات | اجيلنت | نموذج 54621A | |
| رصد الصوت | العشب آلات | نموذج AM8B | |
| مجتذب | سوتر الآلات | نموذج P - 97 | |
| Vannas المقص | العالم آلات دقيقة | 14003 | |
| المقص الصغير ب | تيد بيلا | 1347 | |
| دومون AA الملقط ج | أدوات العلوم غرامة | 11210-20 | |
| النظام الثاني Nanoinject | دروموند العلمية | 3-000-204 | |
| الزجاج الماصات | دروموند العلمية | 3 - 000 - 203 - G / X | |
| دواسة القدم | دروموند العلمية | 3-000-026 | |
| الزيوت المعدنية | سيغما الدريخ | M3516 | |
| صلاح الغيدان | Invitrogen | D - 383 | |
| N ، N - ثنائي ميثيل الفورماميد | سيغما | D4551 |
المراجع
- Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields. Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).
- McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. Retinotopic map refinement....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
