توضح هذه المقالة نهج التجريبي لتنظيم دينامية خلية خلية التفاعلات بين الخلايا الملتصقة على نطاق ميكرون. ويتضح من الاتصالات بين الخلايا التلاعب بين خلايا الكبد والخلايا اللحمية. المنصة المتقدمة تمكن التحقيق من خلية خلية التفاعلات في مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية ، بما في ذلك تطوير والمرضية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتم التعرف على دور المكروية الخليوي بانه حاسم في تحديد مصير الخلايا والأنسجة وظيفة في جميع الثدييات تقريبا من التنمية إلى التحول إلى أورام خبيثة. على وجه الخصوص ، وقد تورط التفاعل مع سدى المجاورة في عدد كبير من الظواهر البيولوجية ، إلا أن التقنيات التقليدية تحد من القدرة على استجواب العناصر المكانية والدينامية لهذه التفاعلات.
اعادة التشكيل في الثقافة الميكرو ميكانيكية (RC) ، ونحن توظيف ركيزة السيليكون مجهريا مع أجزاء متحركة لمراقبة حيوي خلية خلية التفاعلات من خلال إعادة الميكانيكية. سابقا ، وقد تم تطبيق هذا الأسلوب لتحقيق الاتصال بين الخلايا في الثقافات المشتركة لخلايا الكبد والخلايا غير متني ، مما يدل على الوقت التي تعتمد على التفاعل وعلى نطاق محدود للإشارة للذوبان 1.
هنا ، نحن تصف بالتفصيل إعداد واستخدام نظام المنسق المقيم. نبدأ من خلال البرهنة على التعامل مع أجزاء الجهاز باستخدام الملقط ، بما في ذلك التي تحرك بين الفجوة وتكوينات الاتصال (السكان خلية مفصولة فجوة 80 ميكرومتر الضيقة ، أو في اتصال حميم المباشر). المقبل ، ونحن بالتفصيل عملية تحضير ركائز للثقافة ، وبذر الخلية عملية متعددة الخطوات المطلوبة للحصول على monolayers الخلية متموجة. باستخدام المجهر العيش ، ثم نوضح في الوقت الحقيقي التلاعب في الخلايا بين تكوينات مختلفة التجريبية الممكنة. أخيرا ، علينا أن نظهر الخطوات المطلوبة من أجل تجديد سطح الجهاز لإعادة الاستخدام : التولوين وتنظيف سمكة البيرانا ، طلاء البوليسترين ، والأكسجين العلاج البلازما.
البروتوكول
إعداد الثقافات الخلية :
- تبدأ مع قطع السليكون مغلفة مع البلازما المعاملة البوليسترين.
- قطع معطف مع البروتينات المصفوفة خارج الخلية المناسبة لدعم مرفق من نوع من الخلايا المطلوبة. لخلايا الكبد ، يحضن في 50 جم / مل 1 - الكولاجين الحل عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. لالليفية 3T3 ، هناك حاجة إلى أي مصفوفة.
- تأمين قطع الغيار مع أجزاء مكملة في التكوين للإتصال به.
- نقع في الإيثانول 70 ٪ لمدة لا تقل عن 10 دقيقة لتعقيم. شطف 2X في DDH 2 O ، و1X في وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
- خلايا البذور بتركيز 500000 خلية / مل في مستنبت المناسبة. 1 مل في استخدام كل بئر من لوحة الثقافة 12 - جيدا.
- احتضان لمدة 1 ساعة ، ويهز كل 15 دقيقة لاعادة تعليق الخلايا بالتساوي.
- إذا كان أحادي الطبقة متموجة لم يتحقق بعد 1 ساعة ، نضح تعليق الخلية والبذر مع تكرار توقف الطازجة. كرر حتى تحقق كثافة الخلية المطلوبة.
- إزالة أجزاء مكملة. نقل أجزاء من الآبار العذبة واحتضان بين عشية وضحاها للسماح للخلايا على الالتزام الكامل وانتشارها.
- نموذج الاشتراك في الثقافات تأمين قطع الغيار المناسبة في الفجوة أو تكوين الاتصال. قد يتغير في أي لحظة التكوين المطلوب خلال الثقافة.
- عند تغيير وسائل الإعلام ، أن تحرص على ترك الخلايا الجافة لأقل وقت ممكن ، ويفضل أن يكون مجرد ثانية أو اثنتين. استخلاص السوائل مع يد واحدة واستبدالها فورا باستخدام وسائل الإعلام من جهة أخرى.
قطع السيليكون تجهيز لإعادة الاستخدام :
- الشريط الخلايا التي تمرغ في التبييض والشطف بالماء.
- تسمح أجزاء حتى يجف تماما. نقع في التولوين لمدة 2 ساعة لتجريد البوليسترين.
- النظيفة في حل البيرانا (1:2 H 2 O 2 : H 2 SO 4) تسخينه إلى 120 درجة مئوية.
- شطف لمدة 15 دقيقة في ظل التدفق المستمر للDDH 2 O. إذا كنت لا يذهبون إلى إيداع البوليسترين على الفور ، وتخزين قطع الغيار في المياه.
- حل البوليسترين في التولوين عند 100 ملغ / مل. في دوامة المخروطية البولي بروبلين لحوالي 1 ساعة أو حتى ، حلت بالكامل. مطلوب أكثر قليلا من 1 مل من حل لكل أجزاء 10.
- حل تدور حول قطع البوليسترين معطف السيليكون الفردية في 2400 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
- أخبز لمدة لا تقل عن 5 درجة مئوية في ح 120
- علاج الأوكسجين مع البلازما (200 mTorr ، 200 م) لمدة 1 دقيقة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذا النظام هو فريد من نوعه من حيث أنه يتيح التنظيم المكاني للأنسجة لمعالجته بشكل حيوي على المستوى الخلوي. وبالتالي ، مكن هذا الجهاز عددا من التجارب البيولوجية الرواية ، والتي تمتد موضوعات مثل إشارات بين الخلايا الديناميات ، اتصل بوساطة مقابل إشارة للذوبان ، وقرارات مصير الخلية ، وعلم السموم ، والحديث المتبادل الخلوية. وينبغي أن يكون هذا الجهاز للتعميم على نطاق واسع منذ الركيزة الثقافة هو المعيار البلاستيكية زراعة الأنسجة ، وهذا النظام هو متوافق مع وسائل الثقافة والمقايسات الموحدة. وبالتالي ، فإننا نعت...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
المؤلفان بالشكر سلمان Khetani ، ألن جاريد ، Flaim كريس وDerfus أوستن لإجراء مناقشات مفيدة خلال عملية تصميم هذا الجهاز. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية كلية المبكر برنامج التطوير المهني والمعاهد الوطنية للصحة المعهد / الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى ، ومؤسسة ديفيد ولوسيل باكارد. كان مدعوما من قبل L. EEH روث الجائزة الوطنية كيرشتاين دائرة البحوث.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
| ركائز السيليكون المشطية | أداة | غير متاح | غير متاح | الأجزاء متاحة لمشاريع البحث التعاونية. يرجى التواصل مع Elliot Hui (eehui @ alum . mit . edu) أو Sangeeta Bhatia (sbhatia @ mit . edu). |
المراجع
- Hui, E. E., Bhatia, S. N. Micromechanical control of cell-cell interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=17389399&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum 5722-5726 (2007).
- Bhatia, S. N., Balis, U. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Effect of cell-cell interactions in preservation of cellular phenotype: cocultivation of hepatocytes and nonparenchymal cells. The FASEB Journal. 13, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=10544172&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum 1883-1900 (1999).
- El-Ali, J., Sorger, P. K., Jensen, K. F. Cells on Chips. Nature. 442, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=16871208&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum 403-411 (2006).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
