بروتوكول الأمثل لترنسفكأيشن كفاءة الخلايا الجذعية من دون نضوج الخلايا

Summary

نحن حاضرنا الأمثل بروتوكول nucleofection عالية الإنتاجية باعتبارها وسيلة فعالة لtransfecting الوحيدات الإنسان الأساسية المستمدة من الخلايا الجذعية إما مع DNA البلازميد أو سيرنا دون التسبب في نضوج الخلايا. ونحن نقدم أدلة أخرى لإسكات سيرنا الناجح لاستهداف الجينات RIG - I مرنا في كل المستويات والبروتين.

Abstract

ويمكن اعتبار الخلايا الجذعية (DCS) حراسا للنظام المناعي والتي تلعب دورا حاسما في بدء وردا على العدوى ^1. الكشف عن مستضد الممرضة التي السذاجة البلدان النامية من خلال التعرف على الأنماط مستقبلات (PRRs) والتي هي قادرة على الاعتراف هياكل محددة الحفظ ويشار إلى الممرض المرتبطة بأنماط الجزيئي (PAMPS). كشف من قبل البلدان النامية PAMPs مشغلات تسقط إشارات بين الخلايا مما يؤدي إلى تنشيط والتحول إلى البلدان النامية ناضجة. وتتميز عادة هذه العملية من خلال انتاج الانترفيرون من النوع 1 جنبا إلى جنب مع السيتوكينات proinflammatory أخرى ، upregulation من علامات سطح الخلية مثل MHCII وCD86 والهجرة في العاصمة ناضجة لتصريف الغدد الليمفاوية ، حيث التفاعل مع الخلايا التائية يبدأ الاستجابة المناعية التكيفية ^{2 ، 3.} وبالتالي ، DCS ربط أنظمة المناعة الفطرية والتكيفية.

القدرة على تشريح الشبكات الجزيئية الكامنة وراء العاصمة ردا على مسببات الأمراض المختلفة ضروري لفهم أفضل لتنظيم هذه المسارات إشارة وجيناتها المستحث. وينبغي أن يساعد أيضا تسهيل تطوير العاصمة مقرا لقاحات ضد الأمراض المعدية والأورام. ومع ذلك ، فقد كان هذا الخط من البحوث أعاق بشدة من جراء صعوبة transfecting البلدان النامية الأولية ^4.

وعادة ما تستخدم أساليب تنبيغ الفيروس ، مثل نظام lentiviral ، ولكنها تحمل الكثير من القيود مثل التعقيد والمخاطر البيولوجية الخطرة (مع التكاليف المرتبطة بها) ^5،6،7،8. بالإضافة إلى ذلك ، وتسليم المنتجات الجين الفيروسي يزيد من استمناع تلك transduced ^{9،10،11،12} البلدان النامية. وقد استخدمت Electroporation مع نتائج مختلطة ^13،14،15 ، ولكن نحن أول من التقرير استخدام بروتوكول ترنسفكأيشن الإنتاجية العالية ، وتثبت بشكل قاطع فائدتها.

نحن في هذا التقرير تلخيص وضع بروتوكول تجاري لتحسين الإنتاجية العالية من البلدان النامية ترنسفكأيشن الأولية الإنسان ، مع سمية الخلية محدودة وعدم وجود نضوج العاصمة ^16. وكانت الكفاءة ترنسفكأيشن (من البلازميد GFP) وبقاء الخلية أكثر من 50 ٪ و 70 ٪ على التوالي. أنشئت FACS تحليل غياب زيادة في التعبير عن علامات النضج وCD86 MHCII transfected في الخلايا ، في حين تظاهر qRT - PCR لا upregulation من IFNβ. باستخدام هذا البروتوكول electroporation ، ونحن نقدم الدليل على نجاح ترنسفكأيشن البلدان النامية مع سيرنا وفعالة نهدم من الجينات المستهدفة RIG - I ، مفتاح مستقبلات الاعتراف الفيروسي ^16،17 في مرنا على حد سواء ، ومستويات البروتين.

Protocol

1. برنامج ال 96 Amaxa Nucleofector المكوك جيدا

1. فتح ملف المعلمة الجديدة.
2. تحديد عدد الآبار التي ستستخدم لترنسفكأيشن القياسية عن طريق سحب المؤشر على الرسم البياني 96 لوحة جيدا. استخدام الحد الأدنى من 3 آبار لتجميع لكل عينة تجريبية.
3. إدخال رمز البرنامج : في PART1 "FF" في اختيار وتحديد part2 '168' من القوائم المنسدلة
4. حدد مربع من الحل "، الوحيدات البشرية"
5. حدد الخيار تحت مراقبة 'معيار'.
6. انقر على تطبيق.
7. لتشمل مراقبة عدم ترنسفكأيشن ، حدد مزيد من الآبار المخطط كما هو مطلوب ثم اختر 'لا يوجد برنامج التحكم" من خيار التحكم وانقر على تطبيق.
8. حدد أي الآبار المتبقية غير المستخدمة على لوحة الرسم وانقر على Undefine.

2. إعداد البلدان النامية لترنسفكأيشن

1. وينبغي أن يتم كل العمل تحت ظروف معقمة في خلية غطاء الثقافة حيثما أمكن ذلك. إعداد الحل nucleofection بإضافة 96 - جيدا لتكملة الإنسان الوحيدات 96 Nucleofector الحل جيدا في نسبة من 450 إلى عام 2025. مزيج دافئ والسماح لدرجة حرارة الغرفة. ستحتاج 20μl حل nucleofection لكل بئر. جعل وجود فائض قدره 10 ٪ للسماح pipetting الخطأ.
2. وضع عدد من الوحدات nucleocuvette تحتاج إلى لوحة nucleocuvette في الاتجاه الصحيح أي إدراج أول واحد في الصفوف 1 و 2.
3. تحديد عدد من البلدان النامية بحاجة لتجربتك على حساب الخلايا لكل 500،000 جيدا وبيليه بواسطة الطرد المركزي في 400g عن 10min. إزالة بعناية طاف.
4. Resuspend الخلايا في حل nucleofection بواسطة pipetting بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات.
5. تقسيم وحدة التخزين الصحيحة من الخلايا معلق في eppendorfs المسمى لGLO العلاج خاصة وعلى سبيل المثال RIG - I.
6. إضافة سيرنا 0.25μg لكل 500،000 الخلايا ومزيج من قبل pipetting. عدم استخدام استهداف سيرنا في عينتك عدم السيطرة ترنسفكأيشن.
7. ماصة 20μl من الخلائط أعلاه إلى وحدات nucleocuvette ، وفقا لتخطيط لتجريبية ، وضمان سائلة يتم تسليمها إلى أسفل البئر.
8. تغطية لوحة nucleocuvette مع غطاء والاستفادة من لوحة على سطح صلب عدة مرات للمساعدة على ضمان إزالة فقاعات الهواء.

3. Transfect البلدان النامية

1. إدراج لوحة في درج Nucleofector المكوك 96 - جيدا ، وانقر على تحميل ثم بدء.
2. متابعة التقدم المحرز في عملية ترنسفكأيشن في اللفة عرض أعلى ؛ عرضية سوداء على خلفية خضراء ترنسفكأيشن يدل على نجاحها في ذلك جيدا ، في حين ان شريط أسود على خلفية حمراء يعني أنها كانت ناجحة.
3. عند الانتهاء من عملية ترنسفكأيشن ، وإزالة لوحة وإضافة 80μl متوسطة النمو المستمر إلى كل جيدا باستخدام ماصة الأقنية.
4. احتضان لوحة لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO _2.
5. حجم نقل 100μl من nucleocuvettes في أنابيب تحتوي على مصفوفة 100μl من قبل تحسنت العاصمة المتوسطة النمو ، والحفاظ على الاتجاه الصحيح.
6. إزالة والتخلص من تلك الأنابيب ترنسفكأيشن حيث لم يحدث.
7. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO ₂ لل24H أو غيرها من الفاصل الزمني المطلوب.

4. تصيب الخلايا مع NDV

1. إزالة أنابيب مصفوفة من الحاضنة إلى الخلية هود الثقافة وأنابيب تجمع لكل عينة تجريبية في eppendorfs
2. بيليه الخلايا برفق من خلال الدوران في مكتب لجهاز الطرد المركزي الأعلى لمدة 5 دقائق وإزالة طاف.
3. Resuspend الخلايا في النمو المتوسطة المصل خالية NDV تحتوي على وزارة الداخلية في جامعة النجاح واحتضان من 1 إلى 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO ₂ لمدة 45 دقيقة ، مع تغطية eppendorfs فضفاضة بطريقة عقيمة.
4. إضافة 900μl متوسطة النمو العاصمة ، وإعادة احتضان مقابل 80-10 ساعة.

5. حصاد الخلايا

1. بيليه الخلايا من خلال الدوران eppendorfs في مكتب أعلى الطرد المركزي وإزالة طاف.
2. خلايا الحمض النووي الريبي لالحصاد أو استخراج البروتين وفقا للبروتوكول الخاص.

6. ممثل النتائج :

باستخدام بروتوكول لدينا الأمثل transfected نحن البلدان النامية مع ريجي استهداف سيرنا لمدة 24 ساعة وبعد ذلك الخلايا المصابة مع NDV (أ الفيروسة المخاطانية الكشف عنها بواسطة I - RIG) لتنشيط المسار استجابة انترفيرون. بواسطة qRT - PCR تحليل أثبتنا نهدم من الجين بنسبة 75 ٪ على مستوى النسخ. لاحظنا أيضا انخفاض مماثل في التعبير عن IFNβ ، وهو المستجيب المصب I - تلاعب في تتالي إشارات الإنترفيرون. علاوة على ذلك ، لاحظنا أن التعبير عن IFNβ في الخلايا غير المصابة التحكم transfected ، كان لا يمكن كشفها في حين أن MxA ، وهو الجين IFNβ استجابة المصب ، وكان الحد الأدنى (الشكل 1A).

A ترنسفكأيشن الثانية من البلدان النامية مع ريجي استهداف سيرنا أجريت باستخدام الخلايا بما يكفي لتشمل تحليل لطخة غربية. حيثوRT - PCR نتائج مماثلة لما شهدناه في السابق (62 ٪ و 66 ٪ من نهدم RIG - I على التوالي والتعبير IFNβ) (الشكل 1B) ، للبحث عن لطخة غربية RIG - I كشفت أن التعبير عن هذا الجين قد تم سدت تماما (الشكل 1C).

الشكل 1. (A) وtransfected MoDCs إما مع سيرنا استهداف RIG - I أو غير محدد سيرنا GLO والتأثير على التعبير عن RIG - I IFNβ وMxA يحددها qRT - PCR. وكان البروتوكول ترنسفكأيشن استخدام العازلة الوحيدات محددة وبرنامج nucleoporation FF168 (Lonza Walkersville شركة) الحضانة وبعد لمدة 24 ساعة ، اما الخلايا المصابة transfected مع NDV (+) أو غير مصاب اليسار (--). بعد مزيد من الحضانة لمدة 10 ساعة ، وكان حصاد الخلايا والحمض النووي الريبي مستويات استخراج نسخة تمثل نتائج تجربتين تكرار. مأخوذة من بولز وآخرون ¹⁶ (B) ومرة أخرى transfected MoDCs الحصول عليها من معطف الشهباء مختلفة كما تستخدم في الشكل 1A إما مع RIG - I - استهداف سيرنا أو غير محدد سيرنا GLO باستخدام بروتوكول ترنسفكأيشن نفس أعلاه. وقد أدرج عنصر تحكم إضافية باستخدام MoDCs untransfected في التجربة. بعد 24 ساعة حضانة أصيبوا كافة الخلايا مع NDV والمحتضنة لمزيد من 10 ساعة قبل أن يتم حصاد كل من الحمض النووي الريبي واستخراج البروتين. مستويات نص RIG - I IFNβ ، وعلى النحو الذي يحدده MxA qRT - PCR تمثل نتائج تجربتين تكرار. مأخوذة من بولز ¹⁶ آخرون (C) وحللت Lysates من خلايا وصفها في الشكل 1B أعلاه لطخة غربية. حارات 1 و 2 ، lysates من خلايا untransfected ؛ الممرات 3 و 4 من خلايا lysates سيرنا GLO transfected ؛ الممرات 5 و 6 من خلايا lysates transfected مع RIG - I استهداف سيرنا. وكانت عينات للبحث I - RIG وكذلك GAPDH (كعنصر تحكم التحميل) وكانت تعمل في مكررة. مأخوذة من بولز ¹⁶ آخرون.

Discussion

ترنسفكأيشن كفاءة الخلايا الجذعية الأولية السذاجة المهم لتحليل إنتاجية عالية والهندسة العكسية من التهابات المسالك الخليوي في هذه الخلية الرئيسية تتوسط الانتقال فطرية - التكيف المناعي. ومع ذلك ، فإن معظم المحققين وجدت أن هذه الخلايا من الصعب على حد سواء transfect بكفاءة ودون نضوج الخلية الداخلي ترنسفكأيشن حمل عند استخدام تقنيات ترنسفكأيشن القياسية. نحن التحقيق ما إذا كان يمكن التغلب على هذه القيود التي مرت عالية باستخدام بروتوكول التحسين ومستقل في وقت واحد 96 - جيدا النظام التجاري ت...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
المعدات / الكاشف	شركة	كتالوج #	تعليقات
Amaxa Nucleofector 96 - جيدا المكوك	Lonza	108S0109	رقم متسلسل
Amaxa الإنسان الوحيدات 96 - جيدا كيت Nucleofector	Lonza	VHPA - 2007	يحتوي على الوحيدات الإنسان 96 - جيدا الحل Nucleofector ، الملحق 96 - جيدا وNucleocuvettes وألواح
RIG - I سيرنا	Dharmacon	L - 012511-00
GLO سيرنا	Dharmacon	D - 001600 - 01 - 20
RPMI 1640	Invitrogen	11875	تستكمل مع FCS 10 ٪ ، 2 مم L - الجلوتامين ، 100 U / مل البنسلين و100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين لجعل العاصمة المتوسطة النمو
DMEM	Invitrogen	11965
L - الجلوتامين	Invitrogen	25030081
البنسلين / الستربتوميسين	Invitrogen	15070063
الجنين مصل العجل	HyClone	3070،03
شجيري خلايا	نيويورك مركز الدم		وتنقيته من البلدان النامية المعاطف الشهباء باستخدام إجراء القياسية