ثقافة الخلايا الطبيعية في سياق ثلاثية الأبعاد من يمثل طريقة بديلة لدراسة الأحداث المبكرة اللازمة للتحول الخليوي وتكون الأورام. وتستخدم هذه الطريقة لزراعة المبيض الطبيعي والخلايا بوقي لدراسة الأحداث المبكرة في تكوين سرطان المبيض.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ألجينات الهلاميات المائية للثقافة الجهاز ثلاثي الأبعاد من المبيضين وناقلة البيضات
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
سرطان المبيض هو السبب الرئيسي الخامس للوفيات السرطان في النساء ويبلغ معدل الوفيات 63 ٪ في الولايات المتحدة 1. نوع خلية من خلايا المنشأ لسرطان المبيض ما زال في السؤال ، وربما تكون إما سطح المبيض الظهارة (OSE) أو ظهارة القاصية من 2،3 خمل قناة فالوب. سوف زراعة الخلايا العادية بوصفها ثقافة الأولية في المختبر تمكن العلماء من طراز تغييرات محددة قد تؤدي إلى الإصابة بسرطان المبيض في ظهارة متميزة ، وبالتالي تحديد نوع الخلية نهائيا المنشأ. هذا سيسمح تطور المؤشرات الحيوية أكثر دقة ، النماذج الحيوانية مع التغيرات النسيجية الخاصة الجينات ، واستراتيجيات وقاية أفضل المستهدفة لهذا المرض.
الحفاظ على الخلايا الطبيعية في الهلاميات المائية ألجينات يشجع على المدى القصير في الثقافة المختبر من الخلايا في سياق ثلاثي الأبعاد وعلى تراخيص إدخال الحمض النووي البلازميد ، سيرنا ، والجزيئات الصغيرة. من جانب أجهزة التثقيف في القطع التي يتم اشتقاق من التخفيضات الاستراتيجية باستخدام مشرط وثقافات عدة من جهاز واحد يمكن توليدها ، وزيادة عدد من التجارب من حيوان واحد. هذه التخفيضات الجوانب نموذج التبويض مما يؤدي إلى انتشار بيئة نظام التشغيل ، وهو أمر يرتبط مع تشكيل سرطان المبيض. يمكن تربيتها أنواع الخلايا مثل بيئة نظام التشغيل التي لا تنمو جيدا على السطوح البلاستيكية باستخدام هذا الأسلوب ، وتسهيل التحقيق في العمليات الخلوية العادية أو أقرب الأحداث في تشكيل السرطان 4.
ويمكن استخدام الجينات الهلاميات المائية لدعم نمو العديد من أنواع الأنسجة 5. الجينات هي السكاريد خطية مؤلفة من تكرار وحدات من حامض - D - β وmannuronic α - L - حمض guluronic التي يمكن crosslinked مع أيونات الكالسيوم ، مما أدى إلى إجراء التبلور لطيف لا ضرر 6،7 الأنسجة. مثل غيرها من ثلاثية الابعاد المصفوفات ثقافة الخلية مثل Matrigel ، ألجينات يوفر الدعم الميكانيكية للأنسجة ، إلا أن البروتينات لا يتم التفاعل مع مصفوفة الجينات ، وبالتالي وظائف الجينات والمصفوفة خارج الخلية الاصطناعية التي لا تبدأ الخلية إشارة 5. وهيدروجيل ألجينات يعوم في مستوى الخلية مستنبت ويدعم بنية نمو الأنسجة في المختبر.
ويقدم طريقة لإعداد ، والانفصال ، وتضمينها في المبيض وقطع الجهاز بوقي الهلاميات المائية في الجينات ، التي يمكن في ظلها في الثقافة لمدة تصل الى أسبوعين. يوصف ايضا باطلاق سراح الأنزيمية من الخلايا لتحليل عينات من البروتينات والحمض النووي الريبي من ثقافة الجهاز. أخيرا ، ونمو أنواع الخلايا الأولية غير ممكن من دون تخليد الجينية من الفئران ويسمح للمحققين لاستخدام الفئران المعدلة وراثيا وخروج المغلوب.
البروتوكول
1. تشريح الانسجة المبيض والعزلة
- إعداد محلول 0.5 ٪ (وزن / حجم) من الجينات الصوديوم ، وإعداد نسخة معدلة من البروتوكول سبق وصفها 5 ، وذلك باستخدام برنامج تلفزيوني العقيمة والحرارة إلى 37 درجة مئوية. مزيج من قبل انقلاب أو الهزاز ، ولكن لا الدوامة. رسم ألجينات في 1 مل حقنة بإبرة G 25 و 37 في الحفاظ على درجة مئوية.
- إعداد 10MM العقيمة CaCl 2 حل لهذه الجينات عند يشابك نسيج التغليف ودافئة إلى 37 درجة مئوية.
- إعداد 1mL المتوسطة الثقافة (αMEM + 5 وحدات البنسلين والستربتوميسين 5 ميكروغرام / مل) بشكل جيد في كل لوحة 24 جيد لكل تجربة. وتشمل العقاقير المختلفة ، والببتيدات ، أو الفيروسات في المتوسط الثقافة. لترنسفكأيشن قبل الجهاز التغليف ، مع احتضان الأنسجة Lipofectamine 2000 و DNA البلازميد لمدة أربع ساعات في 37 درجة مئوية.
- تشريح الأعضاء من الحيوان ، وإزالة أي نوع من الأنسجة الدهنية أو المتبقية ، برفق خارج الغشاء المحيط جراب المبيض ، وقطع قناة البيض في المبيض أو أربع قطع من قبل تتوسط الجهاز. الموت الرحيم كانت الحيوانات خنقا CO 2 تليها خلع عنق الرحم. للقناة البيض ، uncoil بلطف الأنسجة عن طريق سحب بعيدا الأغشية ربط وتمديد تاريخ إنتهاء من الأنبوب في اتجاهين متعاكسين باستخدام الملقط قبل القطع.
- وضع قطرة واحدة ألجينات (~ ميكرولتر 1-3) في الصعود إلى شبكة الألياف تعقيمها.
- باستخدام ملقط معقم ، حرك قطعة من الجهاز في قطيرة الجينات ومركز الحبرية باستخدام ملقط أو إبرة معقمة.
- عكس الحبرية التي تحتوي على قطعة الجهاز (ورم) عن طريق شبكة الألياف استيعاب مع ملقط معقم وتحويلها رأسا على عقب للسماح لقوة الجاذبية في الجينات إلى انخفاض شنقا.
- اضغط على ملقط على حافة 10cm طبق بتري تحتوي 10MM CaCl 2 الحل بحيث تراجع يقع في الحل.
- احتضان لمدة 2 دقيقة ، مع إزالة ملعقة العقيمة التي تحتوي على مسام اضافية للافراج عن 10MM CaCl 2 ، ونقل إلى متوسطة الثقافة. ويمكن تحويل ما يصل الى المواد الهلامية الجينات الأربعة في بئر واحدة من لوحة تحتوي على 24 بئرا في المتوسط الثقافة. الثقافة لفترة زمنية محددة.
2. تدهور ألجينات ومجموعة من الخلايا
- لsolubilization من هلام الجينات ، في احتضان ثقافات ياز ألجينات (3.4 ملغ / مل) المنحل في وسائل الإعلام 15 - L يبوفيتش في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقائق أو حتى يذوب تماما هلام.
- إزالة الأنسجة من ياز الجينات.
- لتحصيل OSE ، احتضان للورم مع 500 وحدة من كولاجيناز في وسائل الإعلام ليبوفيتش - 15 L : 1 ساعة 8. دوامة في 2 البقول الثاني (2 و 2 ثانية دوامة ثانية راحة) على السلطة متوسطة لمدة 1 دقيقة ، تليها البقول 1 ثانية (1 +1 دوامة الثاني وبقية الثانية) لمدة 1 دقيقة. اسمحوا قطع الجهاز ينخفض إلى أسفل أنبوب microcentrifuge وطاف ماصة جديدة في أنبوب microcentrifuge العقيمة. 3 دقائق للطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة لظهارة المبيض بيليه السطح.
- لتحصيل ظهارة الأنبوبي ، وقطع بالطول ومكان أنبوب من البلاستيك على زراعة الأنسجة في DMEM مع 5 وحدات البنسلين و 5 ميكروغرام / مل الستربتوميسين و 4 ٪ (V / V) FBS. على مدى 3-5 أيام ، سوف الخلايا "الزحف" للخروج من سدى الأنبوبي وتنمو على زراعة الأنسجة plastic9.
3. تثبيت الثقافات ألجينات جهاز تغليف للأقسام البارافين
- جمع ألجينات تغليف حبة متوسطة من الثقافة في نقطة زمنية محددة.
- Recrosslink في الجينات لتشديد الجل بإسقاط الثقافة في حل عقيم 10MM 2 CaCl لمدة دقيقتين.
- إصلاح الجهاز ألجينات مغلفة في بارافورمالدهيد 2 ٪ سكروز يحتوي على 50 ملم ، 10 ملم CaCl 2 و 50 ملي كاكوديلات الصوديوم للتأكد من أن جل يبقى متينا وتلخص تماما الأنسجة أثناء التثبيت.
- بعد معالجة الأنسجة ، وترسيخ ثقافة بأكملها الجهاز ألجينات ، مغلفة في قطعة البارافين والباب مع مشراح لتوليد 5 أقسام ميكرون.
- وسيتم حل الجينات وإزالتها من الشريحة اذا أداء المناعية بسبب الحرارة على استرجاع مستضد. سوف تبقى وصمة عار ألجينات ليوزين يقف تحت الهيماتوكسيلين وتلطيخ يوزين.
4. ممثل النتائج :
ويرد مثال للثقافة الجهاز ثلاثية الأبعاد من المبيض وقناة البيض في الشكل 1. ويمكن خفض حجم المبيضين الى قطع مختلفة ، وOSE تتكاثر وتهاجر إلى السطح إصلاح الذي كان الجرحى من شق مع مشرط. خلال هذه العملية ، هو الحفاظ على التوجه الصحيح للبيئة نظام التشغيل بالنسبة إلى سدى الكامنة ، مع بيئة نظام التشغيل التغليف المبيض. كما هو مبين في الشكل 2 ، OSE المبايض في قطع نصف تغليف المبيض أكثر تماما بالمقارنة مع المبيضين مقطعة إلى أرباع أو أثمان. إصلاح الجرح من المبيضيمكن دراستها في سياق سطح المبيض بأكمله وربما تسلط الضوء على كيفية التبويض وإصلاح السطح يدفع المبيض تحول السطح.
نقطة النهاية لهذه التجربة يعتمد على المعلومات المطلوبة. يمكن رصدها بسهولة بنية الأنسجة ، والتشكل الخلوي ، ومحددة معدلات النمو الخلوي باستخدام أقسام البارافين. على سبيل المثال ، يلاحظ وجود طبقة واحدة من سطح ظهارة المبيض بعد زراعتها في المصل خالية αMEM لمدة 7 أيام (الشكل 3A) ، في حين إضافة 5 ميكروغرام / مل الانسولين لمدة 7 أيام الحث المفرط لظهارة المبيض من المياه السطحية وتكوين طبقات متعددة من الخلايا (الشكل 3B). بإضافة bromodeoxyuridine على ثقافات بتركيز نهائي من 10 ساعة 24 ميكرومتر قبل التثبيت ، يمكن قياس انتشار الخلايا (أقحم 3A و 3B). للثقافات في الحفاظ على المصل خالية αMEM ، حوالي 3-5 ٪ من الخضوع OSE الانتشار خلال فترة 24 ساعة وسم (3A أقحم) ، في حين أن نسبة كبيرة من الخلايا المحببة تتكاثر. إضافة إلى وسائل الإعلام الانسولين الثقافة زيادات نسبة انتشار OSE إلى حوالي 30 ٪ من مجموع OSE (3B أقحم). المناعي ويمكن للبروتين الفلورية الخضراء (GFP) يمكن تصور من خلال هلام ألجينات المجهري مع المعيار التالي ترنسفكأيشن [كدنا] (الشكل 3C). بينما الجينات الثقافة الجهاز يوفر للنمو وتحليل ظهارة سطح المبيض وبصيلات الابتدائي ، ينبغي الإشارة إلى أن تنضج ، بصيلات الثانوية تفشل في البقاء على قيد الحياة في هذا النظام الثقافة (الشكل 3D). وقد وصفت ثقافة الفرد إلى النضج بصيلات ضمن الجينات مصفوفة هيدروجيل 10 في مكان آخر.
ويمكن تحليل التغيرات في الحمض النووي الريبي من البروتين أو الجهاز بأكمله أو من أنواع معينة من الخلايا باستخدام تدهور الأنزيمية (الشكل 4). علاج organoids المبيض مع مثقف كولاجيناز يترك سدى الكامنة سليمة (الشكل 4C) ، في حين يسمح لتخصيب OSE بيليه في الخلية التي تم الحصول عليها بعد العلاج ، على الرغم من عزل بعض الخلايا اللحمية (الشكل 4D).
الرقم المبيض الماوس 1. ثلاثي الأبعاد نظام استخدام الثقافة للنشر OSE بعد اصابة. أ) تحت المجهر ، وإزالة الجراب وسادة المحيطة الدهون. B) المبيض سليمة (O) مع أنبوب بوقي (T) وسادة دهنية (F). C) مع جراب المبيض وسادة إزالة الدهون (يسار) وuncoiled قناة البيض (يمين). D) وضعت المبيض أو بوقي organoids إلى قطرة الجينات. E) أسقطت organoids الجيني المغطى في يشابك CaCl حل (2) والجينات لتشكيل مادة هلامية. F) الجيني مغلفة ورم المبيض. G) مغلفة بوقي عضوي الشكل الجيني. H) المحتضنة organoids الجيني مغلفة في المتوسط الثقافة.
الشكل 2. المساحة السطحية بواسطة مجدد المبيض تقاس cytokeratin 8. تغليف organoids المبيض قبل OSE بعد أن يقتطع أرباع أثمان ، ونصفين ، مثقف في وسط جيش صرب البوسنة ، وتقاس عن طريق التحليل المناعى باستخدام cytokeratin 8 (CK8) الأجسام المضادة.
ثقافة الشكل الجيني 3. نظام يسمح بمرور عوامل النمو وترنسفكأيشن من [كدنا] في بيئة نظام التشغيل ، ولكن لا دعم النمو السريع ونضوج المسام. أ) ورم المبيض تربيتها لمدة 7 أيام في المتوسط القاعدية تحليلها لCK8 التعبير ، والذي يصادف OSE. أقحم ، الفرع المسلسل الملون لإدراجها BrdU. ب) إضافة إلى وسائل الإعلام الانسولين يدفع ثقافة تضخم من بيئة نظام التشغيل. أقحم ، الفرع المسلسل الملون لإدراجها BrdU. C) ورم المبيض transfected مع [كدنا] للتعبير عن GFP. D) النظام الجيني الثقافة تدعم نمو بصيلات البدائية (رأس السهم الأحمر) ، ولكن لم تنضج بصيلات الثانوية (السهم الأسود).
يمكن الرقم 4. OSE تكون معزولة عن ثقافة التحليل التالي. أ) ورم المستزرعة في المتوسط ليصل الى 2 أسابيع. ب) يتم التعامل مع عضوي الشكل مغلف ياز ألجينات لمغادرة عضوي سليمة. اتسخت المبيض مع CK8 لOSE العلامة. ج) يتم التعامل مع ورم كولاجيناز إلى بيئة نظام التشغيل منفصلة عن سدى الكامنة. وتبقى قطعة نسيج ملون مع CK8 لتسليط الضوء على إزالة سطح المبيض. D) هي الخلايا التي يتم جمعها المخصب بعد العلاج لبيئة نظام التشغيل والملون لCK8 (الحمراء). وcounterstained الخلايا مع دابي بمناسبة النوى.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تطوير نظام الجهاز ثقافة ثلاثي الأبعاد باستخدام الجينات الهلاميات المائية يمثل تنوعا طريقة لتحليل العديد من أنواع الأنسجة المختلفة من طائفة واسعة من الكائنات الحية. ويمكن تمديد استخدام الثقافات 3D لمجالات هندسة الأنسجة والطب التجديدي ، حيث انها توفر منصة الاعدام على الخلايا التي يمكن أن تنمو 11. حاليا ، لدينا مختبر الدراسات الأولية يمر به الإنسان المبيض وقناة فالوب أنبوب الأنسجة ، ومع ذلك ، فقد وصفت ثقافة بصيلات الرئيسيات البشرية وغير البشرية 12،13.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لا يوجد شيء في الكشف عنها.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل صندوق أبحاث السرطان المبيض [منح LT/UIC/01.2011] ، ومركز اتحاد المحاكم الإسلامية للعلوم الطبية وبالحركة ، ومركز السرطان UIC ، والمعاهد الوطنية للصحة منح C06RR15482.
وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها AAALAC تحت رعاية الحيوانات البروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة رعاية الحيوان ، واستخدم في المحاكم الاسلامية. إيواء الحيوانات لهذا المشروع في غرف الحاجز في مختبر الموارد البيولوجية (BRL) في جامعة إلينوي في شيكاغو. ويبلغ عدد موظفي BRL البيطرية تماما أن تراقب الحيوانات على الأقل مرتين يوميا ، ويقدم المشورة بشأن رعاية الحيوان.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات (اختياري) |
| يبوفيتش L - 15 المتوسط | Gibco | 11415 | |
| αMEM المتوسطة | Gibco | 12000-022 | |
| ألجينات الصوديوم | Novamatrix | ||
| الصوديوم كاكوديلات | سيغما الدريتش | C0250 | |
| شبكة الألياف البولي بروبلين | ماكماستر كار | 45 "لفة واسعة ؛ 0.0041" فتح | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| البنسلين / الستربتوميسين | Gibco | 15070-063 | |
| ألجينات ياز | سيغما الدريتش | A1603 | |
| A1603 | سيغما الدريتش | C9697 | من نسج كلوستريديوم |
| ألبومين المصل البقري | النائب Biomedicals | 103700 | |
| مصل بقري جنيني | Gibco | Gibco | |
| ITS الحل | روش | 11074547001 | الانسولين / ترانسفيرين / الصوديوم زيلونيت |
| Cytokeratin 8 الأضداد | الدراسات التنموية ورم هجين الضفة | TROMA - 1 | استخدامها في 1:200 |
| دابي | ناقلات مختبرات | H1200 | |
| Bromodeoxyuridine | سيغما | B50002 - 1G | التركيز النهائي 10 ميكرومتر |
المراجع
- Jemal, A. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
- Auersperg, N., Woo, M. M., Gilks, C. B. The origin of ovarian carcinomas: a developmental view. Gynecol Oncol. 110, 452-454 (2008).
- Crum, C. P. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Curr Opin Obstet Gynecol. 19, 3-9 (2007).
- Jackson, K. S., Inoue, K., Davis, D. A., Hilliard, T. S., Burdette, J. E. Three-dimensional ovarian organ culture as a tool to study normal ovarian surface epithelial wound repair. Endocrinology. 150, 3921-3926 (2009).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20, 45-53 (1999).
- Augst, A. D., Kong, H. J., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as biomaterials. Macromol Biosci. 6, 623-633 (2006).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Symonds, D. A., Miller, K. P., Tomic, D., Flaws, J. A. Effect of methoxychlor and estradiol on cytochrome p450 enzymes in the mouse ovarian surface epithelium. Toxicol Sci. 89, 510-514 (2006).
- Umezu, T., Hanazono, M., Aizawa, S., Tomooka, Y. Characterization of newly established clonal oviductal cell lines and differential hormonal regulation of gene expression. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 39, 146-156 (2003).
- Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).
- Wilson, R. F., Wiencek, R. G., Balog, M. Predicting and preventing infection after abdominal vascular injuries. J Trauma. 29, 1371-1375 (1989).
- Xu, M. In Vitro Oocyte Maturation and Preantral Follicle Culture from the Luteal Phase Baboon Ovary Produce Mature Oocytes. Biol Reprod. , Forthcoming Forthcoming.
- Xu, M. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Hum Reprod. 24, 2531-2540 (2009).
- Jen, A. C., Wake, M. C., Mikos, A. G. Review: Hydrogels for cell immobilization. Biotechnol Bioeng. 50, 357-364 (1996).
- Iwamoto, Y. Purification and characterization of bifunctional alginate lyase from Alteromonas sp. strain no. 272 and its action on saturated oligomeric substrates. Biosci Biotechnol Biochem. 65, 133-142 (2001).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab Invest. 71, 510-518 (1994).
- Auersperg, N., Ota, T., Mitchell, G. W. Early events in ovarian epithelial carcinogenesis: progress and problems in experimental approaches. Int J Gynecol Cancer. 12, 691-703 (2002).
- Kruk, P. A., Uitto, V. J., Firth, J. D., Dedhar, S., Auersperg, N. Reciprocal interactions between human ovarian surface epithelial cells and adjacent extracellular matrix. Exp Cell Res. 215, 97-108 (1994).
- West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev. 22, 255-288 (2001).
- Choi, J. H., Wong, A. S., Huang, H. F., Leung, P. C. Gonadotropins and ovarian cancer. Endocr Rev. 28, 440-461 (2007).
- Fathalla, M. F. Incessant ovulation--a factor in ovarian neoplasia. Lancet. 2, 163-163 (1971).
- Espey, L. L. Current status of the hypothesis that mammalian ovulation is comparable to an inflammatory reaction. Biol Reprod. 50, 233-238 (1994).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
