نحن هنا وصفا لطريقة سريعة وبسيطة لصورة fluorescently المسمى الخلايا في الدماغ شبه شرائح سميكة. عن طريق تحديد ، تشريح ، وإزالة أنسجة الدماغ بصريا وصفنا كيف يمكن استخدام معيار التصوير epifluorescent مبائر أو لتصور الخلايا الفردية والشبكات العصبية داخل الأنسجة العصبية سليمة.
مقالة منهجية
نهج السريع إلى التصوير الإسفار عالية الدقة في الدماغ شرائح شبه سميكة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتمثل الهدف الأساسي لكل من العلوم العصبية الأساسية والسريرية في فهم أفضل للهويات، والتركيب الجزيئي، وأنماط الاتصال التي تميز الخلايا العصبية في الدماغ السليم والمصاب على حد سواء. وفي هذا الصدد، بُذلت جهود كبيرة في بناء خرائط تشريحية عصبية عالية الدقة1-3. ومع توسع الوراثة الجزيئية والتقدم في المجهر الضوئي، ظهرت القدرة ليس فقط على استقصاء المورفولوجيا العصبية، بل وأيضاً التركيب الجزيئي والخلوي للخلايا العصبية الفردية والشبكات المرتبطة بها4. كما تتيح التطورات الرئيسية في القدرة على وسم الخلايا العصبية والتحكم بها من خلال تقنيات التعديل الوراثي واستهداف الجينات في القوارض للباحثين الآن "برمجة" مجموعات فرعية من الخلايا العصبية حسب الرغبة5-6. ويمكن القول إن أحد أكثر المساهمات تأثيراً في العلوم العصبية المعاصرة كان اكتشاف واستنساخ الجينات التي تشفر البروتينات الفلورية (FPs) في اللافقاريات البحرية7-8، إلى جانب هندستها لاحقاً لإنتاج مجموعة أدوات متوسعة باستمرار من المراسلين الحيويين9. إن استغلال نشاط المحفز الخاص بنوع الخلية لتوجيه تعبير FP المستهدف في مجموعات عصبية محددة يتيح الآن إجراء استقصاءات تشريحية عصبية بدقة جينية.
لقد أدى هندسة التعبير عن البروتينات الفلورية (FP) في العصبونات إلى تحسين فهمنا لبنية الدماغ ووظيفته بشكل كبير. ومع ذلك، ظل تصوير العصبونات الفردية والشبكات المرتبطة بها في أنسجة الدماغ العميقة، أو في ثلاثة أبعاد، يمثل تحدياً. ونظراً للمحتوى العالي من الدهون، فإن الأنسجة العصبية تكون معتمة إلى حد ما وتظهر فلورية ذاتية. هذه الخصائص الفيزيائية الحيوية المتأصلة تجعل من الصعب تصور وتصوير العصبونات المسمى فلورياً بدقة عالية باستخدام المجهر الفلوري التقليدي أو المجهر البؤري (confocal microscopy) بما يتجاوز أعماق تبلغ عشرات الميكرونات. ولتجاوز هذا التحدي، غالباً ما يستخدم الباحثون طرق التصوير وإعادة البناء للمقاطع الرقيقة المتسلسلة10، أو المجهر المسحي الليزري ثنائي الفوتون11. وتتمثل العيوب الحالية لهذه النهج في تحضير الأنسجة الذي يتطلب جهداً مكثفاً، أو تكلفة الأجهزة الباهظة، على التوالي.
نقدم هنا طريقة بسيطة وسريعة نسبياً لتصوير الخلايا الموُسمة بالفلورسنت في شرائح دماغ الفأر شبه السميكة والمثبتة، وذلك عن طريق الترويق البصري والتصوير. ونصف في البروتوكول المرفق طرق: 1) تثبيت أنسجة الدماغ in situ عبر التروية داخل القلب، 2) تشريح وإزالة الدماغ بالكامل، 3) طمر الدماغ في وضع ثابت داخل الأجاروز، 4) تحضير شرائح شبه سميكة بدقة باستخدام أجهزة الفايبراتوم الحديثة، 5) ترويق أنسجة الدماغ من خلال تدرج الجلسرول، 6) التثبيت على شرائح زجاجية للفحص بالمجهر الضوئي وإعادة بناء مصفوفة Z (Figure 1).
لإعداد شرائح الدماغ، استخدمنا جهازاً حديثاً نسبياً يسمى 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). هذا الجهاز عبارة عن ميكروتوم شبه آلي مزود بنظام دفع آلي ونظام اهتزاز للشفرة بميزات مشابهة في وظيفتها لأجهزة الفايبراتوم الأخرى. وعلى عكس أجهزة الفايبراتوم الأخرى، يتم تثبيت النسيج المراد تقطيعه في سدادة من الأغاروز داخل أسطوانة من الفولاذ المقاوم للصدأ. يتم دفع النسيج من الأسطوانة بالسماكات المطلوبة، ثم يتم قطعه بواسطة الشفرة المهتزة التي تتقدم للأمام. يتيح نظام سدادة الأغاروز/الأسطوانة تثبيت النسيج ومحاذاته وقطعه بدقة وبطريقة قابلة للتكرار. وبناءً على تجربتنا، يوفر جهاز 'Compresstome' شرائح نسيجية عالية الجودة للفحص الكهربي الفسيولوجي، والكيمياء النسيجية المناعية، والتثبيت المباشر للأنسجة والتصوير. وبالدمج مع عملية التصفية الضوئية، نستعرض هنا كيفية تحضير شرائح دماغية مثبتة شبه سميكة للتصوير الفلوري عالي الدقة.
البروتوكول
1. الدماغ في تثبيت الوضع الطبيعي
* تحضير حقنة 10 مل (28 إبرة قياس) مليئة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
* تحضير حقنة 10 مل (28 إبرة قياس) مليئة بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني. الاحتياطي إلى ترخيص إضافي 5-10 PFA / لتثبيت برنامج تلفزيوني آخر.
- ضخ تجريبي intraperitoneally الفأر مع جرعة قاتلة من آفيرتين أو Nembutal.
- بمجرد مخدرا الماوس ، والرطب في البطن مع الإيثانول وتأمين الماوس إلى أسفل الدرج الطبقات مع الفلين والشمع ، أو الاستومر سيليكون باستخدام دبابيس تشريح. البطن مع مواجهة وتأمين الكفوف أربعة إلى السطح -- نشرها على أوسع نطاق ممكن.
- الاستيلاء على الجلد مع ملقط على مستوى القص ، وقطع بالعرض لفضح الكبد. قطع أفقيا ثم ارتفعت خلال الضلوع والحجاب الحاجز. إزالة الأنسجة رفرف الصدري وتستمر حتى قطع القلب للوصول.
- بيرس أو قص الأذين الأيمن لاستنزاف الدم تعميمها.
- تدفق الدم المتبقية من الدورة الدموية التي نضح من خلال برنامج تلفزيوني البطين الأيسر.
- الوصول إلى ثقب الإبرة نفسها ، إصلاح الماوس كله عن طريق نضح اللاحقة PBS / منهاج العمل من خلال البطين الأيسر.
2. تشريح الدماغ واستخراج
- إزالة الجلد من الرأس والعنق والجمجمة عن طريق خفض حول قناة الأذن والعين المدارات ، يليها سحب الجلد الأمامية لفضح الجمجمة.
* انظر الشكل رقم 2 لتوضيح الخطوات 2.2) إلى 2.5) - باستخدام مقص العظام ، وقطع بالعرض من العين عن طريق مأخذ عظام المحارة الأنفية. للقيام بذلك كل جانب. ينبغي أن يكون إقطع الأمامي للعين وبصيلات الشم.
- قطع بالطول من كل قناة الأذن إلى تجويف العين.
- باستخدام مقص تشريح الصغيرة ، وقطع لوحة العظم القذالي تغمر المخيخ من قناة الأذن واحدة إلى أخرى.
- مع مقص تشريح نفسه ، خفضت الأمامية على طول خط الوسط على مستوى البصيلات الشمية.
- باستخدام الملقط ، وإزالة كل لوحة العظام من الدماغ ، مع الحرص على إزالة أي نوع من الأنسجة الضامة بحيث أن الدماغ لا يزال سليما عندما رفع قبالة العظام.
- قص قطع الأعصاب البصرية والجمجمة والفقرات العنقية العليا ، وإزالة تثبيتي في الدماغ.
- في مرحلة ما بعد الإصلاح لمدة 1-2 ساعات في 4 درجات مئوية. اغسل 3 مرات كل 15 دقيقة في برنامج تلفزيوني.
3. Agarose التضمين
- تذوب 2 ٪ عالية القوة ، وانخفاض نقطة agarose هلام نوع IB (سيغما رقم الكتالوج : A0576) في برنامج تلفزيوني مع المالحة فرن الميكروويف.
- نقل agarose المنصهر إلى أنبوب اختبار. مكان أنبوب الاختبار في حمام ماء دافئ أو الحاضنة (40 ° -41 درجة مئوية) حتى موازنة درجة الحرارة.
- الغراء أنسجة المخ ثابتة على المكبس من المحاقن مع عينة cyanoacrylate الغراء (3A الشكل). فرشاة طبقة رقيقة من محلول السكروز ، PBS المشبعة على سطح أنسجة المخ لتسهيل الافراج في وقت لاحق من الحلبة agarose من شرائح الدماغ.
- سحب المكبس مع أنسجة المخ في السكن المكبس (الشكل 3B).
- ماصة أو صب agarose الدافئة في السكن المكبس ، الذي يغطي أنسجة المخ. تجنب احتباس فقاعات الهواء في agarose. وفقاعات الهواء في agarose تؤثر سلبا على جودة شريحة.
- المشبك المحقنة مع العينة (° 0 إلى -25 درجة مئوية) الباردة كتلة تقشعر لها الأبدان لمدة 1 دقيقة لضبط agarose (الشكل 3C).
4. Sectioning شريحة الدماغ مع Compresstome
- تجميع العينات حقنة تحتوي على أنسجة المخ في Compresstome (الشكل 3D).
- محاذاة حافة شفرة الحلاقة بشكل وثيق مع مخرج المحقنة العينة (الشكل 3E).
- تعبئة خزان العازلة مع الحل برنامج تلفزيوني.
- تدوير شريحة سمك ميكرومتر الى الأمام لبثق كتلة أنسجة الدماغ agarose من حقنة العينة.
- اضغط على زر "ابدأ" في وحدة التحكم من Compresstome للشروع في عملية sectioning.
- كرر الخطوات من 4.4) إلى 4.5) حتى يتم الحصول على المطلوب في تحديد شرائح سمك.
- شرائح الدماغ الحصاد مع فرشاة أو ماصة للقوارير أو الآبار مملوءة PBS تلوين الشكل (3F).
5. تبادل البصرية
- إعداد المجلد 75 ٪ : المجلد حل الجلسرين : برنامج تلفزيوني.
- صب (أو ماصة) قبالة حجم نصف PBS غسل الدماغ من الشرائح التي تم جمعها.
- إضافة مرة أخرى حجم إزالة مع الجلسرين / برنامج تلفزيوني.
- السماح للتوازن مع مزج لطيف في 4 درجات مئوية حتى تغرق شرائح.
- كرر الخطوات من 6.2) إلى 6.4) حتى تصل إلى تركيز الجلسرين النهائية 75 ٪.
- استبدال حل مع الجلسرين 90 ٪ في برنامج تلفزيوني ، والسماح للتوازن.
* ملاحظة : احرص على عدم إدخال فقاعات الهواء في حين اضاف حلول الجلسرين. صب المزيج ببطء وحلول بلطف ، منذ فقاعات الهواء سوف تتداخل مع equilibra موحدةوسيتم تنفيذ نشوئها والى شريحة متزايدة.
6. شريحة متزايدة للتصوير
- قطع لاصقة على الوجهين الختم (SA - S - 1L ، غريس بيو مختبرات) في مستطيل مفتوح لتناسب مساحة للعرض شريحة متناهية الصغر (Superfrost زائد ، 25 X 75 X 1 ملم ، والقط. # 48311-703 ، VWR ) مع الجانبين 2-3 مم واسعة.
- مكان شرائح الدماغ داخل مركز للمستطيل باستخدام شريط لاصق ماصة أو فرشاة الرسم. إزالة الزائدة الجلسرين مع التطلع لطيف.
- ترتيب شرائح الدماغ على الشريحة في الترتيب المطلوب مع فرشاة الرسم.
- انخفاض الغطاء برفق زجاج (24 X 60 مم ، القط. # 48383-139 ، VWR) على شريط لاصق ، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء. بلطف تطبيق الضغط على الزجاج غطاء لضمان الاتصال مع شريط لاصق.
- نضح الجلسرين الزائد من الحواف بين الشرائح وساترة.
- وختم الشريحة ساترة باستخدام طلاء الأظافر واضحة.
- السماح ليجف قبل التصوير ، أو تخزين طويل الأجل في صناديق الشريحة في 4 درجات مئوية.
7. ممثل النتائج :
وقد أصبحت معالجة ، والتصوير ، وتحليل fluorescently المسمى أنسجة المخ التي لا غنى عنها لدراسة البيولوجيا العصبية. كثير من هذه التحقيقات تتطلب التلاعب الجيني متطورة للحصول على التعبير مراسل فرعية في الخلايا العصبية المستهدفة ، تليها كل من يحلل صورة منخفضة وعالية الدقة. في كثير من الأحيان قيود التجريبية والتقنية تجعل من المستحيل الحصول على هذه الأنواع من البيانات من نفس الحيوان ، أو بطريقة سريعة. إعداد مسح بصريا ، والمقاطع الدماغ شبه سميكة لمكافحة الإيدز التصوير فلوري في هذا التحدي. مثال على شريحة سميكة الدماغ سليمة المسمى مع فيروس داء الكلب المعدلة وراثيا هندسيا لEGFP التعبير ، والتقط باستخدام المجهر epifluorescent ومبائر هو مبين في الشكل (4) والشكل (5) على التوالي. التصوير epifluorescent استخدمنا M205 ايكا اتحاد كرة القدم ، والحصول على الصور مبائر استخدمنا LSM زايس 510. بسبب البساطة النسبية للبروتوكول المرفق ، وهذه الطريقة هي قادرة على إنتاج بيانات الصور مفيدة من نسيج التعبير عن صحفيين الفلورسنت مع فترة زمنية أقل من يوم واحد ، ومتوافق مع كل من المجهري الإضاءة الخافتة والعالية الدقة.
إذا كان محقق تختار إدماج أساليب إضافية الوسم بعد الوفاة ، وتلطيخ المناعى ، أو جعل أرق المقاطع ، وبروتوكول يطول تبعا لذلك. ومع ذلك ، فإن الطريقة الموصوفة أعلاه يمثل طريقة بسيطة والإنتاجية العالية نسبيا من أجل فحص أنماط التعبير مراسل حيوية في الدماغ سليمة.
الشكل 1. مخطط تدفق diagraming التثبيت ، تشريح ، تشريح ، تبادل المعلومات ، وإجراءات متزايدة من شرائح الدماغ شبه سميكة.
الشكل 2. مخطط لقطع خطوات متتابعة لاستخراج مخ الفأر سليمة.
الشكل 3 خطوات لتحميل وشريحة أنسجة المخ باستخدام Compresstome. أ) الموضع من أنسجة المخ على خفض استخدام superglue المكبس. ب) رسم أسفل أنسجة المخ التي شنت في المكبس لتضمين agarose. C) التقوية القابس الدماغ agarose باستخدام كتلة ضغط مبردة. D) الإدراج من المكونات الدماغ والمكبس agarose في غرفة قطع Compresstome. E) محاذاة razorblade إلى الجهاز المكبس. F) ، وجمع قطع من شرائح الدماغ في غرفة عازلة Compresstome.
الشكل 4. الصور المجهري الضوء على شريحة سميكة من الجلسرين تطهيرها أنسجة المخ من خلال التعبير عن القشرة الخارجية الخضراء المعززة بروتين فلوري (EGFP). شريحة) الاكليل من خلال مخ الفأر (200 ميكرون سميكة) المسمى مع EGFP ناقلات فيروسية في التعبير عن وتصويرها باستخدام دقة منخفضة المجسام epifluorescent. مقياس شريط ، 2 ملم.
الشكل 5. صورة عالية التكبير طبقة fluorescently المسمى 06/05 العصبونات القشرية في الدماغ شريحة سميكة تطهيرها. أ) صورة عالية الدقة مبائر لإسقاط الحد الأقصى Z - المكدس (150 ميكرون سميكة) من خلال تسليط الضوء على المنطقة في (الشكل 4). مقياس بار ، و 25 ميكرون.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نظرا للتطبيق على نطاق واسع من استخدام البروتينات الفلورية لاستهداف الخلايا العصبية فرعية للتحقيق عبر المجهر الضوئي ، والحاجة إلى سرعة الشاشة والصورة وتحليل الشبكات العصبية داخل أنسجة الدماغ سليمة أصبحت لا تقدر بثمن.
التقدم التقني في تطوير سهلة النواقل الفيروسية ، في تقنيات electroporation الحية ، وسلالات الفأر المعدل وراثيا يوفر الآن مصدر غير محدود على ما يبدو من أنواع الخلايا المسمى للتحقيق. وم...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
جيان تشيانغ كونغ موظف في شركة Precisionary ، والصكوك ، التي تقوم بتصنيع منتج المستخدمة في هذه المقالة.
شكر وتقدير
وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق الدعم من خلال مؤسسة ماكنير ، NARSAD ، ومنح NINDS R00NS064171 - 03.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم البند | الشركة | فهرس العدد | تعليقات (اختياري) |
| مقص العظام | FST | 16044-10 | أو ما يعادلها |
| FST | 14084-08 | أو ما يعادلها | |
| نوع IB agarose | سيغما | A0576 | |
| Compresstome | آلات Precisionary | VF - 200 | - vibratomes أخرى متوافقة |
| لاصقة مزدوجة من جانب | جريس بيو مختبرات | SA - S - 1L | |
| Superfrost بلس الشرائح | VWR | 48311-703 | |
| غطاء من الزجاج | VWR | 48383-139 | |
| الجلسرين | EMD شركة الكيماويات | GX0185 - 6 | أو ما يعادلها |
المراجع
- Pfister, H., Lichtman, J., Reid, C. The Connectome Project. , (2009).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
- Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244, 1288-1292 (1989).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F., Saiga, Y. Extraction, purification, and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Gene fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن