يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

Lentiviral بوساطة خلال ضربة قاضية السابقين فيفو تكون الكريات الحمر في الإنسان خلايا الجذعية المكونة للدم

12.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/2813

⸱

يوليو 16, 2011

 ,  , 
1The Sprott Center for Stem Cell Research, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

في هذه المقالة

ملخص

و خارج الحي بروتوكول ناضجة لتوليد خلايا الدم الحمراء من الجذعية المكونة للدم / أسلاف الموصوفة. بالإضافة إلى ذلك وصفنا فعال lentiviral التسليم طريقة لضربة قاضية في TAL1 عامل النسخ في الخلايا الأولية محمر. وأظهر كفاءة تسليم الفيروسة البطيئة بوساطة الجينات باستخدام الفيروسات GFP الإعراب.

الملخص

تكون الكريات الحمر هو نظام نموذجي تستخدم عادة لدراسة تمايز الخلايا. أثناء تكون الكريات الحمر ، والكبار الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) تفرق في oligopotent الأسلاف ، والسلائف ملتزمة وخلايا الدم الحمراء الناضجة 1. وينظم هذه العملية جزءا كبيرا على مستوى الجينات ، حيث عوامل النسخ النسب المحددة تنشيط جينات معينة في حين تقمع متزامنة الجينات التي هي محددة لأنواع الخلايا الأخرى 2. وكثيرا ما تتم الدراسات على عوامل النسخ التي تنظم تكون الكريات الحمر باستخدام خطوط الخلايا البشرية والفئران التي تمثل ، إلى حد ما ، والخلايا الحمر في مراحل معينة من التمايز 3-5. يمكن تحويل خطوط الخلية ولكن جزئيا فقط تحاكي الخلايا محمر والأهم من ذلك أنها لا تسمح لأحد لدراسة مفهومة التغيرات الدينامية التي تحدث مع تقدم الخلايا من خلال عدة مراحل من أجل مصيرهم محمر النهائي. ولذلك ، فإن التحدي الحالي لا يزال في وضع بروتوكول للحصول على السكان متجانسة نسبيا من الخلايا الأولية وHSCs محمر في مراحل مختلفة من التمايز في الكميات التي تكفي لإجراء التجارب والجينوميات البروتيوميات.

نحن هنا وصف خلية فيفو السابقين بروتوكول للحث على تمايز الثقافة محمر من الخلايا الجذعية البشرية / السلف للدم التي تم عزلها من دم الحبل السري سواء ، ونخاع العظام أو الدم المحيطي الكبار حشدت مع G - CSF (leukapheresis). ثقافة هذا النظام ، وضعت في البداية من قبل المختبر Douay 6 ، يستخدم السيتوكينات وشارك الثقافة على خلايا اللحمة المتوسطة لتقليد المكروية نخاع العظام. باستخدام هذا التمايز فيفو السابقين البروتوكول ، أن نلاحظ التضخيم قوية من أسلاف محمر ، وتحريض تمايز حصرا نحو النسب محمر والنضج الكامل إلى مرحلة منزوعة النواة خلايا الدم الحمراء. وبالتالي ، فإن هذا النظام يوفر فرصة لدراسة الآلية الجزيئية لتنظيم النسخي كما تقدم الخلايا الجذعية المكونة للدم على طول نسب محمر.

دراسة تكون الكريات الحمر على الصعيد الترانسكربتي يتطلب أيضا القدرة على عوامل محددة الإفراط في التعبير عن ضربة قاضية أو محمر في الخلايا الأولية. لهذا الغرض ، ونحن نستخدم تسليم الجين الفيروسة البطيئة بوساطة نظام يسمح لكفاءة كل من العدوى وعدم تقسيم تقسيم خلايا 7. هنا نظهر أننا قادرون على ضربة قاضية بكفاءة TAL1 عامل النسخ في الخلايا الأولية محمر الإنسان. بالإضافة إلى ذلك ، GFP التعبير يدل على كفاءة عدوى lentiviral ما يقرب من 90 ٪. وهكذا ، لدينا بروتوكول يوفر نظام مفيدا للغاية لتوصيف الشبكة التنظيمية للعوامل النسخ التي تكون الكريات الحمر السيطرة.

البروتوكول

الجزء الأول. عملية تكوين الكريات الحمراء ex vivo للخلايا الجذعية/السلفية المكونة للدم البشرية

1. عزل الخلايا الجذعية/السلفية المكونة للدم البشرية من النوع CD34+

يتم جمع مجموعة خلايا CD34+ البشرية، التي تحتوي على مزيج من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) والسلائف المبكرة 8، من دم الحبل السري، أو الدم المحيطي الذي تم تحفيزه باستخدام G-CSF (فصادة الكريات البيض)، أو نخاع العظم (الشكل 1-الخطوة 1). في حال استخدام دم الحبل السري أو الدم المحيطي، انتقل مباشرة إلى الخطوة 1.2. أما في حال استخدام نخاع العظم، فابدأ من الخطوة 1.1. للاطلاع على الكواشف والمعدات، راجع الجدول 1.

تُجرى هذه الخطوة تحت ظروف معقمة (أي داخل غطاء التدفق الصفائحي) وفي درجة حرارة الغرفة RT ما لم يُنص على خلاف ذلك.

  1. تحضير معلق خلوي أحادي من نخاع العظم:
    1. إعادة تعليق النخاع في 10 أضعاف حجمه من RPMI 1640 المحتوي على 0.02% collagenase B و 100 U/ml DNase 1
    2. المزج برفق على هزاز ميزان لمدة 45 min.
    3. ترشيح الخلايا عبر شبكة نايلون بقطر 30μm.
  2. عزل الخلايا أحادية النواة (MNCs) منخفضة الكثافة عن طريق طرد مركزي بتدرج كثافة Ficoll:
    1. تخفيف معلق الدم أو النخاع بـ 2-4 أضعاف حجمه من PBS المحتوي على 2% fetal bovine serum (FBS) و 2mM EDTA. ملاحظة: الأحجام الأعلى تزيد من نقاء MNCs.
    2. في أنبوب مخروطي سعة 50 ml، يتم وضع 35 ml من معلق الخلايا المخفف بعناية فوق 15 ml من Ficoll-paque. يُجرى الطرد المركزي عند 400g لمدة 30 min. في دوار ذي دلاء متأرجحة بدون مكابح.
    3. سحب الطبقة العلوية مع ترك طبقة MNCs البينية دون مساس.
    4. نقل طبقة الطور البيني (التي تحتوي على MNCs) إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ml.
    5. إضافة PBS المحتوي على 2% FBS و 2 mM EDTA لملء هذا الأنبوب، والمزج برفق عن طريق قلب الأنبوب، ثم الطرد المركزي عند 300g لمدة 10 min. في درجة حرارة الغرفة (RT). التخلص من الطافي.
    6. غسل قرص الخلايا مرتين إضافيتين لإزالة الصفائح الدموية. ملاحظة: هذه الخطوة تزيد من نقاء خلايا CD34+.
    7. أخذ 20 μl من معلق الخلايا ووضعها في أنبوب eppendorf. إضافة 200 μl من Red Blood Cells Lysis Buffer (الجدول 1) والتحضين في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 2 min. وضع 18 μl من هذا المعلق تحت مقياس كرات الدم (hemocytometer) وعد الخلايا أحادية النواة (MNCs) ذات النواة.
    8. يمكن استخدام MNCs فوراً أو تجميدها بتركيز 108 cell/ml في وسط زراعة الخلايا المحتوي على 10% DMSO وتخزينها في النيتروجين السائل.
  3. عزل خلايا CD34+ عن طريق الاختيار المناعي المغناطيسي الإيجابي (الشكل 1-الخطوة 1)
    نستخدم مجموعة CD34 Microbead Kit (التي تحتوي على محلول من Microbeads المقترنة بأجسام مضادة أحادية النسيلة من الفئران ضد CD34 البشري ومحلول FcR Blocking Reagent يحتوي على IgG بشري) بالاشتراك مع عمودين من نوع LS Mini-Macs، ومحلول autoMACS Running Buffer وجهاز MiniMACS Separator (الجدول 1). نصف أدناه بروتوكولنا بدءاً من 2.3x108 MNCs. في حال استخدام أعداد مختلفة من الخلايا، يجب تعديل الأحجام بالزيادة أو النقصان وفقاً لذلك. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام عمود MS MiniMacs بدلاً من عمود LS MiniMacs لما يصل إلى 2x108 MNCs.
    يجب الحفاظ على الخلايا والكواشف باردة (4-8°C) لمنع تكتل الأجسام المضادة على سطح الخلية والوسم غير النوعي للخلايا.
    1. إعادة تعليق القرص المحتوي على 2.3x108 MNCs في 690 μl من Running Buffer (300 μl لكل 108 MNCs حيث أن 300 μl هو الحد الأدنى لحجم التعليق المطلوب) ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ml.
    2. إضافة 230 μl من FcR Blocking Reagent
    3. إضافة 230 μl من محلول CD34 MicroBeads.
    4. المزج جيداً يدوياً والتحضين لمدة 30 min. عند 4°C.
    5. غسل الخلايا بإضافة 10 ml Running Buffer والطرد المركزي عند 300g لمدة 10 min.
    6. سحب الطافي تماماً.
    7. إعادة تعليق الخلايا في 1.2 ml Running Buffer (استخدام 0.5 ml من المحلول لكل 108 MNCs) ملاحظة: من المهم الحصول على معلق خلوي أحادي قبل الفصل المغناطيسي. إذا لزم الأمر، تمرر الخلايا عبر شبكة نايلون بقطر 30μm لإزالة تكتلات الخلايا.
    8. تجهيز عمود LS بوضعه في المجال المغناطيسي لجهاز MiniMACS Separator.
    9. شطف العمود بـ 3 ml Running Buffer.
    10. وضع 1.2 ml من معلق الخلايا على العمود.
    11. جمع السائل المتدفق واستخدامه للتحقق من حصيلة ونقاء عزل خلايا CD34+. بدلاً من ذلك، يتم تجميد الخلايا الموجودة في هذا الجزء وتخزينها في النيتروجين السائل. ملاحظة: يحتوي هذا الجزء على خلايا غير موسومة ويمكن أن يحتوي أيضاً على بعض خلايا CD34+ الموسومة التي لم تلتصق بالعمود.
    12. غسل العمود ثلاث مرات بـ 3 ml من Running Buffer، وجمع نواتج الغسيل، واستخدام هذا الجزء بشكل مشابه لجزء السائل المتدفق المذكور أعلاه.
    13. إزالة العمود من المغناطيس ووضعه على أنبوب تجميع من البولي بروبيلين سعة 15 ml.
    14. لاستخلاص الخلايا، يتم إضافة 5 ml من Running Buffer إلى العمود وشطف خلايا CD34+ الموسومة فوراً عن طريق دفع المكبس بقوة داخل العمود.
    15. تكرار إجراء تنقية العمود (الخطوات من h إلى n) عن طريق تمرير الخلايا عبر عمود LS مُجهز حديثاً. ملاحظة: هذا يزيد من نقاء خلايا CD34+. من معلق يحتوي على 2.3x108 MNCs معزولة من عملية Leukapheresis، نحصل عادةً على 1.1x106 من خلايا CD34+ بنقاء > 95±3% (الشكل 1-الخطوة 1).
    16. تجميد الخلايا في وسط زراعة يحتوي على 10% DMSO وتخزينها في النيتروجين السائل أو الانتقال مباشرة إلى الخطوة 2).

2. التمايز الحمراوي في المزرعة الخلوية

يتم استزراع خلايا CD34+ في وسط IMDM مُدعم مع إمداد متسلسل من الهيدروكورتيزون وتوليفات محددة من السيتوكينات وفقًا لبروتوكول مكون من أربع خطوات مقتبس من 6 (الشكل 1-الخطوة 2). ويتم إجراء سلسلة من الاختبارات طوال هذه العملية للتحقق من نمو الخلايا والتمايز الكريوي.

يختلف عدد خلايا CD34+ المطلوبة لبدء المزرعة بناءً على نطاق التجربة. عادةً، وبالنسبة لدراسات التعبير الجيني، نقوم بإجراء مزرعة صغيرة النطاق تبدأ بـ 0.1x106 من خلايا CD34+ في 10 ml من الوسط الغذائي، مع الحفاظ على أحجام صغيرة عن طريق تجميد الخلايا الزائدة طوال فترة الإجراء. أما بالنسبة للدراسات التي تتطلب استخلاص البروتين، فتُجرى المزارع على نطاق أكبر. نصف هنا تجربة واسعة النطاق نبدأ فيها بنحو ~7x106 من خلايا CD34+ المعزولة من عملية فصادة الكريات البيضاء.
تُطبق الظروف المعقمة في جميع المراحل. راجع الجداول 1 و 2 و 3 لمعرفة الكواشف.

  1. تحضير الكواشف
    1. حضّر وسط IMDM المكمّل كما هو موضح في الجدول 2 وجمّد حصصاً بحجم 40 ml عند -20°C (يمكن القيام بذلك مسبقاً).
    2. حضّر المحاليل المخزنية للهيدروكورتيزون والسيتوكينات كما هو موضح في الجدول 3.
  2. الخطوة 1: اليوم 0-11
    تُنمّى الخلايا المكونة للدم في وسط IMDM مكمّل يحتوي على الهيدروكورتيزون (HC)، وعامل الخلايا الجذعية (SCF)، وإنترلوكين 3 (IL-3)، والإريثروبويتين (EPO) (الجدول 3). يتم تكثير خلايا MS-5 السدوية لنخاع العظام الفأرية (الجدول 1) استعداداً للخطوة 2.
    • اليوم 0:
      1. قم بتدفئة 120 ml من وسط IMDM المكمّل مسبقاً وأضف HC وSCF وIL-3 وEPO (الجدول 3).
      2. قم بإذابة تجميد 7x106 من خلايا CD34+ بوضع القارورة (أو القوارير) أولاً في حمام مائي عند 37°C. وبينما لا تزال الخلايا مجمدة، أضف 1 ml من الوسط الدافئ وانقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ml. اغسل القارورة بـ 2 ml من الوسط وانقلها إلى الأنبوب سعة 15 ml.
      3. أضف 6 ml من الوسط إلى معلق الخلايا، واخلط عن طريق قلب الأنبوب، ثم قم بالطرد المركزي عند 200 g لمدة 5 min.
      4. اشفط السائل الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا في 10 ml من الوسط الطازج.
      5. عدّ الخلايا الحية باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) بعد خلط 10 μl من معلق الخلايا مع 10 μl من محلول Trypan Blue (الجدول 1). ملاحظة: تبلغ نسبة موت الخلايا حوالي 25% أثناء إذابة التجميد، لذا يجب أن يكون تركيز الخلايا الحية ~0.5x106 خلية/ml.
      6. احتفظ بحوالي 3 ml من معلق الخلايا لإجراء الاختبارات (انظر الفقرة 6).
      7. انقل الـ 7 ml المتبقية إلى قارورة T-175 وأضف 63 ml من الوسط للحصول على 0.05x106 خلية/ml في 70 ml وضع القارورة في حاضنة عند 37°C.
    • اليوم 1:
      1. قم بتدفئة 85 ml من وسط زراعة خلايا MS-5 مسبقاً: αMEM مع Glutamax (الجدول 1)، و10% FBS و100 U/ml من البنسلين و100 μg/ml من الستريبتوميسين.
      2. حضّر ثلاثة أطباق زراعة مستديرة مقاس 150mm x 25mm، كل منها مزروع بـ 2x106 خلية MS-5 في 25 ml من الوسط للحصول على 0.08x106 خلية/ml وضعها في حاضنة عند 37°C. ملاحظة: يتم الحصول على أفضل النتائج باستخدام خلايا MS-5 ذات ممر منخفض (<20). يجب توسيع المزرعة المتلاحمة عن طريق التقسيم بنسبة 1:5 كل ثلاثة أيام باستخدام تريبسين يحتوي على 0.05% EDTA.
    • اليوم 2:
      1. عدّ الخلايا المكونة للدم باستخدام Trypan blue لاستبعاد الخلايا الميتة، واجمع الخلايا اللازمة (أي حوالي 20 ml من المزرعة) للاختبارات (انظر الفقرة 6). ملاحظة: بناءً على خبرتنا، خلال أول يومين، قد يتجاوز موت الخلايا 30-50% وبناءً عليه يكون التركيز النهائي للخلايا عادةً قريباً من تركيز اليوم 0 (الشكل 2).
      2. استبدل وسط زراعة MS-5 بـ 25 ml من الوسط الطازج مع التأكد من إزالة خلايا MS-5 التي لم تلتصق.
    • اليوم 4:
      1. عدّ الخلايا المكونة للدم باستخدام Trypan blue لاستبعاد الخلايا الميتة، واجمع الخلايا اللازمة (أي حوالي 10 ml من المزرعة) للاختبارات (انظر الفقرة 6). ملاحظة: عند هذه النقطة، يجب أن تكون الخلايا قد بدأت في التكاثر مع وجود >75% من الخلايا الحية بتركيز ~0.2x106 خلية/ml. يمكن تجميد الخلايا بتركيز 1-2x106 خلية/ml في وسط IMDM مكمّل يحتوي على 10% DMSO وتخزينها في النيتروجين السائل.
      2. انقل الـ ~40 ml المتبقية من المزرعة إلى قارورة T-175 وأضف ما يكفي من وسط IMDM المكمّل الذي يحتوي على HC وSCF وIL-3 وEPO (الجدول 3) للوصول إلى حجم نهائي قدره 150 ml. ملاحظة: يجب أن يكون تركيز الخلايا ~0.05x106 خلية/ml.
      3. وسّع خلايا MS-5 (التي يجب أن تكون متلاحمة بنسبة 60-70%) عن طريق تخفيفها بنسبة 1:5 في أطباق زراعة مستديرة جديدة مقاس 150mm x 25 mm باستخدام تريبسين 0.05% EDTA. يجب أن يكون تركيز الخلايا النهائي ~0.08x106 خلية/ml. ملاحظة: عادةً، يمكن توسيع الطبق الواحد 5 مرات بحيث يكون لديك 15 طبقاً من خلايا MS-5 بتركيز ~0.08x106 خلية/ml.
    • اليوم 6:
      1. عدّ الخلايا المكونة للدم باستخدام Trypan blue لاستبعاد الخلايا الميتة، واجمع العدد اللازم من الخلايا (أي حوالي 5 ml من المزرعة) للاختبارات (انظر الفقرة 6). ملاحظة: تكون الخلايا في مرحلة تكاثر عالية ويجب الحفاظ على تركيز الخلايا عند ≤1.5x106 خلية/ml. إذا كان تركيز الخلايا أعلى، أضف وسط IMDM مكمّل طازج يحتوي على HC وSCF وIL-3 وEPO.
    • اليوم 7:
      1. عدّ الخلايا المكونة للدم باستخدام Trypan blue لاستبعاد الخلايا الميتة. ملاحظة: بناءً على خبرتنا، تصل الخلايا عادةً إلى كثافة 1.5x106 خلية/ml في اليوم 7.
      2. أضف ما يكفي من الوسط للحفاظ على تركيز خلايا حوالي 0.8x106 خلية/ml. ملاحظة: عادةً ما نضيف 100 ml من وسط IMDM المكمّل الطازج الذي يحتوي على HC وSCF وIL-3 وEPO للحصول على 245 ml من الخلايا بتركيز ~0.8x106 خلية/ml.
      3. وسّع خلايا MS-5 (التي يجب أن تكون متلاحمة بنسبة 60-70%) عن طريق تخفيفها بنسبة 1:5 في قوارير T-175 (بدلاً من الأطباق) باستخدام تريبسين 0.05% EDTA. يجب أن يكون تركيز الخلايا النهائي ~0.08x106 خلية/ml. ملاحظة: يجب تحضير 61 قارورة من خلايا MS-5 بتركيز ~0.08x106 خلية/ml. جمّد خلايا MS-5 المتبقية وخزنها في النيتروجين السائل.
    • اليوم 8:
      1. عدّ الخلايا المكونة للدم باستخدام Trypan blue لاستبعاد الخلايا الميتة، واجمع العدد اللازم من الخلايا (أي حوالي 5 ml من المزرعة) للاختبارات (انظر الفقرة 6). ملاحظة: يجب أن تكون كثافة الخلايا ~1x106 خلية/ml.
      2. قم بتدفئة 2L من وسط IMDM المكمّل الذي يحتوي على SCF وEPO فقط (الجدولان 2 و3) مسبقاً.
      3. اجمع 200 ml من مزرعة الخلايا المكونة للدم (التي تحتوي على ~200x106 خلية)، وقم بالطرد المركزي عند 200 g لمدة 10 min.، واشفط السائل الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا في 40 ml من وسط IMDM المكمّل الذي يحتوي على SCF وEPO.
      4. وزع معلق الخلايا على 8 قوارير T-175 (5 ml لكل قارورة) وأضف 245 ml من وسط IMDM المكمّل الذي يحتوي على SCF وEPO إلى كل قارورة. ملاحظة: أصبح لدينا الآن 8 قوارير، تحتوي كل منها على 250 ml من الخلايا بتركيز 0.1x106 خلية/ml.
      5. يمكن تجميد الخلايا المتبقية (~40ml) في اليوم 8 بتركيز 1-2x106 خلية/ml في وسط IMDM مكمّل يحتوي على 10% DMSO وتخزينها في النيتروجين السائل.
    • اليوم 10:
      1. عدّ الخلايا المكونة للدم باستخدام Trypan blue لاستبعاد الخلايا الميتة، واجمع العدد اللازم من الخلايا (أي حوالي 5 ml من المزرعة) للاختبارات (انظر الفقرة 6). ملاحظة: يجب أن تكون كثافة الخلايا ~1x106 خلية/ml.
  3. الخطوة 2: اليوم 11-15
    يتم جمع حوالي نصف الخلايا للاستخدام المستقبلي (على سبيل المثال، الاستخلاص النووي). يتم استزراع الخلايا الحمراوية المتبقية مع خلايا MS-5 في وسط IMDM مكمّل يحتوي على EPO (الجدولان 2 و3). يجب نقل الخلايا الحمراوية إلى طبقة جديدة من خلايا MS-5 كل 3-4 أيام.
    • اليوم 11:
      1. عدّ الخلايا الحمراوية باستخدام Trypan blue لاستبعاد الخلايا الميتة. ملاحظة: يجب أن تكون كثافة الخلايا ~1.5x106 خلية/ml.
      2. قم بتدفئة 1L من 1xPBS، و400ml من وسط IMDM المكمّل، و5L من وسط IMDM المكمّل الذي يحتوي على EPO (الجدولان 2 و3) عند 37°C مسبقاً.
      3. احتفظ بحجم من المزرعة يعادل 15x108 خلية (مثلاً ~4 قوارير سعة 250 ml لكل منها) وانتقل إلى الفقرة هـ.
      4. الخلايا المتبقية (مثلاً 15x108) تُجمع في أنابيب مخروطية، وتُطرد مركزياً عند 450 g لمدة 10 min.، وتُعاد تعليقها في محلول منظم MS30 بارد (الجدول 5) يحتوي على 0.1mM DTT بحد أقصى 108 خلية/ml وتُخزن عند -80°C بعد التجميد السريع في النيتروجين السائل للاستخدام المستقبلي (مثل المستخلص النووي).
      5. اغسل 50 قارورة من خلايا MS-5 المتلاحمة بـ 20 ml من 1xPBS لكل منها وأضف فوراً 80 ml من وسط IMDM المكمّل الطازج الذي يحتوي على EPO في كل قارورة. ملاحظة: بسبب العدد الكبير من القوارير، نقوم بمعالجة 4 قوارير في المرة الواحدة. تحديداً، نستخرج 4 قوارير من خلايا MS-5 المتلاحمة من الحاضنة، ونغسلها بـ 1xPBS، ونضيف 80 ml من الوسط، ونعيد القوارير إلى الحاضنة. وعندما يتم تحضير جميع القوارير وإعادتها إلى الحاضنة، ننتقل إلى الخطوة و. بسبب عدد القوارير التي ستتم معالجتها في إجراء واسع النطاق، من المفيد أن يقوم شخصان بتنفيذ هذه الخطوات في وقت واحد.
      6. قم بالطرد المركزي لما يعادل 15x108 خلية حمراوية في 4 أنابيب مخروطية عند 450 g لمدة 10 min. وتخلص من السائل الطافي.
      7. اغسل كتل الخلايا الأربع بـ 100 ml من وسط IMDM المكمّل لكل منها.
      8. أعد تعليق كل كتلة خلايا في 250 ml من وسط IMDM المكمّل الذي يحتوي على EPO، ووزع 20 ml من معلق الخلايا هذا على كل من الـ 50 قارورة التي تحتوي على خلايا MS-5 و80ml من الوسط. ملاحظة: في هذه الخطوة، يجب أن يكون لديك 50 قارورة بها خلايا MS-5 متلاحمة تحتوي على 100 ml من الخلايا الحمراوية بتركيز 0.3x106 خلية/ml.
      9. وسّع الـ 11 قارورة المتبقية من خلايا MS-5 عن طريق تخفيفها بنسبة 1:5 في قوارير T-175 باستخدام تريبسين 0.05% EDTA. يجب أن يكون تركيز الخلايا النهائي ~0.08x106 خلية/ml. ملاحظة: يجب تحضير 55 قارورة من خلايا MS-5 بتركيز ~0.08x106 خلية/ml.
    • اليوم 12:
      1. عدّ الخلايا الحمراوية باستخدام Trypan blue لاستبعاد الخلايا الميتة، واجمع العدد اللازم من الخلايا (أي حوالي 4 ml من المزرعة) للاختبارات (انظر الفقرة 6). ملاحظة: يجب أن تكون كثافة الخلايا ~0.6x106 خلية/ml.
    • اليوم 14:
      1. عدّ الخلايا الحمراوية باستخدام Trypan blue لاستبعاد الخلايا الميتة، واجمع العدد اللازم من الخلايا (أي حوالي 3 ml من المزرعة) للاختبارات (انظر الفقرة 6). ملاحظة: يجب أن تكون كثافة الخلايا ~0.9x106 خلية/ml.
  4. الخطوة 3: اليوم 15-18
    تُجمع بعض الخلايا للاستخدام المستقبلي (مثل الاستخلاص النووي). يتم استزراع الخلايا الحمراوية المتبقية مع خلايا MS-5 في وسط IMDM مكمّل بدون سيتوكينات.
    • اليوم 15:
      1. عدّ الخلايا الحمراوية باستخدام Trypan blue لاستبعاد الخلايا الميتة. ملاحظة: يجب أن تكون كثافة الخلايا ~1x106 خلية/ml.
      2. قم بتدفئة 1L من 1xPBS و5L من وسط IMDM المكمّل (الجدول 2) عند 37°C مسبقاً.
      3. احتفظ بحجم من المزرعة يعادل 10x108 خلية (مثلاً ~10 قوارير سعة 100 ml لكل منها) وانتقل إلى الفقرة هـ.
      4. الخلايا المتبقية (مثلاً 40x108) تُجمع وتُعاد تعليقها في محلول منظم MS30 بارد (الجدول 5) يحتوي على 0.1mM DTT للاستخدام المستقبلي (انظر الخطوة 2: اليوم 11 الفقرة د).
      5. اغسل 50 قارورة من خلايا MS-5 المتلاحمة بـ 20 ml من 1xPBS لكل منها وأضف فوراً 80 ml من وسط IMDM المكمّل الطازج في كل قارورة.
      6. قم بالطرد المركزي لما يعادل 10x108 خلية حمراوية في 4 أنابيب مخروطية عند 450 g لمدة 10 min. وتخلص من السائل الطافي.
      7. اغسل كتل الخلايا الأربع بـ 100 ml من وسط IMDM المكمّل لكل منها.
      8. أعد تعليق كل كتلة خلايا في 250 ml من وسط IMDM المكمّل، ووزع 20 ml من معلق الخلايا هذا على كل من الـ 50 قارورة التي تحتوي على خلايا MS-5 و80ml من الوسط. ملاحظة: في هذه الخطوة، يجب أن يكون لديك 50 قارورة بها خلايا MS-5 متلاحمة تحتوي على 100 ml من الخلايا الحمراوية بتركيز 0.2x106 خلية/ml.
      9. وسّع الـ 5 قوارير المتبقية من خلايا MS-5 عن طريق تخفيفها بنسبة 1:5 في قوارير T-175 باستخدام تريبسين 0.05% EDTA. يجب أن يكون تركيز الخلايا النهائي ~0.08x106 خلية/ml. ملاحظة: يجب تحضير 20 قارورة من خلايا MS-5 بتركيز ~0.08x106 خلية/ml. جمّد خلايا MS-5 المتبقية وخزنها في النيتروجين السائل.
    • اليوم 16:
      1. عدّ الخلايا الحمراوية باستخدام Trypan blue لاستبعاد الخلايا الميتة، واجمع العدد اللازم من الخلايا (أي حوالي 4 ml من المزرعة) للاختبارات (انظر الفقرة 6). ملاحظة: يجب أن تكون كثافة الخلايا ~0.6x106 خلية/ml.
  5. الخطوة 4: اليوم 18-26
    تُركز الخلايا الحمراوية بمقدار 3-4 أضعاف للحصول على تركيز نهائي 5-7x106 خلية/ml وتُحفظ على طبقة MS-5 للسماح بالنضج. يُضاف 10% FBS في وسط IMDM المكمّل للسماح بحفظ أفضل لخلايا الدم الحمراء المستزرعة (cRBCs).
    • اليوم 18:
      1. عدّ الخلايا الحمراوية باستخدام Trypan blue لاستبعاد الخلايا الميتة، واجمع العدد اللازم من الخلايا (أي حوالي 2 ml من المزرعة) للاختبارات (انظر الفقرة 6). ملاحظة: يجب أن تكون كثافة الخلايا ~1.7x106 خلية/ml.
      2. قم بتدفئة 300ml من 1xPBS و1.5L من وسط IMDM المكمّل (الجدول 2) الذي يحتوي على 10% FBS عند 37°C مسبقاً.
      3. اغسل 15 قارورة من خلايا MS-5 المتلاحمة بـ 20 ml من 1xPBS لكل منها وأضف فوراً 80 ml من وسط IMDM المكمّل الطازج في كل قارورة.
      4. قم بالطرد المركزي للخلايا الحمراوية (أي ما يعادل 85x108 خلية) عند 450 g لمدة 10 min.، ثم اجمع ووزع الكتلة على 4 أنابيب مخروطية.
      5. أعد تعليق كل كتلة خلايا في 75 ml من وسط IMDM المكمّل الذي يحتوي على 10% FBS ووزع 20 ml من معلق الخلايا هذا على كل من الـ 15 قارورة التي تحتوي على خلايا MS-5 و80ml من الوسط. ملاحظة: في هذه الخطوة، يجب أن يكون لديك 15 قارورة بها خلايا MS-5 متلاحمة تحتوي على 100 ml من الخلايا الحمراوية بتركيز 6x106 خلية/ml.
      6. وسّع الـ 5 قوارير المتبقية من خلايا MS-5 عن طريق تخفيفها بنسبة 1:5 في قوارير T-175 باستخدام تريبسين 0.05% EDTA. يجب أن يكون تركيز الخلايا النهائي ~0.08x106 خلية/ml. ملاحظة: يجب تحضير 20 قارورة من خلايا MS-5 بتركيز ~0.08x106 خلية/ml. جمّد خلايا MS-5 المتبقية وخزنها في النيتروجين السائل.
    • اليوم 20:
      1. عدّ الخلايا الحمراوية باستخدام Trypan blue لاستبعاد الخلايا الميتة، واجمع العدد اللازم من الخلايا (أي حوالي 1.5 ml من المزرعة) للاختبارات (انظر الفقرة 6). ملاحظة: يتم الحفاظ على كثافة الخلايا عند ~1.5x106 خلية/ml.
    • اليوم 22:
      1. عدّ الخلايا الحمراوية باستخدام Trypan blue لاستبعاد الخلايا الميتة، واجمع العدد اللازم من الخلايا (أي حوالي 1.5 ml من المزرعة) للاختبارات (انظر الفقرة 6). ملاحظة: يتم الحفاظ على كثافة الخلايا عند ~1.5x106 خلية/ml.
      2. غيّر الوسط وانقل الخلايا الحمراوية إلى طبقات جديدة من خلايا MS-5 كما هو موضح في اليوم 18.
    • اليوم 24:
      1. عدّ الخلايا الحمراوية باستخدام Trypan blue لاستبعاد الخلايا الميتة، واجمع العدد اللازم من الخلايا (أي حوالي 1.5 ml من المزرعة) للاختبارات (انظر الفقرة 6). ملاحظة: يتم الحفاظ على كثافة الخلايا عند ~1.5x106 خلية/ml.
    • اليوم 26:
      1. عدّ الخلايا الحمراوية باستخدام Trypan blue لاستبعاد الخلايا الميتة، واجمع العدد اللازم من الخلايا (أي حوالي 1.5 ml من المزرعة) للاختبارات (انظر الفقرة 6). ملاحظة: يتم الحفاظ على كثافة الخلايا عند ~1.5x106 خلية/ml.
      2. اجمع خلايا cRBCs غير الملتصقة التي فقدت نواتها وأصبحت محملة بالهيموجلوبين بالكامل. ملاحظة: يمكن حفظ خلايا cRBCs الناضجة في وسط SAGM (MacoPharma) عند 4°C لمدة تصل إلى شهر واحد.
  6. الاختبارات والنتائج الممثلة
    تُجرى الاختبارات التالية في الأيام المحددة للتحقق من تكاثر الخلايا السليم والتمايز الحمراوي. تم الحصول على النتائج الممثلة المعروضة في الأشكال باستخدام خلايا CD34+ معزولة من عملية فصادة الكريات البيضاء (leukapheresis).
    1. يتم عدّ الخلايا كل يومين. انظر النتيجة الممثلة لتكاثر الخلايا في الشكل 2.
    2. يتم إجراء صبغ مورفولوجيا May-Grünwald Giemsa كل يومين باستخدام 0.05 x106 خلية للأيام من 0 إلى 8 و0.2x106 خلية للأيام الأخرى باتباع تعليمات الشركة المصنعة لصبغة Giemsa (الجدول 1). انظر النتائج الممثلة في الشكل 3.
    3. تُجرى مقايسات شبه صلبة في مكررات لقياس السلائف المكونة للدم كل يومين من اليوم 0 إلى اليوم 12 باستخدام 0.01x106 خلية لكل مقايسة باتباع تعليمات الشركة المصنعة لوسط Methocult شبه الصلب (الجدول 1). انظر النتائج الممثلة في الشكل 4.
    4. يتم تحليل علامات الخلايا التالية كل يومين بواسطة FACS: CD34 وCD36 وCD71 وGPA وLDS باستخدام 0.2 x106 خلية لكل مقايسة. انظر النتائج الممثلة في الشكل 5.
    5. يُقاس الهيموجلوبين كل يومين بواسطة صبغ البنزيدين. انظر النتائج الممثلة في الشكل 5.
    6. تُدرس التعبيرات الجينية بواسطة RT-qPCR أو المصفوفات الدقيقة (microarray) بعد استخلاص RNA من 1x106 خلية. انظر النتائج الممثلة في الشكل 6B.

ملاحظات حول النتائج:

يوضح الشكل 1 بروتوكول تمايز خلايا CD34+ البشرية ex vivo إلى خلايا دم حمراء ناضجة تحتوي على الهيموجلوبين. خلال التمايز eritroid، تكون الخلايا عالية التكاثر كما هو موضح من خلال التضخيم بمقدار ~8,000 ضعف الموضح في الشكل 2، والذي تم الحصول عليه باستخدام خلايا CD34+ المعزولة من عملية leukapheresis. وتكون خلايا CD34+ المعزولة من نخاع العظم أقل تكاثراً بقليل مع تضخيم يصل إلى ~6,000 ضعف، بينما يمكن لخلايا CD34+ المعزولة من دم الحبل السري أن تصل إلى تضخيم بمقدار 50,000 ضعف. وتظهر الخلايا في مراحل معينة من التمايز أحجاماً ومورفولوجيات مميزة موضحة في الشكل 3. لاحظ عملية طرد النواة التي تحدث في نهاية التمايز بدءاً من اليوم 20. وفي اليوم 26، تكون جميع الخلايا قد فقدت نواها (الشكل 3).

تُستخدم مقايسات تكوين المستعمرات الموضحة في الشكل 4 للكشف عن السلف الدموية المبكرة والمتأخرة خلال الأيام الأولى من التمايز (من اليوم 0 إلى اليوم 8). وبالإضافة إلى السلف الحمراء (CFU-E و BFU-E)، نلاحظ أن سلف الخلايا المحببة والبلعمية (CFU-GM) ممثلة بشكل كبير ضمن خلايا CD34+ المبكرة في اليوم 0. ومع تقدم التمايز، تنخفض CFU-GM بشكل ملحوظ، وبحلول اليوم 6 يتم استبدالها بالكامل بالسلف الحمراء BFU-E و CFU-E. ومن المهم أيضاً ملاحظة أنه من اليوم 4 إلى اليوم 6، يتم استبدال السلف الحمراء المبكرة BFU-E تدريجياً بنظيراتها الأكثر تمايزاً CFU-E. وبحلول اليوم 10، تفقد الخلايا الحمراء أساساً قدرتها على تكوين المستعمرات.

وأخيراً، يتمت مراقبة عملية تكوين الكريات الحمر من خلال التعبير عن واسمات سطح الخلية كما هو موضح في الشكل 5. لاحظ: 1) الفقدان التدريجي لواسم الخلايا الجذعية/السلفية المكونة للدم CD34؛ 2) الاكتساب والفقدان التدريجي لواسم الخلايا السلفية CD36؛ 3) الاكتساب والفقدان التدريجي لواسم الخلايا السلفية المكونة للدم وواسم الخلايا الشبكية CD71؛ و 4) زيادة واسم سلائف الكريات الحمر وكريات الدم الحمراء GPA. وتشمل الواسمات الأخرى للتمايز المكون للدم تخليق الهيموجلوبين الذي يبدأ في اليوم 8 (يُقاس عن طريق صبغ البنزيدين-الشكل 5) وإخراج النواة من الخلية الذي يبدأ في اليوم 20 ويُقاس عن طريق فقدان صبغ الحمض النووي LDS (الشكل 5). وأخيراً، يمكن قياس التمايز المكون للدم عن طريق تقنية RT-qPCR للواسمات الجزيئية مثل عامل النسخ TAL1 (الشكل 6B) أو جينات β-globin (البيانات غير معروضة).

عادةً ما يوفر 1 ml من دم الحبل السري / فصادة الكريات البيضاء / نخاع العظم ما يعادل 0.35x105 / 0.5x105 / 1.1x105 من خلايا CD34+، والتي يمكنها نظرياً إنتاج 1.7x109 / 0.4x109 / 0.7x109 من خلايا الدم الحمراء بمعدلات تكاثر تبلغ 50,000 / 8,000 / 6,000 على التوالي. وللحصول على 50x106 من خلايا الدم الحمراء في نهاية إجراء التمايز، ستحتاج إلى 50 ml تقريباً من وسط الزرع.

الجزء الثاني. التثبيط بوساطة الفيروسات البطيئة أثناء التمايز الكريوي خارج الجسم

يُعد الفيروس البطيء (Lentivirus) أداة مفضلة لنقل الجينات في الخلايا البشرية الأولية (انظر على سبيل المثال Amsellem et al. 9). وغالباً ما تُستخدم الفيروسات البطيئة لتعطيل الجينات المستهدفة في الخلايا الأولية عبر إيصال shRNA الموجه (انظر على سبيل المثال Laurenti et al. 10). في هذا البروتوكول، نستهدف عامل النسخ TAL1 في الخلايا الحمراء البشرية الأولية. ويُستخدم shRNA بتسلسل عشوائي لا يتوافق مع أي جين معروف كعنصر تحكم سلبي. كما يُستخدم التعبير عن GFP لتقييم كفاءة ترنسدكشن (transduction).

1. تحضير جزيئات الناقل الفيروسي البطيء

للحصول على الجسيمات الفيروسية البطيئة، يتم إجراء ترانسفكشن مشترك لخلايا الكلى الجنينية البشرية 293T باستخدام ثلاثة بلازميدات: أحدها يشتمل على نظام تعبئة فيروسي من الجيل الثاني يشفر جينات HIV-1 باستثناء env وvpr وvif وvpu وnef (أي psPAX2)؛ والآخر يشفر غلاف الفيروس الكاذب من نوع G لفيروس التهاب الفم الحويصلي (أي pMD2G)؛ وبلازميد ناقل لفيروسي بطيء يشفر الجين المستهدف (أي pBLOCK-it6-DEST(shTal1) الذي يشفر TAL1 shRNA، أو pBLOCK-it6-DEST(shScr) الذي يشفر shRNA عشوائي، أو pWPIP الذي يشفر GFP) (الجدول 4). يتم جمع الجسيمات الفيروسية البطيئة من السائل الطافي لمزرعة خلايا 293T التي خضعت للترانسفكشن.

لتجنب إصابة الخلايا بعدوى غير مرغوب فيها، نُجري جميع تجارب الفيروسات البطيئة (تحضير الفيروسات والإصابة) تحت غطاء تدفق هوائي مخصص ومنفصل عن مستنبتات الخلايا الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، يتم التخلص من النفايات الناتجة عن الفيروسات البطيئة بشكل منفصل. إن الفيروسات البطيئة من الجيل الثاني الموصوفة في هذا البروتوكول غير قادرة على التكاثر ويجب التعامل معها ككائنات من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية (Biosafety Level 2). قد تعتمد بعض المؤسسات إجراءات سلامة محددة فيما يتعلق بالفيروسات البطيئة، لذا نوصي باتباع الإرشادات المؤسسية المعتمدة.

نصف هنا بروتوكولاً يوفر جسيمات فيروسية لينتية كافية لإصابة من 1 إلى 2 مليون من الخلايا الحمراء الأولية في أي مرحلة من مراحل التمايز. يجب تعديل الأحجام وفقاً لذلك عند زيادة أو تقليل النطاق. راجع الجدولين 4 و5 لمعرفة الكواشف.

  1. ترنسفكشن خلايا 293T باستخدام فوسفات الكالسيوم.
    1. قبل يوم واحد من الترنسفكشن، يتم استزراع 13.2 x 106 من خلايا 293T في 20 ml من وسط DMEM/High glucose يحتوي على 10% FBS و Pen/Strep في طبق زراعة خلايا بحجم 15-cm. ملاحظة: يجب أن يسمح ذلك للخلايا بالوصول إلى درجة تلاحم (confluency) بنسبة 70% في يوم الترنسفكشن. يتم الحصول على أفضل النتائج باستخدام خلايا 293T ذات ممرات منخفضة (<20).
      اختياري: يمكن طلاء الأطباق بكولاجين من النوع I أو Poly-L-lysine لتعزيز التصاق خلايا 293T.
    2. قبل ساعتين من الترنسفكشن، يتم سحب الوسط من خلايا 293T وإضافة 20 ml من وسط جديد مسخن مسبقاً عند 37°C بلطف. ملاحظة: عادةً ما نبدأ عملية الترنسفكشن في نهاية اليوم.
    3. تُخلط الكواشف التالية في أنبوب سعة 5 ml:
      • 44.8 μg من ناقل التعبير للجين المستهدف (على سبيل المثال shRNA أو GFP- انظر الجدول 4)
      • 13.35 μg من ناقل الغلاف pMD2.G.
      • 33.48 μg من ناقل التغليف psPAX2.
      • إضافة كمية كافية من H2O المعقمة للوصول بالحجم إلى 1.116 ml.
    4. إضافة كمية كافية من H2O المعقمة للوصول بالحجم إلى 1.116 ml.
    5. إضافة 109.8 μl من CaCl2 بتركيز 2.5M والرج باستخدام جهاز الفورتكس للمزج.
    6. في أنبوب مخروطي سعة 50 ml، يتم إضافة 1.116 ml من محلول منظم 2xHBS (الجدول 5).
    7. تحت رج مستمر بجهاز الفورتكس، يُضاف خليط DNA قطرة تلو الأخرى إلى محلول منظم 2xHBS.
    8. يُترك الراسب ليتكون في درجة حرارة الغرفة RT لمدة 20 min. (ليس أكثر من 30 min.).
    9. تُضاف المحلول البالغ 2.3 ml قطرة تلو الأخرى إلى الطبق الذي يحتوي على خلايا 293T، مع تدويره بلطف، ثم تُنقل الخلايا إلى حاضنة عند 37°C لمدة 12-14 ساعة.
    10. في صباح اليوم التالي الباكر، يتم سحب الوسط واستبداله بـ 20 ml من وسط جديد مسخن مسبقاً عند 37°C.
  2. حصد وتركيز الفيروسات البطيئة (Lentivirus)
    1. بعد ثمان وأربعين ساعة من الترنسفكشن، يتم حصد 20 ml من الوسط المحتوي على الفيروسات البطيئة ووضعه في أنبوب مخروطي سعة 50 ml.
    2. تُضاف 20 ml من وسط مسخن مسبقاً عند 37°C إلى خلايا 293T وتُعاد إلى الحاضنة.
    3. يُفصل السائل الطافي الفيروسي بجهاز الطرد المركزي عند 450 g لمدة 10 min. لإزالة أي حطام خلوي ونقله إلى أنبوب 50 ml جديد. بدلاً من ذلك، يمكن تمرير السائل الطافي عبر مرشح 0.45μm. يُخزن السائل الطافي المصفى عند 4°C.
    4. بعد أربع وعشرين ساعة، يتم حصد الـ 20 ml المتبقية من الوسط. ملاحظة: نجد أن عيارات الفيروس متكافئة تقريباً في كلتا عمليتي الحصد، أي 1x 106 TU/ml.
    5. لتركيز الفيروسات، تُوزع السوائل الطافية الفيروسية في أنابيب Beckman OptiSeal (استخدام 32.4 ml من السائل الطافي لكل أنبوب) وتُفصل عند 100,000g لمدة 1.5h عند 4°C باستخدام دوّار متأرجح (swinging rotor). ملاحظة: تشمل الطرق البديلة لتركيز السائل الطافي الفيروسي الطرد المركزي عند 47,000 g لمدة 2h أو عند 3,000 g لمدة 8h. لا تقم بتجميد الفيروس قبل التركيز، لأن التجميد سيؤدي إلى ترسيب البروتينات مما يجعل إعادة تعليق الفيروس أمراً صعباً.
    6. مباشرة بعد الطرد المركزي الفائق، يُسحب السائل الطافي ببطء باستخدام ماصة بلاستيكية 10 ml ويتم التخلص منه. ملاحظة: يجب الحذر من عدم تحريك الراسب الذي قد ينفصل بسهولة عن الأنبوب. بعد التخلص من أول 5ml من السائل الطافي، نقوم عادةً بقص الجزء العلوي من أنبوب الطرد المركزي الفائق للمساعدة في إزالة أكبر قدر ممكن من السائل الطافي، أي ترك حوالي 100-200 μl من الوسط في قاع الأنبوب.
    7. إضافة 100 μl من 1xPBS، ويُترك الراسب ليذوب في درجة حرارة الغرفة RT لمدة 30 min.، ثم يُعاد تعليقه عن طريق السحب والضخ بالماصة 15-20 مرة. ملاحظة: عادةً ما نحصل على حوالي 200-300 μl من الفيروس المركز.
    8. يتم تقدير عيار تحضير الفيروسات البطيئة المركز على خلايا NIH3T3 باستخدام بروتوكول من شركة Invitrogen (Block-it lentiviral RNAi Expression System). ملاحظة: نحصل عادةً على عيارات فيروسية تتراوح بين 2 إلى 10x108 وحدات نقل (TU)/ml.
    9. يمكن الآن استخدام الفيروس للعدوى (انظر الفقرة 2) أو تقسيمه إلى حصص وتخزينه عند -80°C لمدة تصل إلى 6 أشهر. ملاحظة: لا تخضع معلقات الفيروس لأكثر من دورة تجميد وتذويب واحدة. الفيروسات مستقرة لمدة 4-5h عند 37°C، أو 2-3 أيام في درجة حرارة الغرفة RT، أو أسبوع واحد عند 4°C.

2. العدوى الفيروسية البطيئة (Lentiviral infection) للخلايا الحمراء الأولية لنقل الجينات

  1. العدوى
    يمكن إصابة الخلايا المكونة للدم ذات النواة بكفاءة في أي مرحلة من مراحل التمايز طالما تم استخدام MOI (تعدد العدوى) مرتفع يتراوح بين 50-100. نصف هنا تجربة نموذجية حيث تُستخدم الفيروسات البطيئة (lentiviruses) التي تعبر عن TAL1 أو shRNA عشوائي (scramble) لإصابة الخلايا المكونة للدم في اليومين 8 و 9 من التمايز باستخدام MOI قدره 50 TU/cell. يتم استخلاص RNA كل 24 ساعة للتحقق من مستوى تثبيط TAL1 بواسطة RT-qPCR. ويُقاس تعبير GFP بالتوازي بواسطة FACS لتقييم كفاءة العدوى (انظر النتائج الممثلة في الشكل 6).
    • اليوم 0:
      1. تجهيز ثلاثة أنابيب مخروطية سعة 15 ml تحتوي كل منها على 1x106 من الخلايا المكونة للدم (أي أنبوب لتثبيط TAL1، وأنبوب للتحكم السلبي العشوائي، وأنبوب للتحكم في تعبير GFP).
      2. غسل الخلايا بـ 5 ml من وسط IMDM المكمل الذي يحتوي على SCF و EPO (انظر الجزء I)، والتدوير بسرعة 200 g لمدة 5 min. وإزالة أكبر قدر ممكن من السائل الطافي.
      3. إضافة polybrene (الجدول 4) بتركيز نهائي 40 μg/ml إلى محلول الفيروس المركز.
      4. إضافة 100 μl من الفيروس المركز (أي 5x107 TU) المحتوي على polybrene إلى كل أنبوب من الخلايا المكونة للدم.
      5. التحضين لمدة 1 h في الحاضنة عند 37°C والخلط عن طريق النقر بالأصابع كل 10 min. ملاحظة: يجب إجراء العدوى في أقل كمية ممكنة من الأوساط للسماح بأقصى قدر من امتزاز الفيروسات البطيئة على الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، فإن الخلط كل 10 min. يتيح توزيعاً متساوياً للفيروس عبر الخلايا.
      6. إضافة 900 μl من وسط IMDM المكمل الذي يحتوي على SCF و EPO (الجدولان 2 و 3) في كل أنبوب.
      7. نقل كل عينة إلى طبق 6-well ووضعها في الحاضنة عند 37°C لمدة 24 h.
    • اليوم 1: حصد الخلايا في أنابيب منفصلة سعة 15 ml، وتدويرها بسرعة 200 g لمدة 5 min.، وإزالة السائل الطافي وتكرار عملية العدوى (الخطوات من b إلى g أعلاه).
    • اليوم 2: غسل الخلايا وإعادة تعليقها بتركيز 0.2x106 cell/ml في وسط IMDM مكمل يحتوي على SCF و EPO والمتابعة كما في الجزء I.
  2. النتائج الممثلة
    يوضح الشكل 6A بروتوكول عدوى الفيروسات البطيئة للخلايا المكونة للدم الأولية متبوعاً باستخلاص RNA. في إحدى التجارب، قمنا بإصابة الخلايا المكونة للدم بفيروسات بطيئة تنتج shRNA يستهدف عامل النسخ TAL1 أو تحكماً عشوائياً 11. يظهر الشكل 6B أننا نجحنا في تثبيط 75% من نسخ TAL1 في الخلايا المكونة للدم الأولية. يرجى ملاحظة أيضاً زيادة مستوى نسخ TAL1 من اليوم 9 إلى اليوم 12 في التحكم العشوائي، مما يؤكد أهمية عامل النسخ هذا أثناء التمايز المكون للدم. وفي تجربة أخرى، قمنا بإصابة الخلايا المكونة للدم بفيروسات بطيئة تعبر عن بروتين GFP. يظهر الشكل 6C أنه بعد ثلاثة أيام من العدوى، تعبر معظم الخلايا المكونة للدم (87%) عن GFP كما تم قياسه بواسطة الفلورة تحت المجهر و FACS. وهذا يشير إلى كفاءة عالية للعدوى في الخلايا المكونة للدم الأولية. لقد قمنا سابقاً بإصابة خلايا CD34+ في اليوم 0 بكفاءة عدوى مماثلة (البيانات غير معروضة). المعلمة الأكثر أهمية للنقل الفعال للخلايا الأولية هي استخدام MOI مرتفع (أي فيروسات بطيئة مركزة). إذا تم استخدام MOI منخفض (أي فيروس غير مركز)، فإن كفاءة النقل ستنخفض.

3. النتائج النموذجية

مخطط العزل الإيجابي للخلايا الجذعية المكونة للدم CD34+؛ الفصل المناعي المغناطيسي، التمايز المكون لكرات الدم الحمراء الخالي من المصل.
الشكل 1. مخطط بروتوكول عزل الخلايا الجذعية/السلفية المكونة للدم البشرية الأولية وتمايزها إلى خلايا دم حمراء خارج الجسم. (الخطوة 1) يتم عزل خلايا CD34+ (بدرجة نقاء 95 ± 3%) من دم الحبل السري، أو نخاع العظم، أو الدم المحيطي البشري الذي تم تحفيزه بواسطة G-CSF (فصادة الكريات البيضاء) باستخدام الاختيار المناعي المغناطيسي الإيجابي. (الخطوة 2) يتم إنماء خلايا CD34+ في مزرعة سائلة وفقاً لبروتوكول الخطوات الأربع الموضح.

رسم بياني لتضخيم الخلايا؛ مقياس لوغاريتمي؛ أيام المزرعة مقابل تحليل اتجاه نمو الخلايا.
الشكل 2. تضخيم الخلايا خلال بروتوكول التمايز الكريوي ex vivo. النتائج بمقياس لوغاريتمي. نتائج نموذجية تم الحصول عليها باستخدام خلايا CD34+ المعزولة من عملية فصادة الكريات البيضاء.

مخطط لمراحل تكوين الكريات الحمراء، صور مجهرية تتبع تطور خلايا RBC على مدار 26 يومًا.
الشكل 3. التحليل المورفولوجي للخلايا أثناء التمايز eritroid خارج الجسم الحي. صُبغت الخلايا باستخدام كاشف May-Grünwald-Giemsa في النقاط الزمنية المحددة أثناء التمايز (تكبير x 40). HSC: الخلايا الجذعية/السلفية المكونة للدم؛ BFU-E: وحدات تكوين الانفجار - الحمراء؛ CFU-E: وحدات تكوين المستعمرات - الحمراء؛ Pro EB: أرومات الحمراء الأولية؛ Baso EB: أرومات الحمراء القاعدية؛ Poly EB: أرومات الحمراء متعددة الألوان؛ Ortho EB: أرومات الحمراء القائمة اللون؛ RET: الخلايا الشبكية؛ RBC: خلايا الدم الحمراء.

مخطط مقايسة شبه صلبة؛ نمو الخلايا السلفية CFU-GM، BFU-E، CFU-E؛ أيام زراعة الخلايا؛ مقارنة الصور.
الشكل 4. مقايسات الخلايا المكونة للمستعمرات (CFC) للكشف عن الخلايا السلفية المكونة للدم وتقدير كميتها. في النقاط الزمنية المحددة، تم استزراع 104 خلية في وسط ميثيل سليلوز شبه صلب بوجود سيتوكينات بشرية مأشوبة: rh SCF و rh GM-CSF و rh G-CSF و rh Il-3 و rh EPO لدعم النمو الأمثل للخلايا السلفية الحمراء (BFU-E و CFU-E) والخلايا السلفية المكونة للمنخلية والبلعمية (CFU-GM). BFU: وحدات تكوين الانفجار؛ CFU: وحدات تكوين المستعمرات. تظهر أيضاً صور نموذجية لـ BFU-E و CFU-E. لاحظ اللون البني المحمر الناتج عن تكوين الهيموجلوبين في BFU-E و CFU-E.

رسوم بيانية للتمايز المكون للدم تظهر واسمات الخلايا CD34، CD36، CD71، GPA، Benzidine، LDS بمرور الوقت.
الشكل 5. حركية الواسمات المكونة للدم/الحمراء أثناء التمايز المكون للدم ex vivo. في النقاط الزمنية المحددة، تم حصاد 2x105 خلية وتحليل التعبير عن الواسمات المحددة بواسطة FACS (CD34، CD36، CD71، GPA و LDS) أو بواسطة المجهر (Benzidine). تمثل الأعمدة النسب المئوية للخلايا الإيجابية. CD34: بروتين سكري عبر غشائي، يوجد في الخلايا الجذعية/السلفية المكونة للدم البشرية؛ CD36: مستقبل الثرومبوسبوندين، يوجد في الخلايا السلفية؛ CD71: مستقبل الترانسفيرين، يوجد في الأسلاف الحمراء والخلايا الشبكية؛ GPA: جليكوفورين A، يوجد في السلائف الحمراء وكريات الدم الحمراء؛ Benzidine: صبغة الهيموجلوبين؛ LDS: صبغة الليزر ستيريل، صبغة DNA.

الجدول الزمني لإصابة الفيروسات البطيئة بـ shRNA، والرسم البياني الشريطي للتعبير عن mRNA لـ TAL1، ومجهر GFP، وقياس التدفق الخلوي.
الشكل 6. نقل الجينات بوساطة الفيروسات البطيئة في الخلايا الأولية المكونة لكريات الدم الحمراء البشرية. (A) الجدول الزمني لتحريض تثبيط TAL1 (KD) في الخلايا الأولية المكونة لكريات الدم الحمراء باستخدام نظام توصيل الجينات الفيروسي البطيء. (B) تم تثبيط TAL1 بوساطة anti-Tal1 shRNA المنقول عبر الفيروسات البطيئة (TAL1 KD) أو shRNA تحكم مبعثر (Scr). تم قياس حركية مستوى نسخ TAL1 mRNA بواسطة RT-qPCR. تم التعبير عن نسخة TAL1 بالنسبة إلى 18S RNA. (C) تم اختبار GFP المنقول عبر الفيروسات البطيئة بواسطة المجهر (اللوحة اليسرى) أو FACS (اللوحة اليمنى). كانت 87% من الخلايا موجبة لـ GFP.

4. المواد

الكاشفالمصدررقم الكتالوج
RPMI 1640 SigmaR8758
Collagenase BRoche Applied Science11088807001
DNase ISigmaD5025-15KU
مرشحات ما قبل الفصل (شبكة نايلون 30μm)Miltenyi Biotec Inc130-041-407
Ficoll-paque PLUS GE Healthcare Bio-Sciences17-1440-03
EasySep 10x محلول منظم لتحليل كرات الدم الحمراءStemCell Technologies20120
CD34 MicroBead KitMiltenyi Biotec Inc130-046-703
أعمدة LS Mini-MacsMiltenyi Biotec Inc130-042-401
autoMACS Running Buffer-MACS Separation BufferMiltenyi Biotec Inc130-091-221
MiniMACS SeparatorMiltenyi Biotec Inc130-042-102
خلايا سدو نخاع العظم للفئران MS-5 (يتم اختبارها بانتظام للكشف عن تلوث الميكوبلازما)DSMZACC 441
محلول Trypan Blue (0.4%)SigmaT8154
MEM Alpha+GlutaMAX Gibco Invitrogen 32571
Trypsin 0.05%/EDTAThermoScientific J101521
May Grunwald Giemsa Biostain Ready Reagents Ltd RRSP54
Methocult مقايسات الخلايا المكونة للمستعمرات (CFC) للخلايا البشرية StemCell Technologies 04044

الجدول 1.

المكونالمحلول المخزونالحجم 600 ml
IMDMSigma I3390443.4 ml
Pen/Strept 1% (vol/vol)Gibco 103786ml
L-glutamine 4x10-3M200mM (Gibco 25030)12 ml
Inositol 40μg/ml4mg/ml (Sigma I5125)
التحضير: أذب 28 mg من المسحوق في 7 ml من IMDM وقم بالتعقيم بالترشيح- يبقى مستقراً لمدة أسبوع واحد عند 4°C.		6ml
Folic acid 10μg/ml1 mg/ml (Sigma F7876)
التحضير: أذب 7 mg من المسحوق في 7 ml من IMDM المسخن مسبقاً وقم بالتعقيم بالترشيح- يبقى مستقراً لمدة أسبوع واحد عند 4°C. يتم التسخين المسبق قبل الاستخدام.		6ml
Monothioglycerol 1.6x10-4M0.16M (Sigma M6145)
التحضير: أذب 10 μl من المحلول المخزون بتركيز 11.56M في 712 μl من IMDM وقم بالتعقيم بالترشيح- يبقى مستقراً لمدة أسبوع واحد عند 4°C.		0.6ml
Ferrous nitrate 90 ng/ml18μg/ml ( Sigma 8508)
التحضير: أذب 1.8 mg في 1ml من الماء المقطر. خذ 0.1 ml وأضف 9.9 ml من IMDM وقم بالتعقيم بالترشيح- يبقى مستقراً لمدة أسبوع واحد عند 4°C.		3ml
Ferrous sulfate 900 ng/ml180 μg/ml ( Sigma F8633)
التحضير: أذب 18 mg في 1ml من الماء المقطر. خذ 0.1 ml وأضف 9.9 ml من IMDM وقم بالتعقيم بالترشيح- يبقى مستقراً لمدة أسبوع واحد عند 4°C.		3ml
Bovine serum albumine-Insulin-Transferrin (BIT)
20% (vol/vol)		StemCell Technologies 9500120 ml

جدول 2.

المكونالمحلول المخزونالحجم المضاف إلى 100 ml من وسط IMDM المدعم (الجدول 2)
هيدروكورتيزون (HC) 10-6 M10-4 M (Sigma H2270)
التحضير: أذب 5mg من المسحوق في 1.03ml من وسط IMDM. خذ 0.1 ml وأضف إليها 9.9 ml من وسط IMDM ثم قم بالتعقيم بالترشيح. يبقى مستقراً لمدة أسبوع واحد عند 4°C.		1ml
عامل الخلايا الجذعية (SCF) 100ng/ml100 μg/ml (Cedarlane 4327-50)
التحضير: أذب 50 μg من المسحوق في 500 μl من محلول PBS+0.1% BSA وقم بالتعقيم بالترشيح. قسم المحلول إلى حصص حجم كل منها 100 μl وتُحفظ عند -20°C.		100 μl
إريثروبويتين (EPO) 3 IU/ml100 μg/ml بما يعادل 12,000UI/ml (Feldan FB03-10-290)
التحضير: أذب 50 μg من المسحوق في 500 ml من محلول PBS+0.1% BSA وقم بالتعقيم بالترشيح. قسم المحلول إلى حصص حجم كل منها 25 ml وتُحفظ عند -20°C.		25 μl
إنترلوكين 3 (IL3) 5 ng/ml100 μg/ml (Feldan FB03-10-330)
التحضير: أذب 10 μg من المسحوق في 100 μl من محلول PBS+0.1% BSA وقم بالتعقيم بالترشيح. قسم المحلول إلى حصص حجم كل منها 5 ml وتُحفظ عند -20°C.		5 μl

الجدول 3.

الكاشفالمصدرالمرجع
خلايا 293T
(يتم اختبارها بانتظام للكشف عن تلوث الميكوبلازما) 		ATCCCRL-11268
DMEM/High GlucoseThermoScientificSH30243.01
بروميد الهكساديميثرين (Polybrene)SigmaH9268-5G
أنابيب طرد مركزي فائقة OptiSealBeckman Coulter361625
بلازميد psPAX2Addgene (مختبر D. Trono)12260
بلازميد pMD2.GAddgene (مختبر D. Trono)12259
بلازميد pBLOCK-it6-DEST (shTal1)تسلسل shRNA لـ Tal1 مستنسخ في بلازميد pBLOCK-it6-DEST من InvitrogenPalii et al. EMBO J.
بلازميد pBLOCK-it6-DEST (shScr)تسلسل shRNA عشوائي مستنسخ في بلازميد pBLOCK-it6-DEST من InvitrogenPalii et al. EMBO J.
بلازميد pWPIAddgene (مختبر D. Trono)12254

الجدول 4.

المحلول المنظمالتحضيرالتركيز النهائي
2xHBS
  • 1.6 g NaCl
  • 1.3 g HEPES
  • 0.04 g Na2HPO4(7H2O)
  • إضافة ماء Milli-Q.
  • ضبط pH بدقة لتكون 7.11-7.13 عن طريق إضافة محلول NaOH، ثم الإكمال بماء Milli-Q حتى 100 ml.
  • تدقيق pH لتصبح 7.11-7.13.
  • التعقيم بالترشيح، وتقسيم المحلول إلى حصص سعة 10 ml وتخزينها في درجة حرارة -200C
  • 280 mM
  • 100 mM
  • 1.5 mM
CaCl2
  • 2.77 g CaCl2 anhydrous
  • الإذابة في 10 ml ماء Milli-Q.
  • التعقيم بالترشيح، وتقسيم المحلول إلى حصص سعة 1 ml وتخزينها في درجة حرارة -20°C
  • 2.5M
MS30
  • 25ml من [2M] Tris pH8.0
  • 5ml من [0.5M] EDTA
  • 300ml من Glycerol
  • 50mM
  • 2.5mM
  • 30% (v/v)

الجدول 5.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد تم استخدام عدد من الأساليب للتمييز من قبل الخلايا الحمر في الثقافة بدرجات متفاوتة من النجاح. على سبيل المثال ، بعض البروتوكولات بدون ثقافة مشتركة على MS - 5 يتيح التوسع في الخلايا محمر ولكن ليست فعالة في انتاج ناضجة تماما منزوعة النواة خلايا الدم الحمراء 12-17. في حين أن الوسائل الأخرى تسمح استئصال كفاءة ، فهو على حساب انتشار 18،19. الطريقة التي استخدمناها هنا ، وضعت في البداية من قبل المختبر Douay 6 ، يجمع بين الثقافة خطوة أولية السائل ، الذي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر L. Douay ومولودية Giarratana (جامعة باريس السادسة ، فرنسا) للحصول على المشورة بشأن المفاضلة المجراة سابقا محمر ، D. ألان واتكينز H. (OHRI ، كندا) لتوفير عينات الدم (التي تم الحصول عليها تحت مستشفى أوتاوا مجلس أخلاقيات البحث # 2007804 - 01H) ، D. Trono (ايكول بوليتكنيك دي الاتحادية لوزان) لتوفير ناقلات lentiviral وFJ Dilworth (OHRI ، كندا) لقراءة نقدية للمخطوطة. وقد تم تمويل هذا المشروع من خلال منحة CIHR (MOP - 82813) لMBCGP هي المستفيدة من صندوق البحوث أونتاريو الحاسوبية زمالة التدريب Regulomics بعد الدكتوراة. MB يحمل كرسي أبحاث كندا في تنظيم التعبير الجيني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المراجع

  1. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
  2. Kim, S. I., Bresnick, E. H. Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles. Oncogene. 26, (2007).
  3. Friend, C., Patuleia, M. C., De Harven, E. Erythrocytic maturation in vitro of murine (Friend) virus-induced leukemic cells. Natl Cancer Inst Monogr. 22, 505-522 (1966).
  4. Weiss, M. J., Yu, C., Orkin, S. H. Erythroid-cell-specific properties of transcription factor GATA-1 revealed by phenotypic rescue of a gene-targeted cell line. Mol Cell Biol. 17, 1642-1651 (1997).
  5. Lozzio, B. B., Lozzio, C. B., Bamberger, E. G., Feliu, A. S. A multipotential leukemia cell line (K-562) of human origin. Proc Soc Exp Biol Med. 166, 546-550 (1981).
  6. Giarratana, M. C. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
  7. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Curr Protoc Neurosci. Chapter 4, (2006).
  8. Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
  9. Amsellem, S., Ravet, E., Fichelson, S., Pflumio, F., Dubart-Kupperschmitt, A. Maximal lentivirus-mediated gene transfer and sustained transgene expression in human hematopoietic primitive cells and their progeny. Mol Ther. 6, 673-677 (2002).
  10. Laurenti, E. Inducible gene and shRNA expression in resident hematopoietic stem cells in vivo. Stem Cells. 28, 1390-1398 (2010).
  11. Palii, C. G. Differential genomic targeting of the transcription factor TAL1 in alternate haematopoietic lineages. EMBO J. 30, 494-509 (2011).
  12. Fibach, E., Manor, D., Oppenheim, A., Rachmilewitz, E. A. Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture. Blood. 73, 100-103 (1989).
  13. Wada, H. Expression of major blood group antigens on human erythroid cells in a two phase liquid culture system. Blood. 75, 505-511 (1990).
  14. Sui, X. Erythropoietin-independent erythrocyte production: signals through gp130 and c-kit dramatically promote erythropoiesis from human CD34+ cells. J Exp Med. 183, 837-845 (1996).
  15. Panzenbock, B., Bartunek, P., Mapara, M. Y., Zenke, M. Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro. Blood. 92, 3658-3668 (1998).
  16. Lindern, M. von The glucocorticoid receptor cooperates with the erythropoietin receptor and c-Kit to enhance and sustain proliferation of erythroid progenitors in vitro. Blood. 94, 550-559 (1999).
  17. Freyssinier, J. M. amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors. Br J Haematol. 106, 912-922 (1999).
  18. Malik, P. An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells. Blood. 91, 2664-2671 (1998).
  19. Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation. Blood. 103, 4310-4316 (2004).
  20. Mazurier, F. Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein. Gene Ther. 5, 556-562 (1998).
  21. Salmon, P. High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors. Blood. 96, 3392-3398 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

عزل الخلايا الموجبة لـ CD34المزرعة المشتركة للخلايا السدويةبروتوكول العدوى بالفيروس البطيءتحليل تعبير GFPالتحقق من تثبيط التعبير بواسطة RT-qPCRعامل النسخ TAL1بروتوكول التمايز الحمراوي
Lentiviral بوساطة خلال ضربة قاضية السابقين فيفو تكون الكريات الحمر في الإنسان خلايا الجذعية المكونة للدم
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.