تنبيغ من خلايا الإنسان مع البوليمر المعقد Ecotropic الفيروسة البطيئة للسلامة الأحيائية المحسن

ملخص

Lentiviruses هي أداة بحث قيما لاستكشاف وظائف الجينات ، إلا أن الباحثين قد ترغب في تجنب إنتاج ترميز الفيروسة البطيئة شمولي التوجه المسرطنة المعروفة أو المشتبه بهم. كبديل ، نقدم أكثر أمانا لاستخدام بروتوكول الفيروسة البطيئة ecotropic على الخلايا البشرية المعدلة للتعبير عن mSlc7a1 مستقبلات ecotropic.

الملخص

الجذعية وبيولوجيا الخلايا السرطانية دراسات غالبا ما تتطلب تنبيغ الفيروسية من الخلايا البشرية والجينات المسرطنة المعروفة أو المشتبه بهم ، ورفع القضايا الرئيسية لسلامة العاملين في المختبرات. lentiviruses شمولي التوجه ، مثل pseudotype VSV - G شيوعا ، هي أداة قيمة لدراسة وظائف الجينات لأنها يمكن أن تنبيغ أنواع الخلايا عديدة ، بما في ذلك الخلايا غير الانقسام. ومع ذلك ، قد ترغب في تجنب الباحثين الإنتاج والطرد من الفيروسات المسرطنة ترميز شمولي التوجه نتيجة لارتفاع مستوى متطلبات السلامة الأحيائية المناولة وقضايا السلامة. ومن المعروف المسرطنة قوية عدة ، بما في ذلك C - Myc وSV40 المستضد T كبيرة ، لتعزيز إنتاج يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSC). كل أخرى معروفة iPSC الذي يحفز التغيرات الجينية (OCT4 ، SOX2 ، KLF4 ، NANOG ، LIN28 ، وفقدان وظيفة البروتين p53) وأيضا وصلات إلى السرطان ، مما يجعلها ذات الاهتمام سلامة عالية نسبيا أيضا.

في حين أن هذه الفيروسات المرتبطة بالسرطان مفيدة في دراسة إعادة برمجة الخلايا وتعدد القدرات ، لا بد من استخدامها بأمان. لمعالجة هذه القضايا المتعلقة بالسلامة الأحيائية ، ونحن يبرهن على وجود طريقة لتنبيغ الخلايا البشرية ecotropic الفيروسة البطيئة ، مع التركيز على خفض تكلفة إضافية والمناولة المريحة. أنتجنا الفيروسة البطيئة ecotropic مع عيار مرتفع بما فيه الكفاية لتنبيغ أكبر من 90 ٪ من الخلايا المستقبلة للتعبير عن الإنسان يتعرض للفيروس ، والتحقق من فعالية هذا النهج.

ويتركز أغلب الأحيان بواسطة تنبيذ فائق الفيروسة البطيئة ، ولكن هذه العملية تستغرق عدة ساعات ويمكن ان تنتج الهباء المعدية للباحثين الطب الحيوي الإنسان. كما يمكن أن يكون بديلا ، والجسيمات الفيروسية بأمان أكبر الرسوبية على الخلايا complexation مع كبريتات شوندروتن وpolybrene (CS / PB). هذا الأسلوب يزيد من عيار الفيروسية وظيفية تصل إلى أضعاف 3 في خلايا الفئران ستابلي التعبير عن مستقبلات الفيروس الارتجاعي ، مع تذكر الوقت المحتسب بدل الضائع والتكاليف. ومما يعزز من الحد الأقصى تنبيغ الخلايا الليفية الجلد البشري (HDFs) باستخدام CS / PB تركيزات ما يقرب من 4 أضعاف أقل من القيمة المثلى ذكرت سابقا لخطوط الخلايا السرطانية ، مما يوحي معاير ينبغي أن تركيز البوليمر لنوع من الخلايا المستهدفة من الفائدة. وصفنا ذلك استخدام بروميد methylthiazolyldiphenyl - tetrazolium (MTT) لفحص للسمية البوليمر في نوع من الخلايا الجديدة. نلاحظ بقاء يعادل HDFs بعد تنبيغ الفيروسية باستخدام البوليمر complexation أو جرعة قياسية من polybrene (PB ، 6 ميكروغرام / مل) ، مشيرا إلى الحد الأدنى من السمية الحادة.

في هذا البروتوكول ، ونحن تصف استخدام الفيروسة البطيئة لecotropic overexpression من الجينات المسرطنة في الخلايا البشرية ، والحد من مخاطر السلامة البيولوجية وزيادة معدل تنبيغ. نظهر أيضا استخدام complexation البوليمر لتعزيز تنبيغ مع تجنب تشكيل الهباء الطرد المركزي من الجسيمات الفيروسية.

البروتوكول

1. إنتاج الفيروسات البطيئة وحصادها وتجميدها

1. راجع مسؤول السلامة في مؤسستك قبل البدء في هذا البروتوكول، واتبع إرشادات السلامة الموصى بها.
2. اليوم 1. ابدأ بخلايا 293T صحية وسريعة النمو لإنتاج الفيروس. ازرع الخلايا بكثافة 5 x 10⁶ خلية لكل طبق مقاس 10 سم. استخدم وسط 293T خالٍ من المضادات الحيوية (DMEM عالي الجلوكوز مع 10% FBS و 4 mM L-glutamine) لإنتاج الفيروس.
3. اليوم 2. في وقت متأخر من بعد الظهر، قم بنقل الجينات (transfect) إلى خلايا 293T كما يلي (الأرقام المذكورة لطبق واحد مقاس 10 سم). اترك جميع الكواشف لتصل إلى درجة حرارة الغرفة. انقل 375 μl من OptiMEM إلى أنبوب طرد مركزي دقيق، ثم أضف 25 μl من Fugene HD. لا تسمح لـ Fugene غير المخفف بملامسة سطح الأنبوب.
4. في أنبوب طرد مركزي دقيق، اخلط ما يلي:
   • 5 μg من بلازميد النقل (Slc7a1، أو ناقل مستهدف، أو ناقل تحكم فلوري)
   • 3.75 μg من بلازميد التعبئة (pCMV-dR8.91 أو psPax2)
   • 1.25 μg من بلازميد الغلاف (pMD2.G للفيروسات الشاملة pantropic، أو pHCMV-EcoEnv للفيروسات المحدودة ecotropic)
   • OptiMEM خالٍ من المصل حتى يصل الحجم إلى 100 μl
5. اجمع الأنبوبين معاً واترك الخليط ليتحضن لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
6. استبدل الوسط في خلايا 293T بـ 10 ml من وسط 293T طازج وخالٍ من المضادات الحيوية. أضف مزيج Fugene/بلازميد على شكل قطرات إلى الطبق، واتركه ليتحضن طوال الليل عند 37°C و 5% CO₂.
7. اليوم 3. استبدل الوسط في خلايا 293T بـ 10 ml من وسط 293T طازج وخالٍ من المضادات الحيوية. تعامل بحذر، لأن خلايا 293T تلتصق بشكل ضعيف ويمكن أن تنفصل إذا تم نقل الأوساط بقوة مفرطة فوق الطبقة الخلوية. اترك الخلايا تتحضن لمدة يومين في حضانة رطبة لإنتاج الفيروس.
8. اليوم 5. اجمع الفيروس وقم بترشيحه باستخدام مرشح 0.45 mm منخفض الارتباط بالبروتين. استخدمه فوراً أو قسمه إلى حصص فردية وجمدة عند -80°C. يجب إعادة تقدير عيار (titer) الفيروسات المجمدة الشاملة (pantropic) والمحدودة (ecotropic) بعد تخزينها لمدة ستة أشهر وشهر واحد، على التوالي.
9. قدّر عيار الفيروس كما يلي، باستخدام خلايا قابلة للنقل الجيني (transduction) نسبياً. انقل الفيروس التحكم الفلوري إلى الخلايا طوال الليل باستخدام تخفيفات متسلسلة (مثلاً 1:10، 1:100، 1:1000) في وسط طازج يحتوي على 6 μg/ml من PB. استبدل الوسط بوسط طازج في اليوم التالي. اترك الخلايا لمدة يومين بعد عملية النقل ليبدأ التعبير عن البروتين الفلوري، ثم حدد نسبة الخلايا المنقولة جينياً باستخدام تقنية FACS. احسب العيار بوحدات التحويل (TU) لكل ml، بناءً على التخفيفات التي تعطي < 15% من النقل الجيني لتقليل أحداث النقل المتعددة.
   

2. ترنسدكشن الخلايا البشرية المستهدفة بمستقبل الفيروس القهقري الفأري Slc7a1

1. اختر تعددية عدوى (MOI) = 2 لضمان نقل الجينات إلى معظم الخلايا. وبالنسبة للخلايا المستهدفة المقاومة للنقل مثل HDFs، ستكون هناك حاجة إلى MOI أعلى؛ حيث نقوم بتخفيف supernatant الفيروسي بنسبة 1:2 فقط لتحقيق نقل الجينات إلى غالبية الخلايا.
2. قم بنقل الجينات إلى الخلايا المستهدفة طوال الليل باستخدام supernatant فيروسي مخفف في وسط زرع جديد يحتوي على 6 μg/ml PB، مما يزيد من كفاءة النقل عن طريق تعزيز التفاعل الكهروستاتيكي بين الفيروس والخلية المستهدفة.¹ ومن الناحية المثالية، يجب استخدام أقل حجم ممكن من الفيروس، مثل 1 ml لطبق بقطر 35 mm، لأن الانتشار يعد عاملاً محدداً لكفاءة نقل الجينات.
3. ازرع الخلايا لمدة 48 ساعة على الأقل بعد إزالة الفيروس قبل نقل الجينات إليها باستخدام فيروس ecotropic، وذلك لضمان التعبير الكافي لمستقبل Slc7a1.
4. (اختياري) يمكن استخدام blasticidin لاختيار الخلايا التي تم نقل الجينات إليها بشكل مستقر والتي تعبر عن Slc7a1، إذا رغبت في ذلك. يجب إنشاء منحنى قتل blasticidin مسبقاً لتحديد أدنى تركيز فعال، والذي يتراوح عموماً بين 2 – 10 μg/ml، والذي يقتل جميع الخلايا المستهدفة غير المنقولة جينياً في غضون 7 أيام. بعد حوالي يومين من إزالة فيروس Slc7a1، انقل الخلايا المنقولة جينياً إلى وسط يحتوي على blasticidin. ازرع الخلايا في الوسط المحتوي على blasticidin لمدة 7 أيام، وعند هذه النقطة ستعبر جميع الخلايا المتبقية عن مستقبل الفيروس القهقري بشكل مستقر، مما يسمح بنقل الجينات إليها باستخدام فيروس ecotropic وكذلك حفظها للاستخدام المستقبلي كخط خلوي مستقر يعبر عن Slc7a1.

3. معايرة معقد البوليمر لتحديد السمية

1. اليوم الأول. يتم توزيع الخلايا بكثافة 5000 cells/well في طبق 96-well plate، مع تخصيص ثلاث آبار مكررة على الأقل لكل مجموعة تجريبية. تُدرج خلايا غير منقولة في وسط غذائي كامل لتوفير قيمة أساسية للخلايا السليمة، بالإضافة إلى عينات تتكون من خلايا في وسط خالٍ من المصل لتحفيز توقف النمو كعينة ضابطة. وبالتوازي مع ذلك، تُوزع الخلايا في تنسيق مناسب (مثل طبق 24-well plate) لإجراء تحليل مجهري أو تحليل قائم على FACS لكفاءة النقل في كل حالة تجريبية.
2. اليوم الثاني. يتم نقل الخلايا في الأطباق المجهزة لكل من تحليلي MTT وFACS باستخدام فيروس يشفر GFP، بمعدل MOI قدره 0.5 لنقل ~40% من الخلايا المستهدفة. تُختبر تركيزات متنوعة من CS/PB (على سبيل المثال 50، 100، 200، 400، 600، و 800 mg/ml من كل مكون)، بالإضافة إلى 6 μg/ml من PB، لتحديد الكميات المثلى. يتم تحضير معقدات البوليمر كما هو موضح في الجزء 4 أدناه.
3. اليوم الثالث. يُزال الوسط الذي يحتوي على الفيروس ويُستبدل بوسط غذائي جديد. تُعاد الأطباق إلى حاضنة رطبة.
4. اليوم الخامس. يتم تحليل طبق FACS لتحديد كفاءة النقل مع كل تركيز من البوليمر.
5. اليوم السادس. يُزال الوسط من جميع آبار طبق MTT ويُستبدل بـ 100 μl من محلول MTT (تركيز 1 mg/ml MTT في وسط كامل). تُحضن الخلايا لمدة ثلاث ساعات في حاضنة رطبة للسماح باختزال MTT في ميتوكوندريا الخلايا النشطة أيضياً.
6. يُزال محلول MTT ويُستبدل بـ 200 ml من مذيب MTT (تركيز 0.1 N HCl، و 0.1% Igepal CA-630 في isopropanol).
7. تُحضن العينات لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو حتى يذوب كل راسب MTT formazan الأرجواني. تُقرأ الامتصاصية باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة (microplate reader) عند 570 nm، مع طرح قراءة الخلفية عند 690 nm.
8. يتم اختيار تركيز البوليمر الأمثل الذي يحقق أقصى تعزيز للنقل، وفقاً لما حدده FACS، مع أقل تأثير على النشاط الأيضي، وفقاً لما حدده MTT. بالنسبة لخلايا HDFs، اخترنا 100 μg/ml من CS/PB بناءً على البيانات الموضحة في النتائج التمثيلية أدناه.

4. ترانسدكشن إيكوتروبيك باستخدام تعقيد البوليمر

1. قم بتحضير محاليل مخزنية مرشحة ومعقمة من PB وكبريتات الكوندرويتين بتركيز 20 mg/ml في الماء. قسم المحاليل إلى أجزاء وقم بتخزينها عند -20°C.
2. انقل السائل الطافي الفيروسي باستخدام الماصة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وقم بتخفيفه للوصول إلى التركيز النهائي المطلوب (على سبيل المثال MOI بمقدار 2) باستخدام وسط زراعة جديد. أضف أحجاماً متساوية من PB وكبريتات الكوندرويتين (التركيزات المحددة في الخطوة 3 أعلاه) بالتتابع، مع هز الأنبوب لخلط المكونات بعد كل إضافة. سيصبح الخليط الفيروسي عكراً على الفور نتيجة تكون الرواسب. حضّن الخليط الفيروسي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق للسماح بتكوين المعقدات.
3. أزل الأوساط من الخلايا المستهدفة التي تعبر عن المستقبلات، واستبدلها بالخليط الفيروسي، ثم حضنها طوال الليل عند 37°C و5% CO2. بعد إزالة الخليط الفيروسي، اغسل سطح الخلايا مرتين باستخدام PBS للمساعدة في إزالة المعقدات الفيروسية. لا يشترط الإزالة الكاملة؛ حيث لم نلاحظ أي آثار سلبية على صحة الخلايا نتيجة بقايا المعقدات البوليمرية.

5. التحقق من خصوصية ترنسدكشن الفيروسات الإيكوتروبية

1. عند إنتاج الفيروس الإيكوتروبي (ecotropic virus) للمرة الأولى، يُنصح من منظور السلامة التحقق من عدم قدرة الفيروس على نقل الجينات إلى الخلايا البشرية غير المعدلة. قم بنقل الجينات إلى الخلايا البشرية باستخدام الفيروس اللنتيفيروسي الإيكوتروبي بتركيز عالٍ نسبياً (تخفيف السائل الطافي الفيروسي بنسبة 1 إلى 2 مرة فقط في وسط غذائي جديد) طوال الليل مع استخدام 6 μg/ml من PB أو تركيز محسّن من CS/PB.
2. قم بإزالة الوسط الذي يحتوي على الفيروس واستبدله بوسط غذائي جديد. بعد تحضين الخلايا لمدة يومين، تحقق من تعبير الجين المنقول عن طريق تقنية FACS باستخدام نواقل فلورية و/أو عن طريق RT-PCR باستخدام بادئات متخصصة بالجين المنقول.

6. النتائج التمثيلية:

يوضح الشكل 1A عملية إنتاج الفيروس البطيء، بينما يوضح الشكل 1B عملية نقل العدوى للخلايا البشرية باستخدام الفيروس البطيء الموجه للحيوانات (ecotropic lentivirus)، بما في ذلك النقل المسبق باستخدام مستقبل الفيروسات القهقرية الفأرية Slc7a1. ولتقدير عيار الفيروس، نستخدم خط خلايا سرطان العضلات المخطط البشري المنقول إليه Slc7a1 بشكل مستقر (Slc-hRMS). وعند استخدام نواقل تحكم فلورية لمراقبة كفاءة نقل العدوى، فإننا نحقق عادةً كفاءة نقل عدوى تزيد عن > 90% في خلايا Slc-hRMS باستخدام الفيروس الموجه للحيوانات، كما هو موضح في الشكلين 2A و2B. وتكون معدلات نقل العدوى في الخلايا الليفية الجلدية البشرية (HDFs) أقل بشكل عام لأن الخلايا لم تخضع لعملية اختيار باستخدام البلاستيسيدين للتعبير عن المستقبل (الشكل 2C). وعادةً ما تكون عيارات الفيروس البطيء الموجه للحيوانات بنسبة 10-20% من الفيروسات الكاذبة من نوع VSV عند قياسها على خلايا Slc-hRMS (الشكل 2D).

تؤدي دورة تجميد وإذابة واحدة إلى خفض عيار الفيروس المداري (ecotropic virus) بنسبة 3 - 16%، وهو ما يعادل فقدان العيار خلال دورة تجميد وإذابة واحدة للفيروس من النوع VSV-pseudotyped (p > 0.05). وعلى عكس التقارير السابقة،² لم نلحظ أي تأثير إيجابي على عيار الفيروس نتيجة التجميد السريع في الثلج الجاف. بل على العكس، حققنا عيارات أعلى بعد الإذابة لكلا النوعين من الفيروسات الكاذبة (pseudotype) بمجرد وضع أنابيب الفيروس في مجمد بدرجة حرارة -80°C (البيانات غير معروضة).

يتيح مقايسة حيوية MTT الكشف الحساس عن توقف النمو في الخلايا المستهدفة. ولا يؤثر النقل الفيروسي مع تركيزات من CS/PB تصل إلى 800 μg/ml على عملية التمثيل الغذائي في خلايا HDF (الشكل 3A). كما أن التعرض لـ CS/PB بدون الفيروس ليس له تأثير سام على الخلايا (البيانات غير معروضة). ويظهر تحليل FACS لخلايا HDF التي تم نقل الفيروس إليها مع تركيزات مختلفة من CS/PB تعزيزاً في عملية النقل مقارنة بـ PB وحده (الشكل 3B). ويحدث أقصى تعزيز عند تركيز 100 μg/ml من CS/PB (الشكل 3C)، وهو أقل بعدة أضعاف من القيم التي تم الإبلاغ عنها سابقاً.³ وبذلك، من المهم تحسين الظروف لأي نوع محدد من الخلايا المستهدفة.

يعزز التعقيد مع CS/PB العيار الملحوظ بنحو 3 أضعاف في Slc-hRMS (الشكل 4A، p < 0.01). ومن الناحية العملية، يؤدي ذلك إلى تأثير أكبر على كفاءة التنبيغ عند تركيزات الفيروس المنخفضة مقارنة بالتركيزات الأعلى (الشكل 4B)، وهو ما يرجح أن يكون ناتجاً عن الخلايا التي تعرضت لتنبيغ متعدد وتشبع المستقبلات عند تركيزات الفيروس الأعلى.

تعد عملية التنقل الفيروسي باستخدام الفيروسات ذات التصنيف "ecotropic" متخصصة للخلايا التي تعبر عن مستقبل الفيروسات الارتجاعية الفأرية. عند نقل الخلايا البشرية غير المعدلة باستخدام الفيروسات ذات التصنيف "ecotropic"، لم نلاحظ وميضاً يتجاوز الخلفية غير المنقولة، سواء عند استخدام PB أو CS/PB، كما هو موضح في الشكل 5A. مجهرياً، لا تظهر خلايا HDFs أي نقل في غياب المستقبل (الشكل 5B)، بينما يؤدي النقل المسبق للمستقبل إلى ظهور خلايا وميضية (الشكل 5C).

الشكل 1. عرض تخطيطي لـ (A) عملية إنتاج الفيروس و (B) ترصيع الخلايا البشرية بمستقبل الفيروس الارتجاعي الفأري متبوعاً بالفيروس البطيء الإيكوتروبي.

الشكل 2. نقل عالي الكفاءة للفيروسات العدسية ذات الميول البيئية التي تشفر GFP إلى خلايا بشرية. تم نقل مستقبل الفيروسات الارتجاعية الفأرية Slc7a1 إلى الخلايا مسبقاً. (A) خط خلايا ساركوما عضلية بشرية تم اختيارها بواسطة البلاستيسيدين للتعبير عن Slc7a1 (Slc-hRMS)، تم نقلها (باللون الأزرق) أو لم يتم نقلها (باللون الوردي) باستخدام GFP. (B) صورة مجهرية فلورية لخلايا Slc-hRMS المنقولة بفيروسات ذات ميول بيئية (4X). (C) خلايا ليفية جلدية بشرية (HDFs) تم نقلها (باللون الأزرق) أو لم يتم نقلها (باللون الوردي) باستخدام فيروس عدسي GFP ذو ميول بيئية؛ تم نقل Slc7a1 إلى الخلايا قبل يومين من عملية النقل ذات الميول البيئية. (D) عنوان الفيروس العدسي من النوع الكاذب VSV-G والذي يمتلك ميولاً بيئية، مقاساً على خلايا Slc-hRMS.

الشكل 3. تحسين تركيزات كوندرويتين سلفات/بولبرين (CS/PB) في الخلايا الليفية الجلدية البشرية. (A) حيوية الخلايا الليفية الجلدية البشرية (HDFs) المقاسة بواسطة مقايسة MTT بعد ترصيف الجينات في وجود PB فقط أو مع تركيزات متنوعة من CS/PB. (B) تعزيز كفاءة الترصيف في الخلايا الليفية الجلدية البشرية بواسطة تركيزات مختلفة من CS/PB، مقاسة بواسطة تقنية FACS. (C) تقدير كمي لتعزيز الترصيف، حيث يظهر أن أقصى ترصيف يحدث عند 100 μg/ml من CS/PB.

الشكل 4. تأثير 400 μg/ml من CS/PB على نقل Slc-hRMS باستخدام الفيروسات البطيئة (lentivirus) ذات التأثر المحدود (ecotropic). (أ) تعزيز العيار، و (ب) التغير في معدل النقل مقارنةً بـ 6 μg/ml من polybrene وحده.

الشكل 5. غياب التنقيل الإيكوتروبي لخلايا HDFs في حالة عدم وجود مستقبل الفيروس القهقري الفأري Slc7a1. (A) مخطط FACS للخلايا الليفية البشرية BJ، غير المنقولة (باللون الوردي) أو المنقولة (باللون الأزرق) بفيروس GFP lentivirus إيكوتروبي، وفي كلتا الحالتين في غياب المستقبل Slc7a1. الخلايا الليفية البشرية BJ المنقولة بفيروس GFP lentivirus إيكوتروبي، بدون (B) ومع (C) تنقيل مسبق للمستقبل Slc7a1 (4X).

المناقشة

ودرس المؤتلف gammaretrovirus ecotropic استنادا فيروس ابيضاض الدم الفأري مولوني (MLV) ومستقبلات mSlc7a1 لها جيدا وعلى نطاق واسع ، بعد أن استخدمت لأكثر من 20 عاما لتوصيل الجينات المحورة إلى خلايا الفئران. كما تم استخدام أكثر gammaretrovirus Ecotropic مؤخرا لتقديم المسرطنة إلى الخلايا البشرية ؛ في سياق إعادة برمجة الخلايا ، واستخدام mSlc7a1 لتجنب توليد فيروس amphotropic بايواء المسرطنة الإنسان راسخة ^4،5 ومع ذلك ، الفيروسة البطيئة يوفر مزايا هامة على gammaretrovirus transducing السكان في خلية صهر ⁽⁶⁾ ، بما في ذلك الخلايا الأولية التي غالبا ما تكون الأهداف المرغوب فيه لإعادة البرمجة ، وذلك لأن lentiviral قبل الاندماج المعقدة تسمح للخلايا تنبيغ عدم تقسيم ⁷

وقد تم إنتاج Lentiviruses مع العشرات من pseudotypes مختلفة ، بما في ذلك MLV ، في محاولة لتغيير tropism الفيروس ، والسمية ، وغيرها من الممتلكات. استخدمت ⁸ الفيروسة البطيئة ecotropic MLV - pseudotyped لتنبيغ خلايا فأر ، ⁹ ولكن نادرا ما كانت تستخدم على الخلايا البشرية ¹⁰ لذلك نحن نقترح استخدام MLV - pseudotyped الفيروسة البطيئة ecotropic كوسيلة آمنة وفعالة من حيث التكلفة وعالية الكفاءة لتقديم المسرطنة المعروفة أو المشتبه بهم ، بما في ذلك عوامل إعادة برمجة الخلايا ، والخلايا البشرية.

فمن الأهمية بمكان أن نلاحظ أن هذا البروتوكول لا تقضي تماما على الحاجة إلى إنتاج واستخدام الفيروسة البطيئة شمولي التوجه ، بل يفصل بين هذا البروتوكول الجين الورمي (ق) من الفيروس شمولي التوجه ، وعزل باحثون من امكاناتها الذاتية التلقيح مع السرطان المرتبطة الفيروسات. وأعرب بتواجد مطلق في mSlc7a1 البروتين وhSlc7a1 لها نديد الإنسان نقل الأحماض الأمينية مع عدم وجود tumorigenicity معروفة أو القدرة على منح ميزة انتقائية على نمو خلايا المتلقي ، ¹¹ mSlc7a1 صنع منخفضة المخاطر نسبيا لإدراجها في amphotropic الفيروس. هذه الخطوة قد تكون مفيدة بشكل خاص وأضاف في المختبرات تفتقر إلى مرافق مخصصة أو الفيروس زراعة الأنسجة من مستوى السلامة الحيوية المطلوبة.

في بعض الحالات قد يكون من الممكن أن تقضي تماما على استخدام فيروس شمولي التوجه من قبل وtransfecting Slc7a1 البلازميد مباشرة إلى الخلايا المستهدفة ، إلا أن العديد من الخلايا التي من شأنها أن تكون مفيدة لأهداف هذه التقنية أيضا لصهر ترنسفكأيشن. كبديل ، والقدرة على عزل الخلايا Slc7a1 - transduced عن طريق الانتقاء blasticidin الوسائل التي يمكن استخدامها VSV - G الفيروسة البطيئة pseudotyped مرة واحدة لإنشاء مخزون من خلايا مستقبلات معربا عن بعد والتي يمكن استخدامها بشكل روتيني لفيروس ecotropic تنبيغ هذه الخلايا بالنسبة لكثير التجارب. وينبغي أن تتبع دائما المبادئ التوجيهية الباحثين سلامتهم المؤسسية للعمل مع أي الفيروسة البطيئة ، بغض النظر عن tropism والخمسين.

التتر من فيروس ecotropic يتحقق مع هذا البروتوكول هي أقل نسبيا من VSV - pseudotyped الفيروس ، عادة 10-20 ٪ من عيار الفيروس شمولي التوجه ، بالاتفاق مع الدراسات السابقة. قيست ⁹ هذه التتر في الخلايا البشرية transduced ستابلي مع Slc7a1 ، وبالتالي فإن انخفاض وقد لاحظ لفيروس عيار ecotropic أن يعزى ذلك جزئيا إلى التعبير متنوعة من الجين في مستقبلات الخلايا المستهدفة. ومع ذلك ، فإن التتر الفيروسية التي تحققت في بروتوكول لدينا هي أكثر من كافية بالنسبة لمعظم التطبيقات ، وتؤدي إلى تنبيغ غالبية الخلايا ، في بعض الحالات> 90 ٪ من الخلايا.

ويشيع استخدام التقنيات المعتمدة على الطرد المركزي لتركيز الجسيمات الفيروسية. ويمكن استخدام ومع ذلك ، تتطلب عدة ساعات الطرد المركزي ، ويولد الهباء المعدية ، ويمكن أن يتسبب في خسائر كبيرة من الجزيئات الفيروسية ^(12). وكبديل ، مع complexation CS / PB لتعزيز تنبيغ دون تغيير tropism الفيروسية. ³ هذا الأسلوب السريع (5 دقائق ) وغير مكلفة (0.03 دولار للفيروس مل 10) ، في حين أن ثلاثة أمثالها تقريبا عيار ملاحظتها. وهناك حاجة إلى معدات خاصة أو الكواشف الملكية ، لاحظنا والحد الأدنى من السمية الحادة بعد التعرض للHDFs إلى CS / PB ، بالاتفاق مع الأعمال السابقة في خطوط الخلايا الأخرى. ¹³ عيب واحد المحتملة لهذا البروتوكول هو أن بعض مرئية المجهر مجمعات البوليمر التمسك الخلايا لعدة أيام في الثقافة. لا يمكننا استبعاد احتمال ان هذه المجمعات ، في حين لا علنا ​​السامة للخلايا ، قد يكون لها آثار أكثر مكرا على العمليات الخلوية.

هنا قد وصفنا منهجية لبأمان وكفاءة الخلايا البشرية transducing مع عوامل أنكجنيك. هذا النهج ينبغي أن تكون ذات فائدة كبيرة للباحثين الذين يدرسون الجينات المسرطنة وبيولوجيا الخلايا الجذعية بما في ذلك خلايا الجذع.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
pLenti6/UbC/mSlc7a1	Addgene	17224	فأري MLV مستقبلات
pMD2.G	Addgene	12259	VSV - G مغلف
pCMV - dR8.91	دال Trono مختبر 14		التغليف البلازميد (ما يعادل psPax2 البلازميد هو متاح من Addgene ، القط. رقم 12260)
pHCMV - EcoEnv	Addgene	15802	Ecotropic مغلف
FUGW	Addgene	14883	GFP السيطرة البلازميد
OptiMEM	Invitrogen	31985
Fugene HD	روش	04 709 705 001
Hexadimethrine بروميد (Polybrene)	سيغما الدريخ	H9268
شوندروتن كبريتات الصوديوم من غضروف سمك القرش	سيغما الدريخ	C4384
Blasticidin S	الصياد	BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl - tetrazolium بروميد (MTT)	سيغما الدريخ	M2128
Igepal CA - 630	سيغما الدريخ	I3021