مقالة منهجية

تنبيغ من خلايا الإنسان مع البوليمر المعقد Ecotropic الفيروسة البطيئة للسلامة الأحيائية المحسن

17.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/2822

⸱

يوليو 24, 2011

 , 
1Department of Cell Biology and Human Anatomy, School of Medicine, University of California, Davis

في هذه المقالة

ملخص

Lentiviruses هي أداة بحث قيما لاستكشاف وظائف الجينات ، إلا أن الباحثين قد ترغب في تجنب إنتاج ترميز الفيروسة البطيئة شمولي التوجه المسرطنة المعروفة أو المشتبه بهم. كبديل ، نقدم أكثر أمانا لاستخدام بروتوكول الفيروسة البطيئة ecotropic على الخلايا البشرية المعدلة للتعبير عن mSlc7a1 مستقبلات ecotropic.

الملخص

الجذعية وبيولوجيا الخلايا السرطانية دراسات غالبا ما تتطلب تنبيغ الفيروسية من الخلايا البشرية والجينات المسرطنة المعروفة أو المشتبه بهم ، ورفع القضايا الرئيسية لسلامة العاملين في المختبرات. lentiviruses شمولي التوجه ، مثل pseudotype VSV - G شيوعا ، هي أداة قيمة لدراسة وظائف الجينات لأنها يمكن أن تنبيغ أنواع الخلايا عديدة ، بما في ذلك الخلايا غير الانقسام. ومع ذلك ، قد ترغب في تجنب الباحثين الإنتاج والطرد من الفيروسات المسرطنة ترميز شمولي التوجه نتيجة لارتفاع مستوى متطلبات السلامة الأحيائية المناولة وقضايا السلامة. ومن المعروف المسرطنة قوية عدة ، بما في ذلك C - Myc وSV40 المستضد T كبيرة ، لتعزيز إنتاج يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSC). كل أخرى معروفة iPSC الذي يحفز التغيرات الجينية (OCT4 ، SOX2 ، KLF4 ، NANOG ، LIN28 ، وفقدان وظيفة البروتين p53) وأيضا وصلات إلى السرطان ، مما يجعلها ذات الاهتمام سلامة عالية نسبيا أيضا.

في حين أن هذه الفيروسات المرتبطة بالسرطان مفيدة في دراسة إعادة برمجة الخلايا وتعدد القدرات ، لا بد من استخدامها بأمان. لمعالجة هذه القضايا المتعلقة بالسلامة الأحيائية ، ونحن يبرهن على وجود طريقة لتنبيغ الخلايا البشرية ecotropic الفيروسة البطيئة ، مع التركيز على خفض تكلفة إضافية والمناولة المريحة. أنتجنا الفيروسة البطيئة ecotropic مع عيار مرتفع بما فيه الكفاية لتنبيغ أكبر من 90 ٪ من الخلايا المستقبلة للتعبير عن الإنسان يتعرض للفيروس ، والتحقق من فعالية هذا النهج.

ويتركز أغلب الأحيان بواسطة تنبيذ فائق الفيروسة البطيئة ، ولكن هذه العملية تستغرق عدة ساعات ويمكن ان تنتج الهباء المعدية للباحثين الطب الحيوي الإنسان. كما يمكن أن يكون بديلا ، والجسيمات الفيروسية بأمان أكبر الرسوبية على الخلايا complexation مع كبريتات شوندروتن وpolybrene (CS / PB). هذا الأسلوب يزيد من عيار الفيروسية وظيفية تصل إلى أضعاف 3 في خلايا الفئران ستابلي التعبير عن مستقبلات الفيروس الارتجاعي ، مع تذكر الوقت المحتسب بدل الضائع والتكاليف. ومما يعزز من الحد الأقصى تنبيغ الخلايا الليفية الجلد البشري (HDFs) باستخدام CS / PB تركيزات ما يقرب من 4 أضعاف أقل من القيمة المثلى ذكرت سابقا لخطوط الخلايا السرطانية ، مما يوحي معاير ينبغي أن تركيز البوليمر لنوع من الخلايا المستهدفة من الفائدة. وصفنا ذلك استخدام بروميد methylthiazolyldiphenyl - tetrazolium (MTT) لفحص للسمية البوليمر في نوع من الخلايا الجديدة. نلاحظ بقاء يعادل HDFs بعد تنبيغ الفيروسية باستخدام البوليمر complexation أو جرعة قياسية من polybrene (PB ، 6 ميكروغرام / مل) ، مشيرا إلى الحد الأدنى من السمية الحادة.

في هذا البروتوكول ، ونحن تصف استخدام الفيروسة البطيئة لecotropic overexpression من الجينات المسرطنة في الخلايا البشرية ، والحد من مخاطر السلامة البيولوجية وزيادة معدل تنبيغ. نظهر أيضا استخدام complexation البوليمر لتعزيز تنبيغ مع تجنب تشكيل الهباء الطرد المركزي من الجسيمات الفيروسية.

البروتوكول

1. إنتاج الفيروس البطيء (Lentivirus) وحصاده وتجميده

  1. استشر مسؤول السلامة في مؤسستك قبل البدء في هذا البروتوكول، واتبع إرشادات السلامة الموصى بها من قبله.
  2. اليوم الأول. ابدأ باستخدام خلايا 293T سليمة وسريعة النمو لإنتاج الفيروس. ازرع الخلايا بكثافة 5 × 106 خلية لكل طبق بمساحة 10 سم. استخدم وسط زراعة خلايا 293T خالٍ من المضادات الحيوية (وسط DMEM عالي الجلوكوز مع 10% من مصل جنين العجل البقري FBS و4 ميليمول من L-glutamine) لإنتاج الفيروس.
  3. اليوم الثاني. في وقت متأخر من فترة بعد الظهيرة، قم بنقل الجينات إلى خلايا 293T على النحو التالي (الأرقام المذكورة مخصصة لطبق واحد بقطر 10 سم). اترك جميع الكواشف لتصل إلى درجة حرارة الغرفة. باستخدام الماصة، 375 μl وسط OptiMEM في أنبوب طرد مركزي دقيق، ثم أضف 25 μl Fugene HD. لا تسمح لـ Fugene غير المخفف بملامسة سطح الأنبوب.
  4. في أنبوب طرد مركزي دقيق، اخلط ما يلي:
    • 5 μg بلازميد النقل (Slc7a1، أو ناقل مستهدف، أو ناقل تحكم فلوري)
    • 3.75 μg بلازميد التعبئة (pCMV-dR8.91 أو psPax2)
    • 1.25 μg بلازميد الغلاف (pMD2.G للأنواع الشاملة، pHCMV-EcoEnv للأنواع المحددة)
    • وسط OptiMEM الخالي من المصل لـ 100 μl
  5. اجمع محتويات الأنبوبين معاً، ثم حضّن الخليط لمدة تتراوح بين 20 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. قم بتغيير الوسط الغذائي لخلايا 293T إلى 10 مل من وسط 293T الطازج الخالي من المضادات الحيوية. أضف خليط Fugene/الـplasmid إلى الطبق قطرة تلو الأخرى، ثم احضنها طوال الليل عند 37°C، 5% CO22.
  7. اليوم الثالث. استبدل الوسط الغذائي لخلايا 293T بـ 10 مل من وسط 293T الطازج الخالي من المضادات الحيوية. تعامل برفق، لأن خلايا 293T تلتصق بشكل ضعيف وقد تنفصل إذا تم نقل الوسط بواسطة الماصة بقوة مفرطة فوق الطبقة الأحادية. احضن الخلايا لمدة يومين في حاضنة رطبة لإنتاج الفيروس.
  8. اليوم 5. يُحصد الفيروس ويُرشح باستخدام مرشح منخفض الارتباط بالبروتين بقطر مسام 0.45 مم. يُستخدم المحلول فوراً أو يُوزع إلى حصص أحادية الاستخدام وتُجمد عند درجة حرارة -80°Cيجب إعادة تعيين عيار الفيروسات الشاملة المدارية (pantropic) والمدارية المحدودة (ecotropic) المجمدة بعد تخزينها لمدة ستة أشهر وشهر واحد، على التوالي.
  9. قم بتعيين عيار الفيروس على النحو التالي، باستخدام خلايا قابلة للنقل الجيني نسبيًا. انقل الفيروس الضابط الفلوري إلى الخلايا طوال الليل باستخدام تخفيفات متسلسلة (على سبيل المثال: 1:10، 1:100، 1:1000) في وسط غذائي جديد يحتوي على 6 μg/ml يتم تغيير الوسط إلى وسط غذائي جديد في اليوم التالي. تُترك الخلايا لمدة يومين بعد عملية التنصيل لتبدأ في التعبير عن البروتين الفلوري، ثم يتم تحديد نسبة الخلايا التي تم تنصيلها باستخدام قياس التدفق الخلوي (FACS). يُحسب العيار بوحدات التحول (TU) لكل مل، بناءً على التخفيفات التي تعطي < نسبة ترنسدكشن (transduction) تبلغ 15% للحد من حدوث عمليات ترنسدكشن متعددة.
    صيغة حساب العيار، معادلة التكميم الفيروسي، التحليل الرياضي في علم الفيروسات.

2. نقل مستقبل الفيروس القهقري الفأري Slc7a1 إلى الخلايا البشرية المستهدفة

  1. اختر تعددية عدوى (MOI) = 2 لضمان نقل الجينات إلى معظم الخلايا. بالنسبة للخلايا المستهدفة المقاومة للنقل، مثل HDFs، ستكون هناك حاجة إلى MOI أعلى؛ حيث نقوم بتخفيف الطافي الفيروسي بنسبة 1:2 فقط لتحقيق نقل الجينات إلى غالبية الخلايا.
  2. قم بنقل الجينات إلى الخلايا المستهدفة طوال الليل باستخدام الطافي الفيروسي المخفف في وسط زراعة جديد يحتوي على 6 μg/ml من PB، مما يزيد من كفاءة النقل عن طريق تعزيز التفاعل الكهروستاتيكي بين الفيروس والخلية المستهدفة.1 ومن المثالي استخدام أقل حجم ممكن من الفيروس، مثل 1 ml لطبق بقطر 35 mm، لأن الانتشار يعد عاملاً محدداً لكفاءة نقل الجينات.
  3. قم بزراعة الخلايا لمدة 48 ساعة على الأقل بعد إزالة الفيروس قبل نقل الجينات إليها باستخدام فيروس ecotropic، وذلك لضمان التعبير الكافي عن مستقبل Slc7a1.
  4. (اختياري) يمكن استخدام blasticidin لاختيار الخلايا المنقولة جينياً بشكل مستقر والتي تعبر عن Slc7a1، إذا رغبت في ذلك. يجب إنشاء منحنى قتل بـ blasticidin مسبقاً لتحديد أدنى تركيز فعال، والذي يتراوح عموماً بين 2 – 10 μg/ml، والذي يقتل جميع الخلايا المستهدفة غير المنقولة جينياً خلال 7 أيام. وبعد حوالي يومين من إزالة فيروس Slc7a1، انقل الخلايا المنقولة جينياً إلى وسط يحتوي على blasticidin. ازرع الخلايا في الوسط المحتوي على blasticidin لمدة 7 أيام، وعند هذه النقطة ستعبر جميع الخلايا المتبقية عن مستقبل الفيروس الارتجاعي بشكل مستقر، وبذلك يمكن نقل الجينات إليها باستخدام فيروس ecotropic، كما يمكن تخزينها للاستخدام المستقبلي كخط خلوي يعبر عن Slc7a1 بشكل مستقر.

3. معايرة معقد البوليمر لتحديد السمية

  1. اليوم الأول. يتم توزيع الخلايا في طبق 96-well بمعدل 5000 cells/well، مع تخصيص ثلاث آبار مكررة على الأقل لكل مجموعة تجريبية. يتم تضمين خلايا غير محولة في وسط غذائي كامل لتوفير قيمة مرجعية للخلايا السليمة، بالإضافة إلى عينات تتكون من خلايا في وسط خالٍ من المصل لتحفيز توقف النمو كعينة ضابطة. وبالتوازي مع ذلك، يتم توزيع الخلايا في تنسيق مناسب (مثل طبق 24-well) للتحليل المجهري أو التحليل المعتمد على FACS لتقييم كفاءة التحول في كل حالة تجريبية.
  2. اليوم الثاني. يتم تحويل الخلايا في الأطباق المخصصة لكل من تحليلي MTT وFACS باستخدام فيروس يشفر لـ GFP، عند MOI قدره 0.5 لتحويل ~40% من الخلايا المستهدفة. يتم اختبار تركيزات متنوعة من CS/PB (على سبيل المثال 50، 100، 200، 400، 600، و800 mg/ml من كل مكون)، بالإضافة إلى 6 μg/ml من PB، لتحديد الكميات المثلى. يتم تحضير معقدات البوليمر كما هو موضح في الجزء 4 أدناه.
  3. اليوم الثالث. يتم إزالة الوسط الذي يحتوي على الفيروس واستبداله بوسط غذائي طازج. تُعاد الأطباق إلى حضانة رطبة.
  4. اليوم الخامس. يتم تحليل طبق FACS لتحديد كفاءة التحول مع كل تركيز من البوليمر.
  5. اليوم السادس. يتم إزالة الوسط من جميع آبار طبق MTT واستبداله بـ 100 μl من محلول MTT (تركيز 1 mg/ml MTT في وسط غذائي كامل). تُحضن الخلايا لمدة ثلاث ساعات في حضانة رطبة للسماح باختزال MTT في ميتوكوندريا الخلايا النشطة أيضياً.
  6. يتم إزالة محلول MTT واستبداله بـ 200 ml من مذيب MTT (تركيز 0.1 N HCl و0.1% Igepal CA-630 في isopropanol).
  7. تُحضن العينات لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو حتى يذوب كل راسب MTT formazan الأرجواني. تُقرأ قيمة الامتصاصية باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة عند 570 nm، مع طرح قراءة الخلفية عند 690 nm.
  8. يتم اختيار تركيز البوليمر الأمثل الذي يحقق أقصى تعزيز للتحول، وفقاً لما حدده تحليل FACS، مع أدنى تأثير على النشاط الأيضي، وفقاً لما حدده تحليل MTT. بالنسبة لخلايا HDFs، اخترنا تركيز 100 μg/ml من CS/PB بناءً على البيانات الموضحة في النتائج النموذجية أدناه.

4. التنقل الجيني الإيكوتروبي باستخدام تعقيد البوليمر

  1. قم بتحضير محاليل مركزة من PB وكبريتات الكوندرويتين (chondroitin sulfate) بتركيز 20 mg/ml في الماء، مع ترشيحها لتعقيمها. قسم المحاليل إلى حصص صغيرة واحفظها في درجة حرارة -20°C.
  2. انقل السائل الطافي الفيروسي باستخدام الماصة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق، وخففه للوصول إلى التركيز النهائي المطلوب (على سبيل المثال MOI بمقدار 2) باستخدام وسط زراعة جديد. أضف أحجاماً متساوية من PB وكبريتات الكوندرويتين (بالتراكيز المحددة في الخطوة 3 أعلاه) بالتتابع، مع هز الأنبوب بلطف للمزج بعد كل إضافة. سيصبح الخليط الفيروسي عكراً على الفور نتيجة تكون الرواسب. احضن الخليط الفيروسي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق للسماح بتكوين المعقدات.
  3. أزل الأوساط من الخلايا المستهدفة التي تعبر عن المستقبلات، واستبدلها بالخليط الفيروسي، ثم احضنها طوال الليل في درجة حرارة 37°C و 5% CO2. بعد إزالة الخليط الفيروسي، اغسل سطح الخلايا مرتين باستخدام PBS للمساعدة في إزالة المعقدات الفيروسية. ليس من الضروري الإزالة الكاملة؛ حيث لم نلاحظ أي آثار سلبية على صحة الخلايا ناتجة عن بقايا معقدات البوليمر.

5. التحقق من نوعية ترانسدكشن الفيروسات ذات المدى البيئي المحدود (ecotropic transduction)

  1. عند إنتاج الفيروس الحامل للمستقبلات البيئية (ecotropic virus) لأول مرة، من الحصافة من منظور السلامة التحقق من عدم قدرة الفيروس على نقل الجينات إلى الخلايا البشرية غير المعدلة. قم بنقل الجينات إلى الخلايا البشرية باستخدام الفيروس اللينتي (lentivirus) الحامل للمستقبلات البيئية بتركيز عالٍ نسبيًا (تخفيف لسائل الفيروس الطافي بمقدار 1 إلى 2 مرة فقط في وسط غذائي جديد) طوال الليل مع 6 μg/ml من PB أو تركيز محسّن من CS/PB.
  2. قم بإزالة الوسط الغذائي المحتوي على الفيروس واستبدله بوسط غذائي جديد. بعد تحضين الخلايا لمدة يومين، تحقق من التعبير عن الجين المنقول عن طريق تقنية FACS باستخدام نواقل فلورية و/أو عن طريق RT-PCR باستخدام بادئات متخصصة للجين المنقول.

6. النتائج التمثيلية:

يوضح الشكل 1A عملية إنتاج الفيروس البطيء (lentivirus)، بينما يوضح الشكل 1B عملية ترنسدكشن (transduction) للخلايا البشرية باستخدام فيروس بطيء إيكوتروبي (ecotropic lentivirus)، بما في ذلك الترنسدكشن المسبق باستخدام مستقبل الفيروس القهقري الفأري Slc7a1. ولتحديد عيار الفيروس (titering)، نستخدم خط خلايا سرطان العضلات المخططة البشري (human rhabdomyosarcoma) الذي تم إجراء ترنسدكشن مستقر له باستخدام Slc7a1 (Slc-hRMS). وعند استخدام ناقلات تحكم فلورية لمراقبة كفاءة الترنسدكشن، فإننا نحقق بشكل روتيني > كفاءة نقل جيني بنسبة 90% لـ Slc-hRMS باستخدام فيروس إيكوتروبي (ecotropic virus)، كما هو موضح في الشكل 2أ و2ب. وتكون معدلات النقل في الخلايا الليفية الجلدية البشرية (HDFs) أقل عمومًا لأن الخلايا لم تخضع للاختيار باستخدام البلاستيسيدين (blasticidin) للتعبير عن المستقبل (الشكل 2ج). وعادةً ما تكون عيارات الفيروسات lentivirus الإيكوتروبية بنسبة 10-20% من الفيروسات ذات النمط الظاهري الكاذب لـ VSV عند قياسها على Slc-hRMS (الشكل 2د).

تؤدي دورة تجميد وإذابة واحدة إلى خفض عيار الفيروس ذي المدى المحدود (ecotropic virus) بنسبة تتراوح بين 3% و16%، وهي نسبة تعادل فقدان العيار خلال دورة تجميد وإذابة واحدة للفيروس الكاذب النمط من فيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV-pseudotyped virus). > 0.05). وخلافاً للتقارير السابقة،2 لم نلاحظ أي تأثير إيجابي على عيار الفيروس نتيجة التجميد السريع في الثلج الجاف. بل على العكس، حققنا عيارات أعلى بعد الإذابة لكل من النمطين الكاذبين ببساطة عن طريق وضع أنابيب الفيروس في -80°C المجمّد (البيانات غير معروضة).

يسمح اختبار MTT لقياس الحيوية بالكشف الحساس عن توقف النمو في الخلايا المستهدفة. ولا يؤثر النقل الفيروسي مع تركيزات من CS/PB تصل إلى 800 μg/ml على عملية التمثيل الغذائي في خلايا HDF (الشكل 3A). كما أن التعرض لـ CS/PB بدون الفيروس ليس له تأثير سام على الخلايا (البيانات غير معروضة). ويظهر تحليل FACS لخلايا HDF التي تم نقل الفيروس إليها مع تركيزات مختلفة من CS/PB تعزيزاً لعملية النقل مقارنة بـ PB وحده (الشكل 3B). ويحدث أقصى تعزيز عند تركيز 100 μg/ml من CS/PB (الشكل 3C)، وهو أقل بعدة أضعاف من القيم المبلغ عنها سابقاً.3 وبناءً على ذلك، فمن المهم تحسين الظروف لأي نوع محدد من الخلايا المستهدفة.

يؤدي التعقيد مع CS/PB إلى تعزيز العيار الملحوظ بنحو 3 أضعاف في Slc-hRMS (الشكل 4A، p < 0.01). ومن الناحية العملية، ينتج عن ذلك تأثير أكبر على كفاءة التنبيغ عند تركيزات الفيروس المنخفضة مقارنة بالتركيزات الأعلى (الشكل 4B)، وهو ما يرجع على الأرجح إلى الخلايا التي خضعت لتنبيغ متعدد وتشبع المستقبلات عند تركيزات الفيروس الأعلى.

تعتبر عملية التنقيل باستخدام الفيروس إيكوتروبيكي (ecotropic virus) متخصصة للخلايا التي تعبر عن مستقبل الفيروس القهقري الفأري. عند تنقيل خلايا بشرية غير معدلة باستخدام الفيروس إيكوتروبيكي، لم نلاحظ وجود فلورة أعلى من الخلفية غير المنقولة، سواء عند استخدام PB أو CS/PB، كما هو موضح في الشكل 5A. وبفحصها مجهرياً، لا تظهر خلايا HDFs أي تنقيل في حالة غياب المستقبل (الشكل 5B)، بينما يؤدي التنقيل المسبق بالمستقبل إلى ظهور خلايا فلورية (الشكل 5C).

مخطط لعملية إنتاج الفيروس البطيء، يوضح مراحل ترنسدكشن خلايا 293T والمادة الطافية الفيروسية.
الشكل 1. عرض تخطيطي لـ (أ) عملية إنتاج الفيروس، و (ب) ترنسدكشن الخلايا البشرية بمستقبل الفيروس الارتجاعي الفأري يليه الفيروس البطيء الإيكوتروبي.

مخططات التدفق الخلوي، تحليل نسبة الخلايا الموجبة لـ GFP، المجهر الفلوري، مخطط شريطي لمعايرة الفيروس.
الشكل 2. نقل عالي الكفاءة لـ GFP إلى الخلايا البشرية باستخدام فيروس لينتي فيروسي إيكوتروبي (ecotropic). تم نقل مستقبل الفيروس الارتجاعي الفأري Slc7a1 إلى الخلايا مسبقاً. (A) خط خلايا ساركوما عضلية بشرية (rhabdomyosarcoma) تم اختياره بواسطة البلاستيسيدين لـ Slc7a1 (Slc-hRMS)، منقولة (باللون الأزرق) أو غير منقولة (باللون الوردي) بـ GFP. (B) صورة مجهرية فلورية لخلايا Slc-hRMS المنقولة بالفيروس الإيكوتروبي (4X). (C) خلايا HDFs منقولة (باللون الأزرق) وغير منقولة (باللون الوردي) بـ لينتي فيروس إيكوتروبي GFP؛ تم نقل Slc7a1 إلى الخلايا قبل يومين من النقل الإيكوتروبي. (D) عيار الفيروس اللينتي فيروسي الكاذب VSV-G والفيروس الإيكوتروبي، مقاساً على خلايا Slc-hRMS.

تأثيرات تركيز البوليمر على تعبير GFP؛ رسوم بيانية للامتصاصية، وقياس التدفق الخلوي، ونسبة GFP%.
الشكل 3. تحسين تركيزات كوندرويتين سلفات/بوليبرين (CS/PB) في الخلايا الليفية الجلدية البشرية. (A) حيوية خلايا HDFs المقاسة بواسطة مقايسة MTT بعد عملية التنبيغ في وجود PB فقط أو مع تركيزات متفاوتة من CS/PB. (B) تعزيز كفاءة التنبيغ في خلايا HDFs باستخدام تركيزات مختلفة من CS/PB، مقاسة بواسطة FACS. (C) قياس كمي لتعزيز التنبيغ، مما يوضح أن أقصى تنبيغ يحدث عند تركيز 100 μg/ml من CS/PB.

تحليل كفاءة نقل الجينات مقابل العيار، مخطط شريطي ومخطط تشتت، مقارنة تأثير polybrene.
الشكل 4. تأثير 400 μg/ml من CS/PB على نقل Slc-hRMS باستخدام فيروس lentivirus ecotropic. (A) تعزيز العيار، و (B) التغير في معدل النقل مقارنة بـ 6 μg/ml من polybrene وحده.

رسم بياني لشدة GFP بواسطة قياس التدفق الخلوي مع صور مجهرية فلورية توضح توزيع الخلايا +GFP.
الشكل 5. غياب التنقل الفيروسي الموجه للمستقبلات البيئية (ecotropic) في الخلايا الليفية البشرية الجلدية (HDFs) عند غياب مستقبل الفيروسات القهقرية الفأرية Slc7a1. (A) مخطط FACS للخلايا الليفية البشرية BJ، غير المنقولة (باللون الوردي) أو المنقولة (باللون الأزرق) باستخدام فيروس لينتي GFP الموجه للمستقبلات البيئية، وفي كلتا الحالتين في غياب المستقبل Slc7a1. الخلايا الليفية البشرية BJ المنقولة بفيروس لينتي GFP الموجه للمستقبلات البيئية، بدون (B) ومع (C) نقل مسبق للمستقبل Slc7a1 (4X).

المناقشة

ودرس المؤتلف gammaretrovirus ecotropic استنادا فيروس ابيضاض الدم الفأري مولوني (MLV) ومستقبلات mSlc7a1 لها جيدا وعلى نطاق واسع ، بعد أن استخدمت لأكثر من 20 عاما لتوصيل الجينات المحورة إلى خلايا الفئران. كما تم استخدام أكثر gammaretrovirus Ecotropic مؤخرا لتقديم المسرطنة إلى الخلايا البشرية ؛ في سياق إعادة برمجة الخلايا ، واستخدام mSlc7a1 لتجنب توليد فيروس amphotropic بايواء المسرطنة الإنسان راسخة 4،5 ومع ذلك ، الفيروسة البطيئة يوفر مزايا هامة على gammaretrovirus transducing السكان في خلية صهر (6) ، بما في ذلك الخلايا الأولية التي غالبا ما تكون الأهداف المرغوب فيه لإعادة البرمجة ، وذلك لأن lentiviral قبل الاندماج المعقدة تسمح للخلايا تنبيغ عدم تقسيم 7

وقد تم إنتاج Lentiviruses مع العشرات من pseudotypes مختلفة ، بما في ذلك MLV ، في محاولة لتغيير tropism الفيروس ، والسمية ، وغيرها من الممتلكات. استخدمت 8 الفيروسة البطيئة ecotropic MLV - pseudotyped لتنبيغ خلايا فأر ، 9 ولكن نادرا ما كانت تستخدم على الخلايا البشرية 10 لذلك نحن نقترح استخدام MLV - pseudotyped الفيروسة البطيئة ecotropic كوسيلة آمنة وفعالة من حيث التكلفة وعالية الكفاءة لتقديم المسرطنة المعروفة أو المشتبه بهم ، بما في ذلك عوامل إعادة برمجة الخلايا ، والخلايا البشرية.

فمن الأهمية بمكان أن نلاحظ أن هذا البروتوكول لا تقضي تماما على الحاجة إلى إنتاج واستخدام الفيروسة البطيئة شمولي التوجه ، بل يفصل بين هذا البروتوكول الجين الورمي (ق) من الفيروس شمولي التوجه ، وعزل باحثون من امكاناتها الذاتية التلقيح مع السرطان المرتبطة الفيروسات. وأعرب بتواجد مطلق في mSlc7a1 البروتين وhSlc7a1 لها نديد الإنسان نقل الأحماض الأمينية مع عدم وجود tumorigenicity معروفة أو القدرة على منح ميزة انتقائية على نمو خلايا المتلقي ، 11 mSlc7a1 صنع منخفضة المخاطر نسبيا لإدراجها في amphotropic الفيروس. هذه الخطوة قد تكون مفيدة بشكل خاص وأضاف في المختبرات تفتقر إلى مرافق مخصصة أو الفيروس زراعة الأنسجة من مستوى السلامة الحيوية المطلوبة.

في بعض الحالات قد يكون من الممكن أن تقضي تماما على استخدام فيروس شمولي التوجه من قبل وtransfecting Slc7a1 البلازميد مباشرة إلى الخلايا المستهدفة ، إلا أن العديد من الخلايا التي من شأنها أن تكون مفيدة لأهداف هذه التقنية أيضا لصهر ترنسفكأيشن. كبديل ، والقدرة على عزل الخلايا Slc7a1 - transduced عن طريق الانتقاء blasticidin الوسائل التي يمكن استخدامها VSV - G الفيروسة البطيئة pseudotyped مرة واحدة لإنشاء مخزون من خلايا مستقبلات معربا عن بعد والتي يمكن استخدامها بشكل روتيني لفيروس ecotropic تنبيغ هذه الخلايا بالنسبة لكثير التجارب. وينبغي أن تتبع دائما المبادئ التوجيهية الباحثين سلامتهم المؤسسية للعمل مع أي الفيروسة البطيئة ، بغض النظر عن tropism والخمسين.

التتر من فيروس ecotropic يتحقق مع هذا البروتوكول هي أقل نسبيا من VSV - pseudotyped الفيروس ، عادة 10-20 ٪ من عيار الفيروس شمولي التوجه ، بالاتفاق مع الدراسات السابقة. قيست 9 هذه التتر في الخلايا البشرية transduced ستابلي مع Slc7a1 ، وبالتالي فإن انخفاض وقد لاحظ لفيروس عيار ecotropic أن يعزى ذلك جزئيا إلى التعبير متنوعة من الجين في مستقبلات الخلايا المستهدفة. ومع ذلك ، فإن التتر الفيروسية التي تحققت في بروتوكول لدينا هي أكثر من كافية بالنسبة لمعظم التطبيقات ، وتؤدي إلى تنبيغ غالبية الخلايا ، في بعض الحالات> 90 ٪ من الخلايا.

ويشيع استخدام التقنيات المعتمدة على الطرد المركزي لتركيز الجسيمات الفيروسية. ويمكن استخدام ومع ذلك ، تتطلب عدة ساعات الطرد المركزي ، ويولد الهباء المعدية ، ويمكن أن يتسبب في خسائر كبيرة من الجزيئات الفيروسية (12). وكبديل ، مع complexation CS / PB لتعزيز تنبيغ دون تغيير tropism الفيروسية. 3 هذا الأسلوب السريع (5 دقائق ) وغير مكلفة (0.03 دولار للفيروس مل 10) ، في حين أن ثلاثة أمثالها تقريبا عيار ملاحظتها. وهناك حاجة إلى معدات خاصة أو الكواشف الملكية ، لاحظنا والحد الأدنى من السمية الحادة بعد التعرض للHDFs إلى CS / PB ، بالاتفاق مع الأعمال السابقة في خطوط الخلايا الأخرى. 13 عيب واحد المحتملة لهذا البروتوكول هو أن بعض مرئية المجهر مجمعات البوليمر التمسك الخلايا لعدة أيام في الثقافة. لا يمكننا استبعاد احتمال ان هذه المجمعات ، في حين لا علنا ​​السامة للخلايا ، قد يكون لها آثار أكثر مكرا على العمليات الخلوية.

هنا قد وصفنا منهجية لبأمان وكفاءة الخلايا البشرية transducing مع عوامل أنكجنيك. هذا النهج ينبغي أن تكون ذات فائدة كبيرة للباحثين الذين يدرسون الجينات المسرطنة وبيولوجيا الخلايا الجذعية بما في ذلك خلايا الجذع.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وقدم التمويل لهذا المشروع من قبل معهد كاليفورنيا للطب التجديدي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة فهرس العدد تعليقات
pLenti6/UbC/mSlc7a1 Addgene 17224 فأري MLV مستقبلات
pMD2.G Addgene 12259 VSV - G مغلف
pCMV - dR8.91 دال Trono مختبر 14 التغليف البلازميد (ما يعادل psPax2 البلازميد هو متاح من Addgene ، القط. رقم 12260)
pHCMV - EcoEnv Addgene 15802 Ecotropic مغلف
FUGW Addgene 14883 GFP السيطرة البلازميد
OptiMEM Invitrogen 31985
Fugene HD روش 04 709 705 001
Hexadimethrine بروميد (Polybrene) سيغما الدريخ H9268
شوندروتن كبريتات الصوديوم من غضروف سمك القرش سيغما الدريخ C4384
Blasticidin S الصياد BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl - tetrazolium بروميد (MTT) سيغما الدريخ M2128
Igepal CA - 630 سيغما الدريخ I3021

المراجع

  1. Davis, H. E., Rosinski, M., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Charged polymers modulate retrovirus transduction via membrane charge neutralization and virus aggregation. Biophys J. 86, 1234-1242 (2004).
  2. Marino, M. P., Luce, M. J., Reiser, J. Small- to large-scale production of lentivirus vectors. Methods Mol Biol. 229, 43-55 (2003).
  3. Landazuri, N., LeDoux, J. M. Complexation of retroviruses with charged polymers enhances gene transfer by increasing the rate that viruses are delivered to cells. J Gene Med. 6, 1304-1319 (2004).
  4. Ohnuki, M., Takahashi, K., Yamanaka, S. Generation and characterization of human induced pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 4, 4A.2-4A.2 (2009).
  5. Hotta, A. EOS lentiviral vector selection system for human induced pluripotent stem cells. Nat Protoc. 4, 1828-1844 (2009).
  6. Reiser, J. Transduction of nondividing cells using pseudotyped defective high-titer HIV type 1 particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 15266-15271 (1996).
  7. Cullen, B. R. Journey to the center of the cell. Cell. 105, 697-700 (2001).
  8. Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Curr Gene Ther. 5, 387-398 (2005).
  9. Schambach, A. Lentiviral vectors pseudotyped with murine ecotropic envelope: increased biosafety and convenience in preclinical research. Exp Hematol. 34, 588-592 (2006).
  10. Koch, P., Siemen, H., Biegler, A., Itskovitz-Eldor, J., Brustle, O. Transduction of human embryonic stem cells by ecotropic retroviral vectors. Nucleic Acids Res. 34, e120-e120 (2006).
  11. Yoshimoto, T., Yoshimoto, E., Meruelo, D. Molecular cloning and characterization of a novel human gene homologous to the murine ecotropic retroviral receptor. Virology. 185, 10-17 (1991).
  12. Cepko, C. Large-scale preparation and concentration of retrovirus stocks. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.12-Unit 9.12 (2001).
  13. Doux, J. M. L. e, Landazuri, N., Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Complexation of retrovirus with cationic and anionic polymers increases the efficiency of gene transfer. Hum Gene Ther. 12, 1611-1621 (2001).
  14. Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J Virol. 72, 9873-9880 (1998).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

MTT FACS
تنبيغ من خلايا الإنسان مع البوليمر المعقد Ecotropic الفيروسة البطيئة للسلامة الأحيائية المحسن
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.