أدوات التحرير الأساسية بوساطة كريسبر: تقنية تحرير الجينوم للحث على استبدال القاعدة المستهدفة

الملخص

المصدر: انظر، J. E.، وآخرون. التقييم الوظيفي لمتغيرات BRCA1 باستخدام المحررين الأساسيين بوساطة كريسبر. J. Vis. Exp. (2021).

يشرح هذا الفيديو مفهوم محرري قاعدة السيتوزين بوساطة كريسبر للحث على استبدال النيوكليوتيدات المستهدفة.

البروتوكول

1. إنشاء متغيرات BRCA1 باستخدام أدوات التحرير الأساسية بوساطة CRISPR

ملاحظة: إذا لم يتم استخدام خطوط خلايا HAP1-BE3، فيمكن نقل الحمض النووي البلازميد المشفر BE3 مع الحمض النووي الريبي المرسال الذي يستهدف BRCA1. بالمقارنة مع التعدين المشترك لبلازميدات BE3 و gRNA ، فإن تعداء بلازميد gRNA إلى خلايا HAP-BE3 يحفز تحريرا أساسيا فعالا يصل إلى 3 أضعاف في الموضع المستهدف في أيدينا.

1. البذور 5 × 10⁵ خلايا HAP1-BE3 (أو خلايا HAP1 في حالة طرق التعداء المشتركة) لكل بئر في ألواح 24 بئرا قبل يوم واحد من التعدين. في وقت التعدي ، خلايا الثقافة للوصول إلى كثافة مناسبة (70٪ -80٪ التقاء).
2. استهداف الحمض النووي الريبي المرض BRCA1 الشفاف باستخدام كواشف التعداء المشتراة (جدول المواد) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. استخدم 1 ميكروغرام من gRNAs التي تستهدف BRCA1 (مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد المشفر BE3 في حالة طرق التعدي المشترك) للحث على تحويل C: G إلى T: A في المواقع المستهدفة BRCA1. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية والزراعة الفرعية كل 3-4 أيام.
3. حصاد كريات الخلية بعد 3 و 10 و 24 يوما من التعداء لتحليل كفاءات التحرير الأساسي (يتم تحليل العينات من 3 أيام بعد التعداء لإعادة التصنيف كعينات اليوم 0).
4. استخرج الحمض النووي الجيني باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الجيني (جدول المواد).
   ملاحظة: نوصي بتحسين ظروف التعدي مع نسبة متغيرة من الكاشف إلى الحمض النووي. الحالة المثلى لتعداء HAP1 هي حصة 4: 1 من الكاشف إلى الحمض النووي في أيدينا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ليبوفيكتامين 2000 ثيرمو فيشر العلمي 11668027 كاشف التعداء أوبتي-ميم جيبكو 31985070 مواد التعداء كاشف التعداء FuGENE HD بروميجا E2311 كاشف التعداء وسيط Dulbecco المعدل من Iscove جيبكو 12440046 وسيط لخلايا HAP1 lentiCas9-Blast أدجين 52962 البلازميدات الحمض النووي لاستنساخ lentiBE3 مجموعة DNeasy للدم والأنسجة كياجين 69504 مجموعة إعداد الحمض النووي الجيني