PCR للنسخ العكسي الكمي في الوقت الحقيقي لتشخيص الالتهابات الفيروسية

الملخص

المصدر: Marston ، D. A. et al. Pan-lyssavirus في الوقت الحقيقي RT-PCR لتشخيص داء. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو طريقة كمية للكشف عن العدوى الفيروسية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي في الوقت الفعلي. تقوم خطوة النسخ العكسي بتحويل الحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي (cDNA) ، والذي يتم تضخيمه بعد ذلك عبر دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يتم تأكيد وجود الحمض النووي الريبي الفيروسي في العينة من خلال تحليل منحنيات التضخيم والتفكك للحمض النووي التي تم الحصول عليها من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

البروتوكول

فئة

1. القياس الكمي للحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي ذو الحجم الصغير

1. تأكد من ضبط إعدادات مقياس الطيف الضوئي على الحمض النووي الريبي.
2. استخدم 1-2 ميكرولتر من الماء الجزيئي لتهيئة الماكينة وتعيين خط الأساس.
3. استخدم 1-2 ميكرولتر من كل عينة اختبار من الحمض النووي الريبي لتقييم كمية الحمض النووي الريبي.
4. احفظ القراءات والمستند.
5. اضبط الحمض النووي الريبي على 1 ميكروغرام / ميكرولتر ، إذا لزم الأمر.
   ملاحظه: يجب الاحتفاظ بالحمض النووي الريبي على الجليد (أو في كتلة باردة) في جميع الأوقات. إذا تم الحصول على الحمض النووي الريبي باستخدام عمود أو طريقة قائمة على الخرزة ، فعادة ما يكون الحمض النووي الريبي أقل من 1 ميكروغرام / ميكرولتر. في هذه الحالة ، استخدم الحمض النووي الريبي أنيقا.

2. تحضير سلسلة تخفيف الحمض النووي الريبي لتحديد حساسية نقطة النهاية

1. قم بعمل تخفيف تسلسلي 10 أضعاف للحمض النووي الريبي.
   قم
   1. بتسمية الأنابيب بسلسلة التخفيف (على سبيل المثال ، ^10-1 ، ^10-2 ، إلخ) وتفاصيل الحمض النووي الريبي.
   2. أضف 45 ميكرولتر من الماء الجزيئي إلى كل أنبوب.
   3. أضف 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي (المخفف مسبقا إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر) واخلط جيدا.
   4. تخلص من طرف الماصة في المطهر المناسب واستبدله بطرف جديد.
   5. خذ 5 ميكرولتر من ^10-1 وأضفه إلى أنبوب ^10-2 واخلطه جيدا.
   6. كرر 2.1.3-2.1.5 مع التخفيفات المتبقية.
      ملاحظة: يجب حفظ الحمض النووي الريبي على الجليد (أو في كتلة باردة) في جميع الأوقات.

فئة

3. تحضير تفاعلات RT-PCR في الوقت الحقيقي

1. باستخدام جدول بيانات ، قم بتخطيط تخطيط اللوحة وفقا لعدد عينات الاختبار وعينات التحكم ، لكل من فحوصات lyssavirus و ß-actin.
   ملاحظه: إذا تم اختبار 4 عينات في نسختين مع التحكم الإيجابي والسلبي ، فهذا يعادل 10 تفاعلات لكلا المقياسين.
2. في "غرفة نظيفة" أو منطقة منفصلة عن قالب الحمض النووي الريبي ، امسح الأسطح بمطهر مناسب قبل الاستخدام أو قم بإعداد محطة عمل PCR (في حالة الاستخدام). لتحضير محطة العمل ، امسح سطح الخزانة بمطهر مناسب وضع العناصر المطلوبة في محطة العمل وأغلق الأبواب. قم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق.
3. قم بإزالة الحكام والبادئات من الفريزر وقم بإذابة الثلج (الكواشف المدرجة في الجدول 1 والبادئات في الجدول 2).
   ملاحظة: يتم تخزين مزيج الإنزيم في الجلسرين لذلك لا يتطلب الذوبان ويجب حفظه على الجليد (أو في كتلة باردة) في جميع الأوقات. يمكن إذابة جميع الكواشف الأخرى في درجة حرارة الغرفة.
4. بمجرد إذابته ، اخلطي الكواشف وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع السائل.
   ملاحظة: لا تقم بتدوير مزيج الإنزيم ، فقط جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة.
5. قم بإعداد خلطات رئيسية منفصلة ل lyssavirus و ß-actin. لكل تفاعل ، أضف 7.55 ميكرولتر من الماء الجزيئي ، و 10 ميكرولتر من مزيج التفاعل الأخضر 2x Universal SYBR ، و 0.6 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي ، و 0.6 ميكرولتر من التمهيدي العكسي ، و 0.25 ميكرولتر من مزيج إنزيم iTaq RT.
   1. استخدم جدول بيانات لحساب وحدات التخزين الصحيحة لتجنب الأخطاء في الحساب اليدوي. تأكد من إعداد ما يكفي من المزيج الرئيسي للتعويض عن أخطاء سحب العينات. لذلك إذا كانت هناك حاجة إلى 10 تفاعلات (انظر الملاحظة في 3.1) ، فقم بإعداد 12 تفاعلا
   2. قم بإعداد المزيج الرئيسي على الثلج (أو في كتلة باردة) وابق على الثلج حتى يتم وضعه في الجهاز في الوقت الفعلي.
6. امزج الخلطات الرئيسية المحضرة ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة ، وقم بتوزيع 19 ميكرولتر في الآبار ذات الصلة من الأنابيب الشريطية أو صفيحة 96 بئرا متوافقة مع الماكينة المستخدمة في الوقت الفعلي.
   ملاحظة: قلل من إنتاج الفقاعات في الآبار أثناء سحب العينات.
7. في غرفة منفصلة ، أو في خزانة للأشعة فوق البنفسجية معدة كما هو موضح في 3.2 ، أضف بعناية 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المعدل مسبقا إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر (انظر الخطوة 1.5) تحت سطح الخلط الرئيسي المناسب جيدا واخلطه برفق. تخلص من طرف الماصة في مطهر مباشرة بعد الاستخدام (تحت السطح).
   1. أضف عناصر التحكم بعد عينات الاختبار ، مع إضافة عنصر التحكم الإيجابي بعد ذلك وإضافة عنصر التحكم بدون قالب (NTC - ماء من الدرجة الجزيئية) أخيرا. يمكن تغيير كمية الحمض النووي الريبي المستخدمة اعتمادا على نوع العينة واستخراج الحمض النووي الريبي المستخدم. يجب التحقق من صحة الكمية المستخدمة لضمان تحسين التفاعل.
8. قم بتعبئة لوحة الختم باستخدام أغطية الشريط أو السدادة مع الحرص على التأكد من إغلاق جميع الأغطية بإحكام ووضع علامات عليها بشكل كاف لتوجيه العينات. قم بتسمية حافة أنابيب اللوحة / الشريط.
قم
9. بتدوير العينات باستخدام جهاز طرد مركزي لجمع كل السائل في قاع الآبار.
10. انقل اللوحة إلى جهاز PCR في الوقت الفعلي ، وافتح الباب ، وضعه في الحامل لضمان الموقع / الاتجاه الصحيح للعينات وفقا لتخطيط اللوحة.
    ملاحظة: إذا تم استخدام شرائط أنبوبية ، فتأكد من أن الحامل في مكانه.
11. افتح برنامج جهاز PCR في الوقت الفعلي واختر خيار تجربة SYBR في الوقت الفعلي مع منحنى التفكك. قم ببرمجة جهاز PCR في الوقت الفعلي باستخدام ظروف التدوير الحراري المحددة في الجدول 3 ، بما في ذلك نقاط جمع البيانات.
12. حدد SYBR كصبغة الفلورسنت وحدد غير معروف كنوع العينة وأدخل اسما في مربع اسم العينة الصحيح.
    ملاحظه: التفريق بين التكرارات وأيضا بين فيروس lyssavirus و ß-actin آبار.
13. اختر موقع ملف لحفظ البيانات التجريبية ، وتأكد من إيقاف تشغيل المصباح في نهاية التشغيل ، ثم ابدأ التشغيل.
    ملاحظة: نظرا لأن الخطوة الأولى هي مرحلة RT ، فلا يتم جمع أي بيانات خلال هذا الوقت ، وبالتالي ، إذا كان المصباح يتطلب فترة إحماء ، فقد يحدث ذلك أثناء مرحلة RT. ستعرض الآلة والبرنامج في الوقت الفعلي منحنيات التضخيم في الوقت الفعلي ، بينما سيتم إنشاء منحنى الانصهار في نهاية الدورة.

النتائج

الجدول 1: كواشف المزيج الرئيسي ل Pan-lyssavirus في الوقت الفعلي RT-PCR.

الكاشف ميكرولتر / رد فعل مياه من الدرجة الجزيئية 7.55 دولار 2x مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل العالمي RT 10 التمهيدي إلى الأمام [20 ميكرومتر] 0.6 <...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أطراف ماصة حاجز الفن (أحجام مختلفة) ثيرموفيشر مختلف الطرد المركزي بيكمان أليجرا 21 آر الدوار قادر على حمل 96 لوحة بئر مطلوبة. الخطوة 3.8. أجهزة الطرد المركزي (الصغيرة) سيغما Finnpipettes (لتوزيع 0.5-1000 ميكرولتر) ثيرموفيشر مختلف مجموعة آي تاك يونيفرسال SYBR RT-PCR أخضر بخطوة واحدة بيو راد 172-5150 يمكن استخدام مجموعات مكافئة إذا تم التحقق من صحتها MX3000P أو MX3005P نظام PCR في الوقت الحقيقي ستراتاجين غير متاح يمكن استخدام الآلات المكافئة إذا تم التحقق من صحتها قاعدة لوحة تفاعل MicroAmp أي مناسبة تستخدم لعقد شريط الأنبوب والألواح بشكل آمن. شرائط شفافة مسطحة شفافة بصريا (8) أجين AB-0866 إطار مناسب تماما (في حالة استخدام شرائط الأنبوب) ستراتاجين غير متاح خاص بالماكينة الاشعال: للحصول على تفاصيل التمهيدي انظر الجدول 2. تم طلبها بمقياس 0.05 ميكرومول HPLC المنقى. أطباق حرارية سريعة سعة 96 بئر ، غير محاطة أجين AB-600 شرائط حرارية سريعة (8) أنابيب حرارية أجين AB-0452 آلة دوامة / دوامة معدات Fisons العلمية SGP-202-010J ما لم ينص على ذلك ، يمكن استخدام معدات بديلة