مقالة منهجية

تقنية في المختبر للتمييز بين الخلايا التائية المساعدة التي تنتج GM-CSF عن الخلايا التائية الساذجة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Lu ، Y. ، et al. التمايز في المختبر لخلايا T Domeper (GM-CSF) المنتجة لخلايا T Helper (THGM).J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو التمايز في المختبر لعامل تحفيز مستعمرة الخلايا الحبيبية والبلاعم أو الخلايا التائية المساعدة المنتجة للخلايا المعدلة وراثيا السائل الدماغي النخاعي (THGM). يتم تحفيز الخلايا التائية الساذجة المعزولة للتمايز إلىTH GM، وهو ما يتم تأكيده من خلال الكشف عن إنتاج GM-CSF العالي داخل الخلايا والتعبير المنخفض عن السيتوكينات الأخرى الخاصة بالخلايا التائية المساعدة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. إعداد الكاشف والمواد

  1. تحضير 500 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA).
    ملاحظه: احتفظ بالمخزن المؤقت على الجليد طوال الإجراء بأكمله للحصول على أفضل النتائج.
  2. قم بإعداد 50 مل من وسائط RPMI الكاملة التي تحتوي على RPMI 1640 و 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. استخدم وسائط RPMI كاملة تحتوي على 50 ميكرومتر β-mercaptoethanol لتمايز خلايا TH GM. أضف β ميركابتو إيثانول إلى غطاء الدخان.
  3. تحضير 7.5 مل من خليط الأجسام المضادة ل CD3e عن طريق تخفيف المخزون المركز المضاد ل CD3e إلى 3 ميكروغرام / مل في PBS. قم بتغطية 48 بئرا بإضافة 150 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة إلى كل بئر واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل ، أو عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  4. عقم زوجا من المقصات والملقط واحتفظ بها في 70٪ من الإيثانول بين التشريح.
فئة

2. تحضير خلايا الطحال الفئران

  1. القتل الرحيم للفأر (6-8 أسابيع) باستخدام اختناق ثاني أكسيد الكربون2 المعتمد مؤسسيا أو خلع عنق الرحم. رش الماوس بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بتثبيته على كتلة البوليسترين على ظهره. انقل الماوس إلى خزانة السلامة البيولوجية لمتابعة الخطوات التالية.
  2. امسك الجلد باستخدام زوج من الملقط واقطع الجلد أسفل القفص الصدري على الجانب الأيسر لحوالي 4 سم باستخدام مقص. افتح الكيس البريتوني لكشف الطحال واستخدم ملقطا معقما لاستخراج الطحال.
  3. ضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر على أنبوب سعة 50 مل وقم ببللها مسبقا ب 2 مل من المخزن المؤقت. ضع الطحال على مصفاة الخلية (2-3 طحال لمصفاة خلية واحدة) ونقعها باستخدام نهاية مكبس حقنة سعة 5 مل.
  4. اشطف المصفاة والأنبوب عدة مرات باستخدام 1-2 مل من عازلة عزل الخلايا حتى يتم مسح جميع الخلايا في الأنبوب. تخلص من مصفاة الخلية وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. أعد تعليق حبيبات الخلية ب 5 مل من محلول التحلل البارد (4 درجات مئوية) الأمونيوم وكلوريد البوتاسيوم (ACK) (150 ملي مولار NH4Cl ، 10 ملي مولار KHCO3 ، 0.1 ملي مولار Na2EDTA ؛ درجة الحموضة 7.2-7.4) واخلطها برفق لمدة دقيقتين. أضف 10 مل من وسائط RPMI الكاملة لتحييد المخزن المؤقت ACK وقم بالطرد المركزي للخلايا على الفور عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
فئة

3. عزل الخلايا التائية CD4 + باستخدام ميكروبيدات CD4 المغناطيسية وعمود فصل الخلايا

  1. أعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من المخزن المؤقت لعزل الخلية. قم بتصفية تعليق الخلية باستخدام مرشح الفصل المسبق (30 ميكرومتر) في أنبوب جديد سعة 15 مل لإزالة أي حطام.
  2. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وقم بعمل تخفيف 10x عن طريق إضافة 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت. خذ 10 ميكرولتر من معلق الخلية المخفف واخلطه مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق لعد الخلايا. عد الخلايا في مقياس كثافة الدم لتحديد محصول الخلايا القابلة للحياة.
    3. قم
  3. بالطرد المركزي للخلايا عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
  4. أعد تعليق الخلايا في 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل 107 خلايا. أضف 10 ميكرولتر من ميكروبيدات CD4 المغناطيسية لكل 107 خلايا. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. للحصول على أفضل النتائج ، امزج معلق الخلية برفق كل 5 دقائق أثناء الحضانة.
  5. أثناء احتضان الخلايا ، ضع عمود فصل على الحامل المغناطيسي. بلل العمود مسبقا ب 2 مل من المخزن المؤقت.
  6. في نهاية حضانة الخلية / الخرزة ، اغسل الخلايا ب 5 مل من المخزن المؤقت وقم بطردها عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت ، وقم بتحميل العينة في عمود فصل الخلية ، واتركها تتدفق من خلالها. استخدم أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل لتجميع جزء خلية CD4. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لغسل الخزان قبل أن يجف. كرر خطوة الغسيل 2x.
  8. قم بإزالة عمود فصل الخلية من الحامل المغناطيسي وضعه على أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل. أضف 2 مل من المخزن المؤقت لعزل الخلايا إلى عمود فصل الخلية وقم بتطبيق المكبس بإحكام لإجبار الخلايا على الخروج من العمود.
  9. الطرد المركزي الكسر عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية للحصول على خلايا CD4 +. تخلص من المادة الطافية.
< p class = "jove_title" >4. تنقية الخلايا التائية CD4 + الساذجة (CD4 + CD25-CD44loCD62Lhi) عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة وتمايز THGM

  1. أعد تعليق حبيبات خلية CD4 + التي تم الحصول عليها في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت. امزج الخلايا بخليط من الأجسام المضادة المترافقة بالفلورسنت يحتوي على CD4-PerCp (2.8 ميكروغرام / مل) و CD44-APC (2.4 ميكروغرام / مل) و CD25-PE (2 ميكروغرام / مل) و CD62L-FITC (10 ميكروغرام / مل) (الجدول 1). احتضان الخلايا على الجليد لمدة 20-30 دقيقة ، مع حمايتها من الضوء.
    ملاحظه: تم تحسين تركيزات الأجسام المضادة سابقا في المختبر. عدد الأجسام المضادة المدرجة للخلايا من 1-2 فئران.
  2. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا ب 5 مل من العازلة وقم بطرد الخلايا عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  3. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت. قم بتصفية الخلايا مرة أخرى باستخدام شبكة من النايلون.
  4. انقل معلق الخلية إلى أنبوب FACS لفرز الخلايا. قم بتغطية أنابيب FACS للمجموعة مسبقا بسعة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت.
  5. احصل على CD4 + CD25-CD44loCD62Lhi السكان (من خلايا CD4 + T الساذجة) عن طريق فرز FACS. بوابة على CD4 + CD25- أولا ، ثم حدد خلايا CD44loCD62Lمرحبا من هذه المجموعة.
  6. اجمع كسور الخلايا التائية CD4 + الساذجة في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
  7. أعد تعليق خلايا CD4 + T الساذجة بتركيز 106 خلية / مل في وسائط RPMI كاملة تحتوي على 50 ميكرومتر β-ميركابتو إيثانول.
  8. استنشق الأجسام المضادة ل CD3e المستخدمة في الطلاء المسبق في اللوحة المكونة من 48 بئرا. بذرة 0.25 مليون (250 ميكرولتر) خلية في كل بئر مع IL-7 (2 نانوغرام / مل) ، ومضاد CD28 (1 ميكروغرام / مل) ، ومضاد IFNγ (10 ميكروغرام / مل) (الجدول 1).
    ملاحظه: تم تحسين تركيزات السيتوكين والأجسام المضادة سابقا في المختبر لتمايز خلاياTH GM.
  9. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 3 أيام. لا تغير الوسيط أثناء الحضانة.

5. تحليل خلايا THGM للفأر التي تم إنشاؤها في المختبر

  1. باستخدام المجهر ، تحقق من تمايز الخلية 3 د بعد التمايز. احصد الخلايا وقم بطردها عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. اغسل الخلايا 2x بوسائط RPMI كاملة.
    ملاحظه: الخلايا المتمايزة أكبر حجما من خلايا CD4 + T الساذجة.
  2. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسائط RPMI الكاملة. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية واخلطه جيدا مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق لتحديد رقم الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم. قسم الخلايا المتمايزة إلى ثلاث جرعات لإعادة التحفيز والتحليل.
    ملاحظه: يتطلب تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا ≥0.5 مليون خلية.
  3. لتلوين السيتوكين داخل الخلايا ، أعد تحفيز الخلايا باستخدام فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (PMA) (100 نانوغرام / مل) والأيونوميسين (1 ميكروغرام / مل) في وجود مثبط نقل البروتين (1 ميكرولتر / مل) لمدة 4-6 ساعات.
    1. احصد الخلايا وصخها بجسم مضاد مضاد ل CD4 (مقترن PerCP ، 0.2 مجم / مل ، تخفيف 1: 100 ؛ أو مترافق مع FITC ، 0.5 مجم / مل ، تخفيف 1: 100) لمدة 30 دقيقة.
    2. قم بإصلاح الخلايا ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثبيت لمدة 20-60 دقيقة. بعد التثبيت ، اغسل الخلايا 2x مع 1 مل من المخزن المؤقت للنفاذية.
    3. إجراء تلطيخ داخل الخلايا بالأجسام المضادة ضد GM-CSF (مترافق PE ، 0.2 مجم / مل ، تخفيف 1: 100) ، IL-17A (مترافق FITC ، 0.5 مجم / مل ، تخفيف 1: 100 ؛ APC مترافق ، 0.2 مجم / مل ، 1: 100 تخفيف) ، IL-4 (مترافق مع APC ، 0.2 مجم / مل ، 1: 100 تخفيف) ، و IFNγ (مترافق APC ، 0.2 مجم / مل ، 1: 100 تخفيف. PE مترافق ، 0.2 مجم / مل ، تخفيف 1: 100) لمدة 30 دقيقة في الظلام.
< p class = "jove_content" > الجدول 1: السيتوكينات والأجسام المضادة المستخدمة.

اسم تركيز المخزون تركيز العمل التخفيف الحجم في مخزن مؤقت تلطيخ 500 ميكرولتر CD4-PerCp 0.2 ملغم/مل 2.8 ميكروغرام / مل 1:71 7 ميكرولتر CD44-APC 0.2 ملغم/مل 2.4 ميكروغرام / مل 1:83 6 ميكرولتر CD25-PE 0.2 ملغم/مل 2 ميكروغرام / مل 1:100 5 ميكرولتر CD62L-FITC 0.5 مجم / مل 10 ميكروغرام / مل 1:50 10 ميكرولتر جنرال موتورز - CSF - PE 0.2 ملغم/مل 2 ميكروغرام / مل 1:100 IL-17A-FITC 0.5 مجم / مل 5 ميكروغرام / مل 1:100 IL-17A-APC 0.2 ملغم/مل 2 ميكروغرام / مل 1:100 IFNγ-APC 0.2 ملغم/مل 2 ميكروغرام / مل 1:100 IFNγ-PE 0.2 ملغم/مل 2 ميكروغرام / مل 1:100 IL-4-APC 0.2 ملغم/مل 2 ميكروغرام / مل 1:100 CD4-FITC 0.5 مجم / مل 5 ميكروغرام / مل 1:100 IL-7 20 ميكروغرام / مل 2 نانوغرام / مل 1: 10000 مضاد ل CD28 0.5 مجم / مل 1 ميكروغرام / مل 1:500 مكافحة IFNγ 1 ملغ/مل 10 ميكروغرام / مل 1:100

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات RPMI 1640 الغرب الحيوي L0500-500 FBS معطل بالحرارة الجدي FBS-مرحبا -12 أ البنسلين - ستربتومايسين جيبكو 15140122 10x PBS 1 قاعدة BUF-2040-10 مخفف إلى 1x PBS في ماء معقم EDTA 1 قاعدة BUF-1053-100ml-pH8.0 10X ACK المخزن المؤقت بيوليجند 420301 مخفف في ماء معقم مصفاة الخلية SPL علوم الحياة 93070 ميكروبيدات CD4 ميلتيني بيوتيك 130-049-201 2-ميركابتو إيثانول سيغما M7522 عمود LS ميلتيني بيوتيك 130-042-401 حامل مغناطيسي ميلتيني بيوتيك 130-042-303 حقنة 1 مل تيرومو SS + 01T الطرد المركزي إيبندورف إيبندورف 5810R سوني SY3200 فارز الخلايا سوني سوني SY3200 فارز الخلايا أنبوب الطرد المركزي المخروطي 50 مل غرينر بيو ون 210261 أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل 15 م غرينر بيو ون 188271 أنبوب FACS كورنينج 352054 مضاد للفأر CD4 PerCP-eFluor 710 العلوم البيولوجية الإلكترونية 46-0041-82 CD25 مضاد للفأر مترافق ب PE (IL-2Ra ، ص 55) العلوم البيولوجية الإلكترونية 12-0251-82 مكافحة الإنسان / الماوس CD44 APC العلوم البيولوجية الإلكترونية 17-0441-82 مضاد للفأر CD62L FITC العلوم البيولوجية الإلكترونية 11-0621-85 غرفة عد محسنة من نيوباور مارينفيلد 640010 محلول هيكلون تريبان الأزرق جنرال إلكتريك للرعاية الصحية علوم الحياة SV30084.01 مجهر نيكون نيكون إليبس TS100 الجسم المضاد CD3e المنقى المضاد للفأر بيوليجند 100314 الهامستر المنقى المضاد للفأر CD28 BD Biosciences 553295 تنقية الفئران المضادة للفأر IFNγ العلوم البيولوجية الإلكترونية 16-7312-85 الأجسام المضادة IL-4 المنقاة المضادة للفأر بيوليجند 504102 بروتين IL-7 المؤتلف للفأر نظام البحث والتطوير 407 مل سلطة النقد الفلسطينية ميرك ميليبور 19-144 الأيونومايسين سيغما أ 0634 مثبط نقل البروتين GolgiPlug BD Biosciences 51-2301 كيلو هرتز مجموعة المخزن المؤقت للتثبيت والنفاذية داخل الخلايا العلوم البيولوجية الإلكترونية 88-8824-00 مضاد للفأر GM-CSF PE العلوم البيولوجية الإلكترونية 12-7331-82 FITC المضادة للفأر IL-17A بيوليجند 506908 APC مكافحة الماوس IFN-gamma بيوليجند 505810

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD4 PMA Ionomycin GM CSF

مقالات ذات صلة