العزل المغناطيسي للخلايا الدبقية الصغيرة من أدمغة جرو الفأر

الملخص

المصدر: Bokobza ، C. et al. ، العزل المغناطيسي للخلايا الدبقية الصغيرة من الفأر حديثي الولادة لمزارع الخلايا الأولية. J. Vis. Exp. (2022)

في هذا الفيديو ، نصف بروتوكولا لعزل خلايا CD11b ، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة ، من أدمغة جرو الفئران باستخدام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا. يتم تجانس أنسجة المخ للحصول على معلقات أحادية الخلية ، والتي يتم تحضينها بميكروبيدات مغلفة بالأجسام المضادة المضادة ل CD11b ، متبوعة بفصل قائم على العمود المغناطيسي لتنقية خلايا CD11b +.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تفكك الدماغ وعزل الخلايا الدبقية الصغيرة المغناطيسي

ملاحظة: يجب إجراء جميع عمليات التلاعب بالخلايا وإعادة التعليق باستخدام ماصة سعة 1,000 ميكرولتر بحذر شديد. قد يؤدي تطبيق عمل ميكانيكي عالي إلى تنشيط أو قتل الخلايا الدبقية الصغيرة.

1. نقل 12 قطعة دماغية (~ 1.2 جم) لكل أنبوب تفكك يحتوي على خليط تفكك وفقا للجدول 1. بالنسبة ل 24 جروا ، ستكون هناك حاجة إلى أربعة أنابيب C (الشكل 1 أ - ب).
2. ضع الأنابيب C على جهاز الفصل (مع وضع التسخين). ابدأ برنامج NTDK المحسن في الجهاز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (الشكل 1D).
3. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 20 ثانية (عند 4 درجات مئوية) لجمع جميع الخلايا. أكمل التفكيك الميكانيكي عن طريق سحب العينات ثلاث مرات لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 1,000 ميكرولتر (الشكل 1E).
4. انقل الخلايا إلى أربعة أنابيب سعة 15 مل + مصافي. اشطف المصافي ب 10 مل من محلول الملح المتوازن 1x Hanks (HBSS) مع Ca²⁺ و Mg²⁺ (HBSS +/+) (الشكل 1F).
5. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق (عند 4 درجات مئوية) وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات بعناية مع 10 مل من HBSS +/+ (الشكل 1G).
6. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق (عند 4 درجات مئوية) وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات بعناية باستخدام 6 مل من المخزن المؤقت للفرز (1x PBS + 0.5٪ BSA) (الشكل 1H).
7. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق (عند 4 درجات مئوية) وإزالة المادة الطافية. أضف 200 ميكرولتر من محلول CD11b-microbead لكل أنبوب وأعد تعليقه بعناية (الشكل 1I).
8. احتضان الأنابيب لمدة 15-20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات بعناية مع 6 مل من عازلة الفرز (الشكل 1I-J).
9. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق (عند 4 درجات مئوية) وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات بعناية باستخدام 8 مل من المخزن المؤقت للفرز (الشكل 1 ك).
10. اتبع برنامج POSSEL على الفاصل (انظر جدول المواد) لإعداد ثمانية أعمدة. نقل الخلايا 1 مل × 1 مل على العمود. انتظر حتى تمر جميع الخلايا قبل إضافة مل آخر. خلايا CD11b + على لوحة شطف معقمة مع 1 مل من المخزن المؤقت للفرز (الشكل 1L).
11. تجمع خلايا CD11b + في أنبوب جديد سعة 50 مل (الشكل 1 م).
12. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق (عند 4 درجات مئوية) وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات بعناية باستخدام 10 مل من وسط الخلايا الدبقية الصغيرة البارد (وسط ثقافة خالية من مصل البلاعم (SFM) + 1٪ من البنسلين الستربتومايسين (P / S)) (الشكل 1N).
13. عد خلايا CD11b +. في P8 ، يجب على المرء الحصول على ~ 650,000 خلية لكل دماغ.
    ملاحظه: في البروتوكول الحالي ، تم حساب الخلايا باستخدام عداد خلوي آلي (انظر جدول المواد).
14. أعد تعليق الخلايا في وسط الخلايا الدبقية الصغيرة الباردة إلى تركيز نهائي من 650.000-700.000 خلية / مل وتوزيعها في ألواح زراعة الخلايا.
    ملاحظه: الألواح المكونة من 6 آبار مخصصة ل Western Blot (2 مل لكل بئر) ؛ الألواح المكونة من 12 بئرا مخصصة لتحليل RT-qPCR (1 مل لكل بئر) ، والألواح المكونة من 96 بئرا مخصصة لمقايسة البلعمة (250 ميكرولتر لكل بئر).

< p class = "jove_content" >الجدول 1: تحضير خليط التفكك.

حل لأنبوب C واحد (ميكرولتر) لأربعة أنابيب C (ميكرولتر) العازلة X 2850 11400 إنزيم P (غراء) 75 300 ريال إنزيم أ (DNAse) 15 60 العازلة Y 30 120 حيا مجموع 2970 11880

النتائج

p class = "jove_content" >
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لانفصال الدماغ وعزل الخلايا الدبقية الدقيقة. (أ-ج) بعد تشريح دماغ الفأر P8 وإزالة البصيلات العطرية والمخيخ ، تم نقل الأدمغة أولا إلى طبق بتري مع HBSS +/+ ، ثم إلى أنابيب التفكك التي تحتوي على خليط التفكك. تم وضع الأنابيب C على جهاز الفصل (مع وضع التسخين) ، وبدأ برنامج NTDK (D). (ه) في نهاية البرنامج، تم طرد الأنابيب عند 300 × غرام لمدة 20 ث...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ألبومين مصل الأبقار ميلتيني بيوتيك 130-091-376 CD11b (الخلايا الدبقية الصغيرة) MicroBeads ، ح ، م ميلتيني بيوتيك 130-093-634 D-PBS (10x) الترمو: العلمية 14200067 صقل خلية الصقر 12 بئر ، قاع مسطح + غطاء دوتشر 353043 أنابيب فالكون 50 مل أنابيب فالكون 50 مل 352098 طقم تفكك الأنسجة العصبية - غراء ميلتيني بيوتيك 130-092-628 Nucleocounter NC-200 كيموميتك Nun EZFlip أعلى أنابيب الطرد المركزي المخروطية الترمو: العلمية 362694 طبق OPTILUX Petri - 100 × 20 مم دوتشر 353003 أنابيب GentleMACS C (4 × 25 أنبوب) ميلتيني بيوتيك 130-096-334 gentleMACS Octo Dissociator مع سخانات ميلتيني بيوتيك 130-096-427 محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) + CaCl2 + MgCl2 10x الترمو: العلمية 14065049 البنسلين الستربتومايسين (10 000 وحدة / مل) الترمو: العلمية 15140122 البلاعم - SFM وسيط خال من المصل الترمو: العلمية 12065074 حل مخزون MACS BSA ميلتيني بيوتيك 130-091-376 مصافي MACS الذكية (70 ميكرومتر) ، 4 × 25 قطعة ميلتيني بيوتيك 130-110-916 فاصل MultiMACS Cell24 ميلتيني بيوتيك كتل متعددة 24 عمود ميلتيني بيوتيك 130-095-691