تقنية الزراعة المشتركة لتفريق الخلايا السلفية العصبية البشرية إلى خلايا عصبية

الملخص

المصدر: Su ، C. T. E. ، et al. نهج بصري وراثي لتقييم تكوين الوصلات العصبية في نظام الزراعة المشتركة. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو طريقة لتمييز الخلايا السلفية العصبية البشرية (NPCs) إلى خلايا عصبية. يتم إدخال الشخصيات غير القابلة للعب في ثقافة مشتركة للخلايا العصبية القشرية للفأر النجمي ، مما يعزز تمايز NPC إلى خلايا عصبية. يتم تأكيد التمايز من خلال تصور الخلايا تحت مجهر متحد البؤر.

البروتوكول

فئة

1. توليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات

1. زراعة الخلايا الليفية البشرية في DMEM مكملة بمصل بقري جنيني 10٪ (FBS) في أطباق 6 آبار.
2. قبل البدء في إعادة برمجة الخلايا الليفية ، قم بتغطية 6 آبار ب Matrigel واحتضانها لمدة ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. عند التقاء 80٪ ، قم بإزالة الوسائط من مزارع الخلايا الليفية واغسلها مرة واحدة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS).
3. أضف ما يكفي من 0.25٪ تريبسين-EDTA لتغطية الطبق بالكامل واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
4. بمجرد إزاحة الخلايا من الآبار ، أضف ضعف كمية DMEM مع FBS بنسبة 10٪ مثل كمية التربسين لإخماد هضم التربسين. قم بتعليق خلايا الماصة برفق لأعلى ولأسفل لتفتيت الخلايا. احسب عدد الخلايا المفردة باستخدام مقياس كثافة الدم.
5. انقل 7 × 10⁵ خلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
6. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في محلول التثقيب الكهربائي. قم بالكهرباء بالخلايا الليفية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي وأضف 1 ميكروغرام من كل ناقل عرضي. قم بالكهرباء للخلايا بإعدادات 1,650 فولت و 10 مللي ثانية و 3 نبضات زمنية.
7. نقل تعليق الخلية إلى وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 10٪ FBS ولوحة 5 × 10⁴ خلايا لكل بئر من صفيحة 6 آبار. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
8. بعد 48 ساعة ، قم بإزالة الوسائط من مزارع الخلايا الليفية المنقولة واستبدلها بوسط mTeSR. استبدل وسائط الاستزراع يوميا حتى تصبح مستعمرات الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) جاهزة للعزل. يمكن ملاحظة مستعمرات iPSC بعد 28-35 أيام.
9. عندما تكون جاهزا للعزل, قطع ميكانيكيا مستعمرة iPSC وإعادة زرعها في وسط mTeSR مع 10 ميكرومتر Rho-المرتبطة بروتين كيناز (ROCK) مثبط (Y-27632) على لوحة Matrigel المطلية 6 آبار. استبدل وسط الاستزراع يوميا.

فئة

2. الحث العصبي وصيانة الشخصيات غير القابلة للعب البشرية

1. عندما تكون ثقافات iPSC حول 20٪ التقاء, إزالة وسط mTeSR واستبداله بوسط الحث العصبي. تجديد الوسط كل يومين.
2. بعد 7 أيام ، قم بإزالة وسيط الحث العصبي واستبدله بوسيط صيانة NPC البشري. تجديد الوسط كل يومين حتى 7 أيام قبل مرور الثقافات.
3. قبل مرور الثقافات ، قم بتغطية الأطباق / القوارير باستخدام Matrigel في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة على الأقل.
4. قم بإزالة الوسائط من ثقافات NPC البشرية المتجمعة واغسلها مرة واحدة باستخدام 1x PBS ثم قم بشفط PBS.
5. أضف ما يكفي من محلول انفصال الخلايا لتغطية جميع الآبار ثم احتضانه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
6. تأكد من انفصال جميع الخلايا. أضف ضعف كمية DMEM / F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Blend F-12) مثل محلول انفصال الخلية إلى الآبار / القوارير.
7. نقل الخلايا المحتوية على DMEM / F-12 إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي بحجم 200 × جم لمدة 5 دقائق.
8. قم بإزالة المواد الطافية وإعادة تعليق الخلايا في وسط صيانة NPC البشري سعة 5 مل. قم بتعليق خلايا الماصة برفق لأعلى ولأسفل لتفتيت الخلايا.
9. ضع ثلث إجمالي الخلايا في آبار / قوارير استزراع مطلية ب Matrigel وقم بتعبئة وسيط كاف مكمل ب 10 ميكرومتر Y-27632. احتضان أوعية الاستزراع عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
   1. قم بتقسيم الثقافات 1: 3 كل 3 إلى 4 أيام وتجديد الوسط كل يومين. الحفاظ على ثقافات NPC البشرية بكثافة عالية لمنع التمايز.

< p class = "jove_title" >3. تمايز الشخصيات البشرية غير القابلة للعب إلى خلايا عصبية في الثقافات المشتركة

1. أضف ناقل الفيروسات العسسي Synapsin1-tdTomato إلى ثقافة NPC البشرية قبل البدء في التمايز إلى الخلايا العصبية. قم بإعداد الثقافات المشتركة للخلايا النجمية / الخلايا العصبية القشرية قبل يوم واحد قبل التمييز بين الشخصيات غير القابلة للعب البشرية.
2. اغسل مزارع NPC البشرية مرة واحدة باستخدام 1x PBS وأضف ما يكفي من محلول انفصال الخلايا لتغطية جميع الآبار / القوارير ثم احتضانها لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
3. تأكد من انفصال جميع الخلايا. أضف ضعف كمية DMEM / F-12 مثل محلول انفصال الخلية إلى الآبار / القوارير. انقله إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
4. قم بإزالة الخلايا الطافية وإعادة تعليق الخلايا في وسط التمايز العصبي سعة 5 مل. قم بتعليق خلايا الماصة برفق لأعلى ولأسفل لتفتيت حبيبات الخلية إلى خلايا مفردة. احسب عدد الخلايا المفردة باستخدام مقياس كثافة الدم.
وسط
5. الشفط بعناية من مزارع الخلايا النجمية / الخلايا العصبية القشرية. لوحة الشخصيات البشرية غير القابلة للعب عند 5 × 10³ خلايا / سم² في 500 ميكرولتر من وسط التمايز العصبي مع 10 ميكرومتر Y-27632 لكل 24 بئر. أضف بلطف وسيطا يحتوي على الشخصيات غير القابلة للعب البشرية في كل بئر لتجنب إزعاج الخلايا النجمية والخلايا العصبية القشرية.
6. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. استبدل نصف الوسط بوسط طازج كل يومين إلى ثلاثة أيام لمدة 28 يوما على الأقل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Epi5 Epi5 Episomal iPSC إعادة برمجة كيت إنفيتروجين أ15960 DMEM / F12 لونزا 12719 فهرنهايت ماتريجيل BD Biosciences 354277 الوسط العصبي القاعدي إنفيتروجين 21103049 جيش صرب البوسنه سيغما أ 7906 برنامج تلفزيوني الترمو: العلمية SH30028.02 أنبوب طرد مركزي 15 مل BD Biosciences 352096 التربسين EDTA إنفيتروجين 25200056 أنبوب الطرد المركزي 50 مل BD Biosciences 352070 أطباق 24 بئر كورنينج 9761146 6 أطباق جيدة كورنينج 720083 قوارير T25 كورنينج 430641 نظام تعداء النيون إنفيتروجين MPK5000 للتثقيب الكهربائي للأرومات الليفية البشرية الخلايا الليفية البشرية الجلدية الطبيعية PromoCell سي 12300 pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE أدجين 20945