$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية للحيوانات المناسبة.
< ص الفئة = "jove_title" >
1. المواد
- قم بإعداد الحلول التالية قبل بدء البروتوكول:
- تحضير مخزن التحميل عن طريق إضافة مصل الأبقار الجنيني (FBS ، 2٪) إلى محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- أضف صبغة حمراء محايدة (NR) (1٪ نهائية) إلى PBS.
- قم بإعداد الحلول التالية باستخدام مجموعة تفكك دماغ البالغين المتوفرة تجاريا (انظر جدول المواد).
- لتحضير مزيج الإنزيم 1 ، قم بإدخال 1.9 مل من Buffer Z و 50 ميكرولتر من الإنزيم P في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
- لتحضير مزيج الإنزيم 2 ، قم بإدخال 20 ميكرولتر من العازلة Y و 10 ميكرولتر من الإنزيم A في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
- تحضير محلول إزالة الحطام.
< p class = "jove_title" >
2. نضح الفئران وتشريحها
- داخل الصفاق (IP) حقن الفأر مع 500 ميكرولتر من صبغة 1٪ NR في PBS 2-3 ساعات قبل التخدير.
ملاحظه: يساعد الحقن داخل الصفاق ل NR في نماذج الفئران المزيلة للميالين على تمييز الآفات (الشكل 1).
- تخدير الفأر باستخدام البنتوباربيتال (50 مجم / كجم ، IP) ، وتأكد من تخدير الفأر بنجاح عن طريق فحص استجابات الألم.
- افتح التجويف الصدري للفأر وفضح القلب.
- قم بقطع زاوية صغيرة من الأذين الأيمن بعناية وقم ببث الفأر داخل القلب ب 20-30 مل من PBS البارد من البطين الأيسر.
- قطع رأس الفأر تحت التخدير.
- افتح جمجمة الفأر وحرر الدماغ بعناية من الجمجمة.
- انقل الدماغ إلى قالب شريحة دماغ الفأر وقطع الدماغ إلى شرائح 0.1 سم.
- قم بإزالة شرائح الدماغ وضعها في PBS بارد في طبق بتري (60/15 مم). باستخدام ملقط الجراحة المجهرية ، قم بتشريح الآفات المسماة بصبغة NR حول الجسم الثفني تحت مجهر مجسمي.
ملاحظه: تأكد من أن الأنسجة المقطوعة كاملة قدر الإمكان لتسهيل النقل اللاحق ؛ يجب أن يكتمل تقدم التشريح الكلي في 2 ساعة.
- انقل الأنسجة المقطوعة إلى أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل تحتوي على الكمية المناسبة من المخزن المؤقت للتحميل البارد.
ملاحظه: قم بتجميع أنسجة الجسم الثفني من 2-3 فئران معا في أنبوب واحد كعينة واحدة.
< p class = "jove_title" >
3. تفكك الأنسجة
قم - بالطرد المركزي للأنسجة المقطعة عند 300 × جم لمدة 30 ثانية (بعد الوصول إلى هذه السرعة) لجمع العينة في قاع الأنبوب.
- سخن مزيج الإنزيم من 1 و 2 إلى 37 درجة مئوية في حاضنة.
- أضف 1,950 ميكرولتر من مزيج الإنزيم المسخن مسبقا 1 إلى عينة واحدة وهضمها في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- أضف 30 ميكرولتر من مزيج الإنزيم المسخن مسبقا 2 واخلطه برفق.
- يهضم في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ويخلط برفق كل 5 دقائق.
- أضف 4 مل من PBS البارد إلى الأنبوب بعد الهضم ورجه برفق.
- ضع مرشحات 70 ميكرومتر على أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل وبلل المرشحات مسبقا ب 500 ميكرولتر من PBS البارد. قم بتصفية الأنسجة المنفصلة عن طريق تمرير عينات الأنسجة المهضومة عبر المرشحات ، وانقل التعليق المفلتر في أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
ملاحظه: تخطي هذه الخطوة إذا كانت كمية الأنسجة صغيرة جدا.
- الطرد المركزي لعينات الأنسجة المفلترة عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وشفط المادة الطافية ببطء وبشكل كامل.
ملاحظه: يجب تنفيذ جميع الخطوات على الجليد باستثناء الهضم الأنزيمي.
< p class = "jove_title" >
4. إزالة الحطام
- أعد تعليق حبيبات الخلية برفق باستخدام 1,550 ميكرولتر من PBS البارد.
- أضف 450 ميكرولتر من المحلول البارد لإزالة الحطام واخلطه جيدا.
- قم بتراكب الخليط أعلاه ببطء ورفق باستخدام 2 × 1 مل من PBS البارد باستخدام ماصة سعة 1,000 ميكرولتر.
ملاحظه: قم بإمالة أنبوب الطرد المركزي بمقدار 45 درجة وأضف PBS ببطء على طول جدار الأنبوب باستخدام الماصة.
- انقل الأنبوب ببطء وبرفق إلى جهاز طرد مركزي وقم بالدوران عند 4 درجات مئوية و 3,000 × جم لمدة 10 دقائق.
- ابحث عن ثلاث طبقات بعد الطرد المركزي. قم بشفط الطبقتين العلويين بالكامل باستخدام ماصة سعة 1,000 ميكرولتر (الشكل 2).
- املأ الأنبوب حتى 5 مل بمخزن مؤقت للتحميل البارد واقلب الأنبوب برفق ثلاث مرات.
- جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية و 1,000 × جم لمدة 10 دقائق.
فئة
5. الفصل المغناطيسي للخلايا الدبقية
الدقيقة
- أعد تعليق حبيبات الخلية ب 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل وأضف 10 ميكرولتر من حبات CD11b (Microglia).
- تخلط جيدا وتحتضن لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- أضف 1 مل من عازلة التحميل وقم بسحب السائل برفق لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 1,000 ميكرولتر لغسل الخلايا بعد الحضانة. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 4 درجات مئوية و 300 × جم لمدة 10 دقائق وشفط المادة الطافية تماما لإزالة الخرز غير المرتبط.
- أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل.
- ضع عمود MS مع الفاصل الخاص به للاختيار الإيجابي في المجال المغناطيسي.
- اشطف العمود ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل لحماية الخلايا وضمان كفاءة الفرز المغناطيسي ، باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
- قم بتطبيق تعليق الخلية على عمود MS وتخلص من التدفق الذي يحتوي على خلايا غير مسماة.
- أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل إلى العمود ثلاث مرات لغسل الخلايا التي تلتصق بجدار العمود والتخلص من التدفق.
ملاحظه: أضف مخزن مؤقت تحميل جديدا للغسيل فقط عندما يكون خزان العمود فارغا.
- قم بإزالة العمود من الفاصل بعد غسل العمود وضعه على أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
- أضف 1 مل من المخزن المؤقت للتحميل في العمود وادفع المكبس إلى الأسفل لطرد الخلايا المسماة مغناطيسيا. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات لجمع الخلايا المصنفة مغناطيسيا بالكامل.
