ووصف طريقة لتحديد فردي ، والتعامل معها ، ومسببات الأمراض الصورة الحية باستخدام فخ البصرية بالإضافة إلى المجهر القرص الغزل. فخ البصرية يوفر سيطرة المكاني والزماني للكائنات الحية والأماكن المجاورة لها إلى الخلايا المضيفة. مضان المجهري التفاعلات بين الخلايا الحيوية يلتقط مع الحد الأدنى من اضطراب في الخلايا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخدام اعتراض البصرية لدراسة التفاعلات المرضي المضيف الحيوي للخلية الحية التصوير
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ديناميكية التصوير الخلية الحية تسمح برؤية مباشرة في الوقت الحقيقي التفاعلات بين خلايا الجهاز المناعي 1 ، 2 ، إلا أن عدم السيطرة المكانية والزمانية بين الخلية البلعمية وميكروب جعلت ركزت الملاحظات في التفاعلات الأولية للاستجابة المضيف لمسببات الأمراض صعبة. تاريخيا ، تم تصوير أحداث الاتصال بين الخلايا مثل البلعمة 3 عن طريق خلط أنواع الخلايا اثنين ، ثم المسح الميداني مستمر من رأي لايجاد اتصالات بين الخلايا الصدفة في المرحلة المناسبة للتفاعل. الطبيعة العشوائية لهذه الأحداث يجعل هذه عملية شاقة ، وأنه من الصعب مراقبة الأحداث في وقت مبكر أو عابرة في الخلية خلية الاتصال عن طريق هذا النهج. هذا الأسلوب يتطلب العثور على أزواج الخلية التي هي على وشك الاتصال ، والمراقبة لهم حتى الاتصال بهم من الطراز الأول ، أو لا. لمعالجة هذه القيود ، ونحن نستخدم محاصرة الضوئية كوسيلة من وسائل ، غير الغازية غير مدمرة ، ولكن سريعة وفعالة لوضع الخلايا في الثقافة.
ويتزايد استخدام المصائد الضوئية ، أو ملاقط بصرية ، في مجال البحوث البيولوجية لالتقاط والتلاعب جسديا الخلايا والجزيئات الأخرى ميكرون الحجم في ثلاثة أبعاد 4. ولوحظ تكثيف الضغط الإشعاع وتطبيقها لنظم منتاش البصرية في عام 1970 5 ، 6 ، وكان أول استخدام للسيطرة على العينات البيولوجية في عام 1987 7. منذ ذلك الحين ، قد نضجت ملاقط بصرية في التكنولوجيا لتحقيق مجموعة متنوعة من الظواهر البيولوجية 8-13.
نحن تصف طريقة السلف ال 14 التي يعيش التصوير من خلال دمج الخلايا الضوئية مع اعتراض الغزل المجهري القرص مبائر مع التحكم في درجة الحرارة والرطوبة لتوفير مجموعة رائعة والسيطرة المكانية والزمانية من الكائنات الممرضة في البيئة الفسيولوجية لتسهيل التفاعل مع الخلايا المضيفة ، على النحو الذي يحدده المشغل. العيش ، وحوصر بصريا الكائنات المسببة للأمراض مثل المبيضات البيض والرشاشية الدخناء ، الذي يمكن أن يسبب يمكن أن تكون مميتة ، والتهابات الغازية في الأفراد المناعة 15 و 16 (مثل الإيدز ، والعلاج الكيميائي ، ومرضى زرع الأعضاء) ، وذلك باستخدام الليزر كثافات غير المدمرة وانتقل بجوار الضامة ، والتي يمكن يبلعم الممرض. وارتفاع القرار ، أحالت الأفلام الخفيفة ومضان القائم على أسس القدرة على مراقبة الأحداث في وقت مبكر من البلعمة في الخلايا الحية. للتدليل على تطبيق واسعة في علم المناعة ، كما حوصر الأولية (خلايا تي) والتلاعب في شكل نقاط الاشتباك العصبي المضادة للCD3 المجهرية المغلفة في الجسم الحي ، وكما تم الحصول على الوقت الفاصل بين التصوير تشكيل المشبك. من خلال توفير وسيلة لبسط السيطرة المكانية غرامة مسببات العيش فيما يتعلق الخلايا المناعية ، ويمكن التقاط التفاعلات الخلوية بواسطة المجهر مضان مع الحد الأدنى من اضطراب الخلايا ويمكن أن تسفر عن بصيرة قوية في وقت مبكر من ردود الحصانة الفطرية والتكيفية.
البروتوكول
1. شروط الثقافة مسببات الأمراض لمحاصرة البصرية
- تنمو ألف الدخناء (B-5233/RGD12-8) على وسائل الاعلام آغار شبه صلبة تحتوي على SBD (سابورو دكستروز) حتى 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
- تنمو جيم albicans (SC5314) في YPD (الخميرة ، ببتون سكر العنب) ثقافة السائل تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسيلين بين عشية وضحاها في حاضنة شاكر في 30 درجة مئوية.
2. إعداد الممرضات لوصفها الفلورسنت
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا العمل الذي نقوم استخدام فخ البصرية لالتقاط الجراثيم ذات أبعاد ما بين 3 ميكرون -- 5 ميكرون. على الرغم من مسببات الأمراض التي تهم مختبرنا وعادة ما يكون لهذه الأبعاد ، ونظام منتاش البصرية الموصوفة هنا هي مرنة إلى اعتراض مجموعة واسعة من الأحجام. وقد استخدمت بالفعل الفخاخ البصرية لالتقاط جزيئات تتراوح بين الذرات واحدة لحوالي 10 ميكرومتر الخلايا في القطر. بالإضافة إلى ذلك ، كان هذا النظام محاصرة البصرية قادرة على التقاط جزيئات من الأشكال المختلفة : كروي ، بيضاوي الشكل ، والجزيئات.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من مستشفى ماساتشوستس الإدارة العامة للصناديق الطب الباطني (JMT ، MKM ، حركة تحرير الكونغو ، JMV) ، المعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية ومنح الهندسة الحيوية T32EB006348 (CEC) ، ومركز مستشفى ماساتشوستس العام للالحاسوبية والتكاملية الأحياء صندوق التنمية وAI062773 ( RJH) ، ومنح AI062773 ، DK83756 وDK 043351 (RJX) ، جبهة الخلاص الوطني 0643745 (MJL) ، NIH R21CA133576 (MJL) ، والمعهد الوطني لأمراض الحساسية والأمراض المعدية التابع لمعاهد الصحة القومية (NIH) AI057999 (JMV ). نشكر نيكولاس جيم يودر لإجراء مناقشات مفيدة ، وتشارلز لباد (RPI ، المؤتمر الوطني العراقي) للحصول على المساعدة التقنية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات (اختياري) |
| ألف الدخناء | البينو السلالة ، B-5233/RGD12-8 ، هدية من KJ كوون تشونغ ، المعاهد الوطنية للصحة | ||
| C. albicans | SSY50 - B متحولة ، هدية من Mylonakis الفثيريوس ، MGH ؛ SC5314 السلالة ، هدية من جيرالد فينك ، معهد وايتهيد | ||
| الكسا فلور 488 | Invitrogen | A20000 | |
| الكسا فلور 647 | Invitrogen | A20006 | |
| ثنائي ميثيل الفورماميد | سيغما | D4551 | |
| الدم الطازج | هدية من هيث RJW ، MGH ، سفينتى | ||
| نيكون المجهر المقلوب | نيكون | نموذج TI - E | |
| محاصرة ليزر ، ChromaLase | السماء الزرقاء للبحوث | CLAS - 106 - 02 - STF02 | |
| مضان الإثارة الليزر | متماسك | إنوفا طراز 70C | |
| الألواح لمكونات محاصرة | Thorlabs | MB1224 ، MB1218 | |
| البصري الهواء الجدول | شركة التصنيع التقنية | ||
| مصراع الإلكترونية مع التحكم دواسة | Uniblitz | تم شراؤها من المنتسبين فنسنت ، روتشستر ، نيويورك | |
| Singlemode الألياف البصرية | أوقية بصريات | PMJ - 3S3S - 1064-6 | |
| الألياف ميضعة | Thorlabs | PAF - X - 5 - C | |
| الألياف ميزاء | أوقية بصريات | HPUCO - 23-1064 - P - 25AC | |
| عدسات التلسكوب | Thorlabs | AC254 - 150 - B | البعد البؤري من 150 مم |
| مراحل الترجمة (س ، ص ، ض) | نيوبورت | M - 461 - XYZ | |
| IR مزدوج اللون المرآة | صفاء | ET750 - SP - 2p8 | |
| الهدف عدسة (100X) | نيكون | NA = 1.49 الغمر ، النفط ، والهدف TIRF | |
| رئيس مبائر | يوكوجاوا | CSU الحادي عشر | |
| المستقطب | نيكون | MEN51941 | |
| ولاستون المنشور | نيكون | MBH76190 | |
| EM - CCD كاميرا | هاماماتسو | C9100 - 13 | |
| اتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا (ORCA ER) | هاماماتسو | C4742 - 80 - 12AG | |
| مرشح عجلة | Ludl | 99A353 | |
| مرشح عجلة | سوتر | LB10 - نوي | |
| غرف ساترة | Lab-Tek/Nunc | 155409 | |
| Dynabeads | Invitrogen | 111 - 51D | المغلفة مع CD3 مكافحة |
| Dulbecco لتعديل النسر المتوسط (DMEM) | Invitrogen / Gibco | 10313 | |
| البنسلين / الستربتوميسين | Invitrogen / Gibco | 15140-122 | |
| L - الجلوتامين | Invitrogen / Gibco | 25030-081 | |
| الجنين المصل البقري (HyClone) | ThermoScientific | SH30071.03 |
المراجع
- Grakoui, A. The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Monks, C. R. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
