نحن تصف الإجراءات اللازمة لإدارة المتكررة من مثبطات المسكارينية يشير إلى الرافعة الأذن الطويلة (LAL) عضلات الفئران البالغين الشباب وimmunostaining لاحقة من التقاطعات في الاعصاب (NMJs) في wholemounts. عضلة LAL ومزايا فريدة للكشف عن في الجسم الحي التأثيرات الدوائية على NMJs.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحت الجلد إدارة الخصوم والمسكارينية الثلاثي Immunostaining من إبهام العضلة الرافعة أوريس في الفئران
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وكثيرا ما تستخدم عضلات الأطراف الخلفية من القوارض ، مثل الساق الأمامية والظنبوبي ، لفي الدراسات الدوائية المجراة من الإشارات الأساسية لتشكيل وصيانة NMJs الثدييات. ومع ذلك ، فإن تغلغل المخدرات في هذه العضلات بعد تحت الجلد أو في العضل الإدارة غالبا ما تكون ناقصة او غير مستوية وNMJs كثيرة يمكن أن تبقى غير متأثرة. على الرغم من أن الإدارة النظامية مع الأجهزة مثل المضخات الصغيرة يمكن أن تحسن من آثار spatiotemporal ، لا يمكن للطبيعة الغازية لهذا النهج يسبب التباس الاستجابات الالتهابية و / أو أضرار مباشرة في العضلات. وعلاوة على ذلك ، وتحليل كامل للNMJs في العضلة الخلفية أطرافهم يمثل تحديا لأنه يتطلب وقتا طويلا sectioning immunostaining المسلسل واسعة النطاق.
وLAL الماوس رقيقة ، ورقة مسطحة من العضلات الموجودة بشكل سطحي على ظهر الرقبة. فهو سريع نشل وظائف العضلات التي لتحريك الصيوان. أنه يحتوي على أجزاء منقاري والذيلية التي تنشأ من خط الوسط من الجمجمة ويمتد أفقيا إلى جزء غضروفي كل الصيوان. ويتم تزويد عضلة من قبل فرع من العصب الوجهي أن المشاريع caudally فور خروجها من الثقبة الإبرية الخشائية. لقد تم العثور على LAL وغيرها لتكون مريحة استعدادا التي توفر مزايا للتحقيق في المديين القصير والطويل الأجل في آثار المخدرات على الجسم الحي NMJs والعضلات. أولا ، وموقعها سطحية يسهل تطبيقات محلية متعددة من المخدرات تحت تخدير خفيف. الثانية ، لركاكة (2-3 طبقات من ألياف العضلات) تصاريح التصور والتحليل لNMJs كلها تقريبا داخل العضلات. ثالثا ، سهولة مع تشريح الأعصاب سليمة لها جنبا إلى جنب مع نمط تعصيب لها تصاريح التحليل التكميلي في المختبر 9،5 الكهربية. الماضي ، وربما الأهم من ذلك ، حجم صغير تطبيق (~ 50μl) تغطي بسهولة على سطح العضلة بأكملها ، ويوفر موحدة والتعرض المطول للNMJs به جميعا في المخدرات ويلغي الحاجة إلى اتباع نهج متسق 1،8.
البروتوكول
1. تحت الجلد إدارة الخصوم أستيل المسكارينية (mAChR) مستقبلات
- إعداد تحت ظروف معقمة الجرعة المناسبة من خصم mAChR ، (راجع ، الجدول) عن طريق تذويب المخدرات في المياه المالحة الفسيولوجية العقيمة في أنبوب 1.5mL رد فعل. الخصوم التالية استخدمت : الأتروبين ، Methoctramine ، 4 - رطبة ، AFDX - 116 ، AFDX - 384 ، MT 7.
- رسم 50μl حل حقنة الانسولين في a1cc واستخدام حقنة منفصلة لكل الماوس. أيضا بإعداد الحقن التي تحتوي على المياه المالحة الفسيولوجية فقط لكل الماوس في السيطرة على المجموعة. إبقاء الحقن على الجليد حتى جاهزة للحقن.
- تخدير الفئران مع الكيتامين - زيلازين الكوكتيل (120 ملغم / كغم من الكيتامين و 8 ملغ / كغ زيلازين) التحقق من عمق التخدير المناسبة من خلال مراقبة عدم استجابة إلى أخمص قدميه قرصة.
- بعد التخدير المناسبة ، حلق الشعر الذي يغطي المنطقة منقاري من الرأس إلى المنطقة الذيلية من الرقبة ، ومحو ما تبقى الشعر بعيدا مع الايثانول 70 ٪.
- الفأر في ظل stereomicroscope ، وإدراج موازية لإبرة عضلية LAL حين سحب ما يصل برفق على إبرة المحقنة (الشكل 1A ، B). هذا يضمن أن يتم إدخال الإبرة في النسيج الضام المغطي ولا أضرار مباشرة في عضلة LAL نفسها. ادخال الإبرة بحيث يغطي رأس الجانب الذيلية عضلة LAL.
- تبدأ ببطء جدا لحقن المحلول فوق العضلات LAL حق حين سحب الحقنة ، والوقت حقن مجموع ينبغي حوالي 1 دقيقة. إذا حقنت بشكل صحيح ، يجب حل تشكيل "القبة" وهذا هو ما يقرب من 1 سم في القطر ، في الجلد المغطي التي ستبقى لمدة ساعة على الأقل. سيكون هناك حل موحد حقن تغطية مناطق بأكملها منقاري والذيلية من العضلات LAL الحق.
- كرر الإجراء كل 12 ساعة لمدة 1-7 أيام. لstudies1 أخرى ، استخدمنا نفس البروتوكول لحقن عوامل النمو كل 12 ساعة لمدة تصل إلى 21 يوما. لم يلاحظ أي استجابات غير طبيعية من فئران تديرها 2X مع تخدير في اليوم لمدة تصل إلى 21 يوما.
2. تشريح العضلات LAL
- الموت ببطء مع الفئران جرعة زائدة من الصوديوم بنتوباربيتال (390 ملغ / كلغ). وأكد وفاة من خلال تقييم نقص ضربات القلب بعد إجراء بضع الصدر.
- دبوس باستمرار على الماوس في طبق تشريح ، حتى مع الجانب الظهري 1 دبوس في كل مخلب و 1 دبوس عن طريق الأنف.
- جعل شق الأولى من خلال الجلد فقط ، وذلك باستخدام مقص لقطع صغيرة الربيع على طول LAL اليسرى من المنطقة القريبة فقط على الأذن في المنطقة حول الكتف الأيسر.
- إزالة بعناية الجلد في هذه المنطقة ، ولكن تجنب قطع قريبة جدا من الأذن اليمنى حيث أن هذا هو واحد من الإسناد لعضلة LAL الحق.
- تحديد الأنسجة الدهنية المتمركزة مركزيا الشريط من الدهون على طول خط الوسط ، على السطح سطحية في الرأس ، حيث العضلات اليمنى واليسرى LAL قاء. باستخدام مقص صغير في الربيع ، وقطع 1cm إلى اليمين من الأنسجة الدهنية (نحو الأذن اليسرى) من الحافة القريبة من العضلات LAL اليسار حتى تصل إلى الكتف (الشكل 1C).
- مرة واحدة يتم إجراء شق ، قشر العضلة الخلفية LAL الحق مع ملقط صغير للكشف عن الجانب البطنية من العضلات. قص النسيج الضام ، وبينما لفافة بعناية سحب ما يصل على عضلة LAL الحق مع ملقط (الشكل 1C).
- قطع حوالي نهاية الذيلية للLAL الحق في قاعدة الأذن. تواصل خفض وصولا الى نهاية منقاري من الأذن اليمنى ، والحفاظ على حق سلمت LAL (الشكل 1C). فمن الأفضل لتشمل المزيد من الأنسجة في هذه الخطوة من مخاطر الإضرار LAL نفسها. إذا كانت العضلات تبدأ لتجف ، ماصة 1X PBS على العضلات.
- مكان تشريح LAL الحق في الثقافة 30mm Sylgard صحن يحتوي على 1X PBS ، حتى الجانب الظهري. دبوس بانخفاض أربعة أركان من العضلات مع دبابيس الحشرات الصغيرة.
- باستخدام ملقط ومقص صغير الربيع ، والنسيج الضام نظيفة من السطوح الظهرية والبطنية من العضلات LAL الحق. بدوره على العضلات وإعادة دبوس من أجل تنظيفه قبالة السطح البطني. لا يجوز أن يوضع 2-3 العضلات في نفس الطبق 30mm.
3. الثلاثي immunostaining من NMJs LAL : يوم 1
- قبل بداية immunostaining ، وإعداد جميع الكواشف اللازمة. سوف 1X PBS ، الأبقار مصل الزلال 2 ٪ BSA) / برنامج تلفزيوني ، 0.1M جليكاين في 2 ٪ تكون هناك حاجة إلى جيش صرب البوسنة / PBS ، 0.2 ٪ X100 تريتون في 2 ٪ BSA / برنامج تلفزيوني ، وبارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني 1X. قبل الميثانول بارد في الثلاجة -20 درجة مئوية.
- ترك العضلات LAL معلقة في طبق جانبي ظهري حتى أثناء هذه العملية. تجاهل 1X PBS الحل وإضافة ما يكفي من 4 ٪ (PFA) لتغطية العضلات. تعيين مكان على طبق شاكر في سرعة 2 أو 3 لمدة 20 دقيقة. ما لم يذكر خلاف ذلك ، ينبغي أن توضع في طبق على شاكر للخطوات التالية.
- تجاهل PFA 4 ٪ ، ويغسل العضلات مع 1X 3 مرات في برنامج تلفزيوني ، 10 'لكل منهما.
- تجاهل مشاركة 1X PBS يغسل وإضافة 0.1M جليكاين في 2 ٪ BSA / PBS حل ل30 '.
- تجاهل 0.1M جليكاين حلاد إضافة 1X PBS تحتوي رودامين مترافق α - بنغاروتوكسين بتركيز لمدة 15 1:200.
- تجاهل α - بنغاروتوكسين حل ، ويغسل في عضلة 1X PBS ، 3 مرات 10 'لكل منهما.
- Permeabilize الأنسجة بإضافة الميثانول قبل تبريده ووضع الطبق في الثلاجة -20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق بالضبط ، والهز لا الحاجة.
- إزالة الميثانول وتغسل 3 مرات 10 'مع كل برنامج تلفزيوني 1X. تجاهل الماضي وغسل كتلة الأنسجة مع 0.2 ٪ تريتون X - 100 في 2 ٪ BSA / برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة. يتم تنفيذ الخطوات الغسيل وعرقلة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان العضلات بين عشية وضحاها ، والهز ، في 4 درجات مئوية في مزيج من الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل (راجع ، الجدول).
4. الثلاثي immunostaining من NMJs LAL : يوم 2
- غسل العضلات في 1X 3 مرات في برنامج تلفزيوني ، 10 'كل في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة مزيج من الأجسام المضادة الثانوية في عرقلة الحل لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (راجع ، الجدول). يجب أن تكون محمية من الضوء على العضلات من هذه الخطوة فصاعدا لمنع الصور وتبييض مضان 647 - اليكسا فلور.
- غسل العضلات في 1X 3 مرات في برنامج تلفزيوني ، 10 'لكل منهما.
- تنظيف قبالة أي نوع من الأنسجة الضامة المتبقية في برنامج تلفزيوني 1X ، وقطع الحدود الجانبية للعضلات LAL وجبل على شرائح تصل الجانب الظهري ، وذلك باستخدام غطاء زجاجي زلات ووسائل الإعلام في تصاعد مستمر. استخدام طلاء الأظافر واضحة لتأمين تغطية الانزلاق في المكان.
- حماية الشرائح من الضوء وتخزينه في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للتحليل.
5. مبائر تصوير NMJs LAL
- ويتم الحصول على صور عالية الدقة مع مبائر هدفا لايكا آبو خطة النفط 63X (1.4NA) على المجهر لايكا 4D TCS مبائر.
- وقد تم مسحها ضوئيا في وقت واحد والاشارات فلوريسئين اليكسا 647 مع خطوط الليزر 488 نانومتر (أرغون ، 488 نانومتر ، و 20 ميغاواط) و 633 نانومتر (HeNe ، 633 نانومتر ، و 10 ميغاواط) ، على التوالي. بالتتابع ، ثم يتم مسحها إشارة رودامين مع خط ليزر 561 نانومتر (DPSS ، 561 ، 20 ميغاواط). وقد تم جمع الأجزاء البصرية في فترات 0.3 ميكرون ، وعدد الصور في Z - طائرة متنوعة 60-80. يتم ضبط الثقب إلى 1 إيري (107.97 أم). تنسيق الصورة 1024 x 1024 (X ، Y) ، مع عامل التكبير من 1 ، إلى نتائج سرعة 400Hz في حجم صورة 234.32 234.32 س ميكرومتر ميكرومتر وحجم بكسل نانومتر 229.05 229.05 س نانومتر.
- ثم يتم استخدام برامج لايكا اقتناء TCS - NT - Z لإعادة بناء الصور في سلسلة توقعات الكثافة القصوى.
- ويتم تعديل الصور Multipanel عن السطوع والتباين باستخدام أدوبي فوتوشوب.
- لالعضلات LAL نموذجية ، ينبغي للمرء أن يكون قادرا على تحليل ما يقرب من 75-100 NMJs وجه خاص. يتحدد الاستقرار متشابك من المميزات مثل المحاذاة المكاني لمرحلة ما قبل ، وبعد المشبكي شبه العناصر (أي الأعصاب ، وخلايا شوان والعضلات) ، وقياسات المساحة متشابك (أي حجم المشبك).
ممثل النتائج :
في NMJ في الثدييات الكبار ، ومحور عصبي محرك واحد يفصل فروع الغرامة التي تشكل العرش متباينة جدا من محطة عصب (الشكل 2 ؛ الأخضر) على ألياف العضلات واحد ، على وجه التحديد لمجموعات apposed بعد المشبكي من AChRs النيكوتينيك (الشكل 2 ؛ الأحمر) . Perisynaptically ، محطة خلايا شوان تغطي بإحكام جميع فروع العصب محطات قبل المشبكي (الشكل 2 ؛ الأزرق). هو بشدة على السلامة الهيكلية والوظيفية لهذه المنظمة الثلاثية مضطرب من جراء التطبيق اليومي لمثبطات mAChR سلالة معينة. في المثال المقدمة هنا (الشكل 3) ، 4 - رطبة ، وهو خصم mAChR مع تقارب عالية لM1 ، M3 ، M4 و M5 mAChR فرعية ، تثير القضاء الانتقائي لمحطات العصبية من NMJs عديدة في جميع أنحاء سطح العضلات (الشكل 3B ، C). بالإضافة إلى ذلك ، محطة خلايا شوان وهادئة بشكل غير طبيعي كما يتضح من 8 وسم S100 مشرق دون تمديد العملية (الشكل 3B "3C"). Postsynaptically ، ألياف العضلات طبيعية وليس هناك فقدان nAChRs (الشكل 3B ، 3C ').
الشكل 1. الموقع التشريحي وتنظيم LAL العضلات. وتظهر مواقع منقاري (rLAL) ، الذيلية (cLAL) ، والعصب لال (LALn) وشرائح endplate المقابلة (A ، أقحم). يظهر موقع واتجاه الإبرة في العضلة يتعلق LAL لإجراء الحقن (B). وتظهر نقاط شق لإجراء تشريح (C).
الشكل 2. الثلاثية للمنظمة NMJ. عالية التكبير وجهات النظر مبائر NMJ من الماوس. محور عصبي واحد يفصل فروع المحطة الدقيقة (A) ، تغطي بإحكام من قبل خلية شوان محطة وعملياتها (A "نقطة النجمية ، إلى الهيئات محطة خلية شوان). Postsynaptically في ألياف العضلات ، هو بالضبط apposed مجموعة من AChRs النيكوتينيك لفروع العصب terminals وخلايا شوان المحطة.
الشكل 3. LAL تعامل مع العضلات رطبة - 4 ، وهو خصم mAChR. آراء مبائر التكبير المنخفضة والعالية للعضلات ، LAL تعامل مع السيارة أو 4 رطبة. على النقيض من السيارة العضلات معاملة (A - A NMJs ''')،عديدة في 4 محطات المعالجة رطبة العضلات العصب نقص (B - B'' '، C - C'''). هو أسرع ومحاصر في منطقة في الشكل 2B 2C الشكل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الطريقة المعروضة هنا تصاريح التحقيق في أدوار غير المعترف بها في وقت سابق من mAChR - سلالة معينة يشير في الاستقرار وصيانة NMJs الثدييات. وسوف يكون هذا الأسلوب مفيدا أيضا لاختبار تأثير عوامل عصبية وكلاء الدوائية. على سبيل المثال ، وجدت أن لدينا مختبر الهدبية عامل التغذية العصبية (CNTF) أثارت تنتشر تقريبا من جميع المحطات العصب LAL في الفئران البالغة 1 . هذه النتيجة تتناقض مع الدراسات السابقة من CNTF المعاملة عضلات الأطراف الخلفية ، والتي تنتشر في المعتدلة ذكرت كاليفورنيا. 13-3...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة العضلات الضمور ، ورابطة (NS062320).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
| الكيتامين | هوسبيرا | NDC0409 - 2051-05 | الجرعة : 120mg/kg |
| زيلازين | مختبرات لويد | LA33806 | الجرعة : 8mg/kg |
| الأتروبين | سيغما الدريخ | A0132 | (> نقاء 98 ٪) ؛ الجرعة : 0.2mg/kg -- 20mg/kg |
| الأتروبين | فويجت التوزيع العالمي | AT105 | الصيدلانية الصف |
| Methoctramine | سيغما الدريخ | M105 | الجرعة : 100 -- 400M |
| 4 الرطب | سيغما الدريخ | D142 | الجرعة : 2.5mg/kg |
| AFDX - 116 | العلوم البيولوجية Tocris | 1105 | 250M |
| AFDX - 384 | العلوم البيولوجية Tocris | 1345 | 50M -- 500M |
| MT 7 | الببتيدات الدولية | PMT - 4340 - S | 0.1M -- 1M |
| التخزين المؤقت 1X الفوسفات المالحة ، ودرجة الحموضة 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| بارافورمالدهيد | الصياد | T353 - 500 | جعل حل 10 ٪ أول من حل 10g/100mL غير المتأينة الماء المقطر ، وجعل 4 ٪ مع 1X PBS ، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 |
| pentobarbitol الصوديوم | Virbac صحة الحيوان | NDC - 051311 - 050 - 01 | الجرعة : 390mg/kg |
| Sylgard | داو كورننغ | جزء # 184 | اتبع التعليمات التي تأتي مع المجموعة ، ويمكن استخدام طبق ثقافة متعددة الحجم (30mm ، 60mm ، 100mm) ، تبعا للاحتياجات |
| 0.1M جليكاين | سيغما الدريخ | G - 7126 | إضافة إلى 0.185g 25mL 2 ٪ BSA / PBS |
| 2 ٪ ألبومين المصل البقري (BSA 2 ٪) | سيغما الدريخ | A3059 - 100G | 2G الى حل جيش صرب البوسنة من 100ML 1X PBS |
| 0.2 ٪ X100 تريتون في 2 ٪ BSA / PBS (حظر مؤقت) | سيغما الدريخ | T9284 - 100ML | حل 0.2ml/100mL 2 ٪ BSA / PBS |
| α - بنغاروتوكسين | Invitrogen | T1175 | استخدامها في تركيز 1:200 |
| SMI - 312 | Monoclonals Sternberger | SMI312 | استخدامها في تركيز 1:1000 |
| SV2 | الدراسات التنموية ورم هجين الضفة | SV2 - الطافي (Supernatant) | استخدامها في تركيز 01:10 |
| S100 | داكو | Z0311 | استخدامها في تركيز 1:400 |
| FITC الماعز المضادة للماوس IgG1 | روش | 03117731001 | استخدامها في تركيز 1:200 ، ولكن إذا خلفية عالية ، محاولة 1:400 |
| الكسا - 647 فلور الماعز مترافق المضادة للأرنب | Invitrogen | A21244 | استخدامها في تركيز 1:200 |
| Vectashield الفلورسنت تصاعد وسائل الإعلام | ناقلات المختبرات | H - 1000 | هذه ليست وسائل الاعلام الثابت المحدد ، وسوف تحتاج لتأمين تغطية زلة مع طلاء الأظافر واضحة. |
| مقصات صغيرة الربيع | أدوات العلوم غرامة | 15002-08 | |
| تشريح ملقط | أدوات العلوم غرامة | 11295-51 |
المراجع
- Wright, M. C., Son, Y. J. Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice. Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).
- Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).
- Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction. J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).
- Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses. J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).
- Lanuza, M. A. Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase. C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).
- Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).
- Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin. J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).
- Wright, M. C. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors. J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).
- Dorje, F. Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes. J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).
- Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors. Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
