تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. تحضير والثقافة لشريحة الحصين
ملاحظة: يسمح هذا البروتوكول بإنتاج شرائح الحصين العضوية. من الناحية المثالية ، لا ينبغي القتل الرحيم لأكثر من ثلاثة وتشريحها في جلسة واحدة لضمان تنفيذ كل خطوة بسرعة وتجنب المساس بجودة الشرائح. استخدم تقنية معقمة طوال الوقت.
- تأكد من اتخاذ الخطوات التالية قبل بدء بروتوكول التشريح.
- قم بإعداد وتصفية تعقيم جميع المحاليل مسبقا باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
- احتفظ بالمحاليل عند 4 درجات مئوية أثناء التخزين وفي جميع أنحاء تشريح الدماغ وتحضير شرائح الحصين عن طريق الاحتفاظ بحاويات التخزين وأطباق بتري على بالوعة حرارة معدنية جالسة على الثلج الرطب في جميع الأوقات.
- الأوتوكلاف جميع الأدوات المعدنية والخواتم والأنسجة الورقية.
- تأكد من أن جميع الأدوات والمواد التي سيتم استخدامها في كل خطوة من خطوات البروتوكول جاهزة للاستخدام ، وموضوعة مسبقا ، ورشها بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم اتركها تبرد وتجف.
- قتل جرو فأر C57BL / 6N البالغ من العمر 5-7 أيام عن طريق خلع عنق الرحم وامسح سطح الجلد بالكامل لفترة وجيزة بمنديل ورقي معقم مبلل في 70٪ من الإيثانول. جفف الجلد بالتربيت عليه واقطع رأس الجرو باستخدام مقص المايونيز.
- قص جلد فروة الرأس بمقص القزحية على طول خط الوسط للرأس ، بدءا من المنطقة القذالية وتنتهي بالقرب من الخطم ، وسحبه بشكل جانبي.
- أدخل طرف مقص Vannas في الثقبة العظمى وقم بعمل قطعتين جانبيتين صغيرتين على العظم على طول الجيوب الأنفية المستعرضة ، ثم قم بقص الجمجمة على طول خط الوسط حتى البصلة الشمية وقم بعمل قطعتين صغيرتين بشكل عمودي على خط الوسط في هذه المنطقة.
- باستخدام ملقط منحني دقيق ، اسحب اللوحات العظمية بشكل جانبي بعيدا عن خط الوسط. قم بإزالة الدماغ بعناية باستخدام ملعقة صغيرة وانقله إلى طبق بتري مغطى بالسيليكون مقاس 90 مم يحتوي على "وسيط تشريح><".
ملاحظه: وسيط التشريح هو محلول الملح المتوازن من Gey (5 مجم / مل D-glucose ، 1٪ محلول مضاد للمضادات الحيوية ومضاد للفطريات ، 10,000 وحدة / مل بنسلين ، 10 مجم / مل من الستربتومايسين ، و 25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B).
- قم بإزالة المخيخ وافصل نصفي الكرة المخية على طول خط الوسط باستخدام شفرة حلاقة. استخدم ملعقة لنقل نصفي الكرة المخية إلى طبق بتري جديد مغطى بالسيليكون مطاط بمطاط أسماكه مقاس 90 مم مليء بوسط تشريح طازج مثلج. إذا كان سيتم استخدام أكثر من واحد في جلسة واحدة، كرر الخطوات من 1.2 إلى 1.6.
- تحت المجهر المجسم ، قم بقص البصلة الشمية وطرف القشرة الأمامية بشفرة حلاقة وافصل القشرة الدماغية عن بقية الأنسجة الدماغية باستخدام ملقط رفيع الرؤوس. تترك هذه الخطوة الحصين مكشوفا على السطح الإنسي للأنسجة القشرية. من هذه الخطوة فصاعدا ، استخدم غطاء مزرعة الأنسجة ذات التدفق الصفحي (معقم بالأشعة فوق البنفسجية وتنظيفه بمحلول إيثانول بنسبة 70٪).
- ضع وسط تشريح مثلج على قرص تقطيع بلاستيكي مسطح ، وباستخدام ملعقة ، ضع أنسجة المخ على القرص بحيث يكون السطح الإنسي للقشرة متجها لأعلى ويكون محور الحصين عموديا على محور شفرة التقطيع.
- قم بإزالة وسط التشريح من قرص التقطيع قدر الإمكان باستخدام ماصة باستور ذات الطرف الرفيع.
- قطع الدماغ إلى شرائح 400 ميكرومتر باستخدام مفرمة مناديل بسرعة وقوة تقطيع بنسبة 50٪.
ملاحظه: يجب إكمال هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن ، حيث لا يتم غمر أنسجة المخ في وسط التشريح.
- استبدل وسط التشريح في طبق بتري المطلي بالسيليكون المطاط الصناعي بوسط مثلج طازج.
- بمجرد الانتهاء من مفرمة المناديل ، اغمر أنسجة المخ بعناية في وسط تشريح جديد وانقل الأنسجة المقطوعة مرة أخرى إلى طبق بتري المطلي بالسيليكون 90 مم باستخدام مشرط مستقيم.
- تحت المجهر المجسم ، افصل الشرائح القشرية بعناية باستخدام ملقط رفيع الأطراف. لكل شريحة ، افحص الحصين بحثا عن التشكل وتلف الأنسجة المحتمل الناتج عن التشريح أو التقطيع.
- افصل الحصين عن القشرة المخية الداخلية وعن الفيمبريا باستخدام ملقط رفيع الرأس ومقص فاناس صغير. عادة ، يتم إنشاء حوالي 6 إلى 8 شرائح من الحصين لكل نصف كرة الأرضية.
- انقل ما يصل إلى 6 شرائح من الحصين إلى حشوة مزرعة الأنسجة باستخدام ماصة باستور مقطوعة وضعها داخل طبق بتري مقاس 35 مم. تأكد من أن الشرائح منتشرة على بعد بضعة ملليمترات (سيضمن ذلك إمكانية تصوير كل شريحة على حدة).
- أضف على الفور "وسط النمو" المثلج إلى قاع كل طبق بتري ، أسفل ملحق ثقافة الأنسجة ، أسفل الجزء العلوي من حافة إدراج ثقافة الأنسجة.
ملاحظه: يحتوي وسط النمو على 50٪ حد أدنى من النسر المتوسط الأساسي ، و 25٪ محلول ملح متوازن من هانكس ، و 25٪ مصل الحصان ، و 5 مجم / مل D-glucose ، و 2 مليمول / لتر L-glutamine ، و 1٪ محلول مضاد للمضادات الحيوية ، و 10 مليمول / لتر HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic) ، معايرة إلى درجة الحموضة 7.2 مع هيدروكسيد الصوديوم.
- قم بتغيير وسط النمو في اليوم التالي للتشريح وكل 2 إلى 3 أيام بعد ذلك (استخدم وسط النمو عند 37 درجة مئوية). تأكد من إضافة وسط النمو بشكل كاف ولكن ليس لدرجة أنه يفيض فوق غشاء إدخال ثقافة الأنسجة ، مما قد يضر بصلاحية شرائح الأنسجة.
- قبل استخدامها في التجارب ، احتفظ بشرائح الأنسجة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في الهواء لمدة 12 إلى 14 يوما.
< p class = "jove_title" >
2. تحضير شرائح الحصين العضوية لبروتوكول TBI التجريبي للانفجار
ملاحظة: تتم خطوات هذا القسم ، باستثناء التصوير ، في غطاء مزرعة أنسجة التدفق الصفيحي.
- أدخل الحلقات المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ المصنوعة حسب الطلب في صفيحة مكونة من 6 آبار (واحدة لكل بئر).
ملاحظات: تحتوي الحلقات على حافة ذات شق (والتي يجب أن تجلس في وضع الساعة 12) وتتناسب بشكل مريح مع الآبار ، بينما تتناسب إدخالات ثقافة الأنسجة بسهولة مع هذه الحافة. تأكد من غسل الحلقات بمطهر مبيد للجراثيم ، وشطفها جيدا بالماء النقي ، وتعقيمها ، وتركها لتبرد مسبقا.
- املأ بئر الصفيحة المكونة من 6 آبار ب "وسط تجريبي" خال من المصل مسخن مسبقا (37 درجة مئوية) باستخدام يوديد البروبيديوم.
ملاحظه: الوسط التجريبي مع يوديد البروبيديوم هو 75٪ الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسي ، 25٪ محلول ملح متوازن من هانكس ، 5 مجم / مل D-glucose ، 2 مليمول / لتر L-glutamine ، 1٪ محلول مضاد حيوي مضاد للفطريات ، 10 مليمول / لتر هيبيس و 4.5 ميكرولتر / لتر يوديد بروبيديوم ، درجة حموضة معايرة إلى 7.2 مع هيدروكسيد الصوديوم.
- تأكد من أن المستوى المتوسط لا يصل إلى أعلى من شق الحلقة. انقل اللوحة المكونة من 6 آبار مع الحلقات مرة أخرى إلى الحاضنة لمدة ساعة واحدة للتأكد من أن الوسط عند 37 درجة مئوية مباشرة قبل نقل إدخالات ثقافة الأنسجة.
- انقل إدخالات ثقافة الأنسجة مع الشرائح العضوية من أطباق بتري مقاس 35 مم إلى اللوحة المكونة من 6 آبار مع الحلقات والوسط التجريبي بالملقط.
- اصنع نقطة على حافة الإدخال في موضع الساعة 3 بقلم تحديد دائم.
ملاحظه: ستتم إزالة الإدخالات من اللوحة المكونة من 6 آبار أثناء التجربة. تسهل هذه الخطوة إعادة الملحق إلى موضعه الأصلي بعد التعرض لموجة الصدمة وتتبع كل شريحة بسهولة في جميع أنحاء البروتوكول.
- قم بتسمية كل صفيحة مكونة من 6 آبار باسم وتاريخ فريد وقم بعمل خريطة لآبار كل لوحة ، مع تسمية كل بئر (على سبيل المثال ، A ، B ، C ، إلخ) وكل شريحة في كل بئر (على سبيل المثال ، 1 ، 2 ، 3 ، إلخ) ، بحيث يكون لكل شريحة معرف فريد (على سبيل المثال ، A1 ، A2 ، A3 ، إلخ).
- انقل اللوحة المكونة من 6 آبار إلى الحاضنة لمدة ساعة واحدة مباشرة قبل التصوير للتأكد من أن الشرائح عند 37 درجة مئوية < / >
ملاحظه: تجنب فيضان فقاعات الوسط أو الهواء تحت غشاء إدخال ثقافة الأنسجة ، مما قد يضر بصلاحية الشرائح.
- بعد ساعة واحدة من الانتقال إلى الوسط التجريبي ، قم بتصوير كل شريحة على حدة باستخدام مجهر مضان (هدف 2X ، NA 0.06) مزود بمرشح إثارة مناسب (BP 535/50 نانومتر) وانبعاث (LP 610 نانومتر) لتقييم صحة الشريحة قبل تنفيذ بروتوكول الإصابة.
تلاحظ: يجب اعتبار الشرائح التي تظهر مناطق من التلطيخ الأحمر الكثيف في هذه المرحلة على أنها تمثل قابلية للخطر ويجب استبعادها من مزيد من التحليل (تمثل هذه عادة أقل من 10٪ من العدد الإجمالي للشرائح المتولدة). تأكد من إجراء التصوير بالتتابع وبأسرع ما يمكن لتقليل الوقت الذي تكون فيه الشرائح خارج الحاضنة (عادة ما تستغرق 6 آبار أقل بقليل من 30 دقيقة للتصوير).
- احتفظ بغطاء اللوحة المكونة من 6 آبار في جميع الأوقات. قد يتراكم بعض التكثيف داخل الغطاء. إذا حدث هذا ، فاستخدم مجفف شعر لفترة وجيزة على الإعداد المنخفض.
- تأكد من أن جميع ظروف التصوير متطابقة في أيام مختلفة وبين التجارب.
ملاحظه: الهدف من التصوير هو تحديد مضان الأنسجة. ومن ثم ، فإن هذه الخطوة مهمة لضمان قابلية تكرار النتائج والسماح بمقارنة البيانات.
< p class = "jove_title" >
3. غمر ونقل إدراج ثقافة الأنسجة مع شرائح الحصين العضوية
- مباشرة بعد التصوير ، في غطاء التدفق الصفحي ، يتم إخراج ثقافة أنسجة واحدة من اللوحة المكونة من 6 آبار باستخدام ملقط.
- انقل الملحق بعناية إلى كيس بولي إيثيلين معقم (3 × 5 بوصات) مملوء مسبقا ب 20 مل من الوسط التجريبي الدافئ (37 درجة مئوية) المغطى حديثا ب 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
ملاحظه: تأكد من أن الوسط التجريبي المخصب بالأكسجين وثاني أكسيد الكربون قد تم فقاعاته لمدة 40 دقيقة على الأقل باستخدام 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون باستخدام فقاعات زجاجية مغشوشة داخل زجاجة دريشيل ونقلها إلى أكياس البولي إيثيلين المعقمة داخل غطاء مزرعة الأنسجة ذات التدفق الصفحي باستخدام حقنة سعة 20 مل مع مرشح بكتيري وأنبوب تعبئة معقم (127 مم) متصل. أغلق الأكياس على الفور وانقلها إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل نقل إدخال ثقافة الأنسجة.
- تأكد من وضع علامة على كل كيس معقم بشكل صحيح (مع اللوحة وتحديد الهوية جيدا). كرر هذه الخطوة لكل حشوة مزرعة أنسجة. استبعد فقاعات الهواء بعناية عند إغلاق الأكياس المعقمة (يتم إجراؤها بإحكام عن طريق لف الجزء العلوي من الأكياس ووضع مشبك بلاستيكي).
- أعد الأكياس المعقمة مع إدخالات زراعة الأنسجة والألواح المكونة من 6 آبار ذات الوسط التجريبي في الحاضنة 37 درجة مئوية.
- بعد 1 ساعة ، قم بتعبئة الأكياس المعقمة بعناية مع إدخالات زراعة الأنسجة في صناديق بلاستيكية داخل صندوق منظم حراريا مملوء بالماء منزوع الأيونات عند 37 درجة مئوية للحفاظ على الشرائح العضوية في درجة حرارة فسيولوجية طوال بروتوكول التعرض لموجة الصدمة.
< ص الفئة = "jove_title" >
4. تحضير أنبوب الصدمة والتعرض لموجة الصدمة لشريحة الحصين العضوية
- ارتد أحذية واقية من أصابع الصلب ومعطف مختبر وقفازات أثناء تحضير أنبوب الصدمة وتعريض موجة الصدمة.
قم بتثبيت - إطار حامل الكيس المعقم على الحافة البعيدة لأنبوب الصدمة ، مع التأكد من محاذاة الفتحة المركزية مع مخرج أنبوب الصدمة (باستخدام قضيب تقطيع).
- قم بتركيب محولات ضغط شعاعيا: المستشعر 1 في الجزء الأوسط من القسم المدفوع والمستشعر 2 في الحافة البعيدة لأنبوب الصدمة (الشكل 1 أ). قم بتوصيل محولات الضغط براسم الذبذبات من خلال وحدة طاقة مصدر حالي.
- تأكد من إغلاق جميع صمامات تحرير أنبوب الصدمات وأدوات التحكم في التدفق.
- افتح خط الهواء المضغوط الخارجي وشحن صمام الملف اللولبي إلى 2.5 بار.
- افتح صمام أمان أسطوانة الهواء المضغوط وافتح منظم الضغط ببطء لزيادة الضغط إلى حوالي 5 بار.
ملاحظة: يجب أن يكون الضغط المحدد لهذا المنظم أعلى قليلا من أعلى ضغط انفجار الحجاب الحاجز.
- قم بإعداد الأغشية عن طريق تقطيع صفائح بوليستر بسمك 23 ميكرومتر إلى مربعات 10 × 10 سم 2. قم بإعداد المقابض باستخدام شريط الأوتوكلاف وألصقها في أعلى وأسفل كل غشاء.
- ضع غشاء واحد (فتحة واحدة من المؤخرة المزدوجة - تكوين الحجاب الحاجز الفردي) أو غشاءين (كلتا فتحتي المؤخرة المزدوجة - تكوين الحجاب الحاجز المزدوج) في المؤخرة (الشكل 1 ب).
- قم بتوسيط الأغشية وتثبيتها باستخدام أربعة مسامير وصواميل M24 ، وقم بربطها بالتتابع بطريقة متماثلة قطريا والتأكد من أن الأغشية خالية من التجاعيد.
- قم بتثبيت كل كيس معقم على حدة في وضع رأسي على إطار الحامل ، مع التأكد من أن سطح ثقافة الأنسجة مع شرائح الحصين العضوية يواجه مخرج أنبوب الصدمة وأن ملحق ثقافة الأنسجة في المنتصف داخل الكيس المعقم (الشكل 1C). تأكد من تثبيت الكيس المعقم بإحكام في كل مكان لضمان ثبات وتثبيت متساوي.
- ارتد مدافعات الأذن ونظارات السلامة عند الضغط على أنبوب الصدمة. قم بتشغيل وحدة طاقة المصدر الحالية وراسم الذبذبات للحصول على بيانات موجة الصدمة (معدل اكتساب 50 عينة ميجا / ثانية ، طول قياسي 20 مللي ثانية ، 1 مليون نقطة) وإغلاق صمام الملف اللولبي.
- باستخدام مقبض التحكم في التدفق الموجود على لوحة التحكم في أنبوب الصدمة ، اضغط ببطء على قسم حجم السائق في أنبوب الصدمة لتكوين الحجاب الحاجز الفردي أو كل من قسم حجم السائق وقسم المؤخرة المزدوج لأنبوب الصدمة لتكوين الحجاب الحاجز المزدوج.
ملاحظه: بالنسبة لتكوين الحجاب الحاجز الفردي ، سيعتمد ضغط الانفجار فقط على مادة الحجاب الحاجز وسمكها ، وسوف يتمزق الحجاب الحاجز تلقائيا بمجرد الوصول إلى ضغط انفجار المادة. بالنسبة لتكوين الحجاب الحاجز المزدوج ، سيعتمد ضغط الانفجار أيضا على فرق ضغط الغاز في كل من السائق وغرف المقعد المزدوجة ، ولكي تنفجر الأغشية بطريقة خاضعة للرقابة ، يتم فتح صمام الأمان المقعدي المزدوج يدويا بمجرد الوصول إلى الضغوط المستهدفة.
- بمجرد تمزق الحجاب الحاجز (ينتج عنه ضوضاء عالية) ، أغلق تدفق الهواء المضغوط بسرعة باستخدام مقبض التدفق وافتح صمام الملف اللولبي.
ملاحظه: يمكن تعديل الحجم الإجمالي لقسم السائق عن طريق إدخال مقاطع التقطيع ، مما يسمح بالحصول على نطاق أوسع من الضغط الزائد لموجة الصدمة وفترات الذروة. يجب أن يكون المزيج المثالي من معلمات موجة الصدمة كافيا للتسبب في إصابة الأنسجة ولكن ليس مرتفعا لدرجة أنه يتسبب في إدخال زراعة الأنسجة أو تشويه الكيس المعقم أو تمزقه.
- قم بتعريض كل كيس معقم بزراعة الأنسجة ، وأدخله في موجة أنبوب صدمة واحدة ، وأعده على الفور إلى الصندوق المنظم حراريا قبل أخذ كيس معقم جديد من الصندوق وتثبيته على إطار الحامل. تأكد من تنفيذ الخطوات 4.10-4.14 بأكبر قدر ممكن من السلاسة والسرعة (في غضون بضع دقائق) لمنع الوسط التجريبي من التبريد ، حيث قد تتداخل درجات الحرارة التي تقل عن 37 درجة مئوية مع تطور الإصابة.
- بمجرد أن تتعرض جميع إدخالات زراعة الأنسجة لموجة صدمة (أو بروتوكول زائف) ، أعدها إلى الصفيحة الأصلية المكونة من 6 آبار والبئر الخاصة بها (داخل غطاء مزرعة الأنسجة ذات التدفق الرقائقي) والعودة إلى الحاضنة.
- احتفظ بلوحة 6 آبار في الحاضنة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في الهواء عند 37 درجة مئوية حتى مزيد من التصوير.
- قم بتضمين عناصر تحكم زائفة لكل تجربة والتعرض لموجة الصدمة الشريحة.
ملاحظه: يتم التعامل مع شرائح الوشم بشكل مماثل للشرائح المعرضة لموجة صدمة (مختومة في أكياس معقمة بوسط تجريبي ، ويتم نقلها إلى مختبر أنبوب الصدمة في نفس الصندوق المنظم حراريا ، ويتم تعليقها على الإطار المعدني لفترة زمنية مكافئة) ، ولكن لا يتم إطلاق أنبوب الصدمة.
