إنشاء نموذج مرض الزهايمر في دماغ أسماك الزرد من خلال حقن الببتيد النشواني

الملخص

Bhattarai, P., et al. نمذجة سمية الأميلويد β42 والتنكس العصبي في دماغ أسماك الزرد البالغة. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو إجراء حقن ببتيدات الأميلويد أحادية اللون في الدماغ الأمامي لسمك الزرد البالغ لتوليد سمية الأميلويد ، مما يحاكي الضرر العصبي الذي يظهر في مرض الزهايمر

البروتوكول

فئة

1. تحضير الببتيد Aβ42

1. قم بتصنيع الببتيدات (انظر الجدول 1) باستخدام كيمياء 9-فلورينيل ميثوكسي كربونيل (Fmoc) القياسية مع 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1،1،3،3-tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) ككاشف اقتران على مركب الببتيد الآلي ذو الطور الصلب. كان حجم التوليف 100 ميكرومول.
2. قم بتحميل مركب الببتيد الآلي ب 500 مجم من الراتنج المحمي من Fmoc كمرحلة صلبة (سعة تحميل 0.2 مليمول / جم). قم بتحميل الأحماض الأمينية الذائبة المحمية ب Fmoc بتركيز 0.5 متر في الحجم المطلوب وكما هو محسوب للمركب المعني.
   ملاحظه: يتم إجراء الحسابات لتمكين اقتران كل حمض أميني محمي ب Fmoc مرتين مع زيادة 5 أضعاف كل كتلة بناء إلى الراتنج.
3. قم بإذابة الكواشف المطلوبة لتخليق الببتيد في ثنائي ميثيل فورماميد (DMF). على سبيل المثال ، قم بإعداد المنشط ، HBTU ، بتركيز 0.48 M ، و 45٪ v / v N-Methylmorpholine (NMM) (القاعدة) ، و 5٪ v / v أنهيدريد الخليك (خليط السد) لتغطية المجموعات الأمينية غير المتفاعلة.
4. افصل جميع الببتيدات من الراتنج عن طريق خلط الدعامة الصلبة باستمرار باستخدام محرض في خليط انقسام طازج يتكون من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA): ثلاثي إيزوبروبيل سيلان (TIS): ماء: ديثيوثريتول (DTT) عند 90 (حجم / حجم): 5 (حجم / حجم): 2.5 (حجم / حجم): 2.5 (م / حجم) لمدة 4 ساعات. استخدم 10 مل لمقياس التوليف البالغ 100 ميكرومول.
5. قم بترسيب المنتج المشقوق عن طريق إضافة خليط الانقسام إلى 100 مل من ثنائي إيثيل الأثير المثلج. تمر عبر وحدة ترشيح تحتوي على مرشح بولي تترافلورو إيثيلين (PTFE) بحجم مسام 0.45 ميكرومتر واغسله ب 20 مل من ثنائي إيثيل الأثير المثلج.
6. اجمع الببتيد المصفى من ورق الترشيح وقم بإذابة 100 مجم من الببتيد المترسب في 5 مل من الماء المقطر منزوع الأيونات: الأسيتونيتريل عند 1: 1.
7. قم بالتنقية عن طريق كروماتوغرافيا السائل عالي الضغط ذات الطور العكسي (HPLC) على HPLC شبه تحضيري مزود بعمود من البوليسترين ديفينيل بنزين مسامي بحجم حبة 10 ميكرومتر.
   1. قم بتسخين العمود مسبقا واحتفظ به عند 50 درجة مئوية باستخدام جهاز تسخين العمود. اجمع جميع الكسور الرئيسية باستخدام مجمع الكسور الآلي عن طريق تطبيق تدرج من 5٪ إلى 100٪ مذيب B على مدار 25 دقيقة عند 4 مل / دقيقة
      ملاحظه: المذيب A هو 0.1٪ TFA في الماء ، والمذيب B هو 0.1٪ TFA في الأسيتونيتريل.
   2. راقب الكروماتوجرام عند 220 نانومتر ، واجمع القمم المناسبة ، وقم بالتحليل باستخدام قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافيا السائل (LC-MS).
8. تأكد من النقاء عن طريق كروماتوغرافيا السائل فائق الضغط التحليلية ذات الطور العكسي (UPLC) عند 220 نانومتر ، والمراقبة باستخدام كاشف الأشعة فوق البنفسجية (UV) أثناء تمرير العينة عبر عمود C18 تحليلي (حجم الخرزة 1.7 ميكرومتر). تأكيد منتج الببتيد عن طريق قياس الطيف الكتلي.
   ملاحظه: يقترن UPLC بقياس الطيف الكتلي للتأين بالرش الكهربائي (ESI-MS) وكاشف رباعي الأقطاب الترادفي.
9. قم بتجميد الكسور الصحيحة من الببتيد المطلوب في قارورة مستديرة القاع عن طريق تطبيق فراغ 0.052 ملي بار على مسحوق رقيق. قم بإقران مضخة التفريغ بوحدة تجميد يتم الاحتفاظ بها عند -78 درجة مئوية. قم بتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
10. استخدم الببتيد المجفف بالتجميد لتحضير محلول مخزون بحجم 1 ملي مولار في خليط من الأسيتونيتريل ، DMF ، والماء التحليلي عند 1: 1: 1 للتجارب. يمكن تخزين هذا المحلول لمدة 6 أشهر على الأقل ، حيث لا تتجمع الببتيدات فيه.

< p class = "jove_title" >2. تحضير خليط الحقن

1. تحضير محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد كلوريد ، 10 ملي Na₂HPO₄ ، 2 ملي KH₂PO₄ ، درجة الحموضة 7.4) لتخفيف الببتيدات المجففة بالتجميد.
2. قم بإذابة الببتيد إلى تركيز نهائي قدره 20 ميكرومتر في PBS. تحضير هذا الحل طازجا. تخلط جيدا وتخزن على الثلج حتى الحقن. لا تتجاوز 30 دقيقة لمنع التراكم في المحلول.

< ص الفئة = "jove_title" >3. التخدير

1. تحضير محلول مخزون التخدير ، 0.1٪ إيثيل إم أمينوبنزوات ميثان سولفونات (MESAB) ، في مياه السمك العادية من نظام الدوران. تحضير محلول التخدير إلى تركيز نهائي قدره 0.0025٪ (حجم / حجم).
2. قم بإزالة العدد المطلوب من الأسماك من أحواض الوقوض في حاوية نقل بها 5 لترات من ماء النظام.
3. املأ نصف طبق بتري بلاستيكي (90 مم) بمخدر سعة 40 مل. استخدم هذا الطبق للحقن.
4. احتضان السمكة في التخدير حتى تتوقف الحركة الجراحية.

فئة < p = "jove_title" >4. الحقن المجهري الدماغي البطيني

1. تحضير جهاز الحقن
   1. قم بإعداد الشعيرات الدموية لحقن الزجاج باستخدام مجتذب إبرة مع المعلمات التالية: دورة التسخين ، 537 ؛ دورة السحب ، 250 ؛ السرعة ، 1.5 ثانية ؛ الوقت ، 80 مللي ثانية.
   2. ارفع إعداد الضغط على مصدر الضغط إلى 25 رطل لكل بوصة مربعة.
   3. اضبط معلمات الحاقن الدقيق على 20 رطل لكل بوصة مربعة للتعليق و 10 رطل لكل بوصة مربعة للإخراج ، و 2.5 للفترة ، و 100 مللي ثانية للبوابة.
   4. قم بتحميل الشعيرات الدموية الزجاجية بمحلول الحقن. أدخل الشعيرات الدموية الزجاجية في حامل الحقن المجهري. اضبط زاوية الحقن على 45 درجة.
2. ضع سمكة واحدة في طبق بتري جديد مليء بمحلول التخدير.
3. امسك السمكة بالملقط ووجهها للحقن.
4. قم بإنشاء شق باستخدام طرف إبرة 30 G في الجمجمة فوق التكتوم البصري حيث تلتقي الصفيحتان الجانبيتان. لا تدخل الطرف في أنسجة المخ ، فقد يتسبب ذلك في حدوث نزيف وتلف.
5. أدخل الشعيرات الدموية الزجاجية في الشق.
   1. استخدم طرف الإبرة فقط ولا تخترق أكثر من 1 مم من خلال الجمجمة. استمر في إمساك السمكة وأدخل طرف الشعيرات الدموية الزجاجية من خلال موقع الشق.
   2. قم بتوجيه طرف الشعيرات الدموية الزجاجية باتجاه telencephalon بزاوية 45 درجة. حقن 1 ميكرولتر من المحلول. يتشتت السائل مباشرة بعد الحقن.

5. الانتعاش

1. ضع السمكة مرة أخرى في وعاء النقل حتى يتعافى. قم بتوصيل الحاوية بمياه السمك المتداولة بانتظام لضمان الجودة المثلى للمياه.
   ملاحظه: يجب أن يستغرق التعافي عادة 1 دقيقة. إذا استغرق الأمر وقتا أطول ، فيجب حفظ الأسماك في التخدير لفترة أقصر (يحتاج المجرب إلى تحسين ذلك).

النتائج

< p class = "jove_content" > الجدول 1: تسلسلات الببتيد Aβ42 و TR-Aβ42.

الببتيد تسلسل الببتيد ميغاواط (جم / مول) أ 42 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA 4514.1 TR-Aβ42 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الأحماض الأمينية المحمية من FMOC IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz ، ألمانيا) الأحماض الأمينية القائمة على Fmoc لتخليق الببتيد في الطور الصلب (SPPS) N ، N ، N ′ ، N ′ - TETRAMETHYL-O- (1H-benzotriazol-1-yl) سداسي فلورو فوسفات اليورونيوم (HBTU) IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz ، ألمانيا) RL-1030 المنشط أوكسيما IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz ، ألمانيا) RL-1180 قامع Racemization N ، N-Diisopropylethylamine IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz ، ألمانيا) سول -003 قاعدة ثنائي ميثيل فورماميد IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz ، ألمانيا) سول -004 المذيبات ن-ميثيل مورفولين Thermo Fisher (Kandel) GmbH ، ألمانيا أ 12158 قاعدة 1-هيدروكسي بنزوتريازول هيدرات (HOBT) شركة سيجما ألدريتش ذ.م.م (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) 157260 ألدريتش المنشط بيبيريدين MERCK KGaA (دارمشتات ، ألمانيا) 822299 كاشف إزالة الحماية من Fmoc ثنائي كلورو ميثان (DCM) MERCK KGaA (دارمشتات ، ألمانيا) هاتف: 106050 المذيبات حمض الفورميك (FA) MERCK KGaA (دارمشتات ، ألمانيا) 100264 مكون المخزن المؤقت ل HPLC حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) MERCK KGaA (دارمشتات ، ألمانيا) 808260 كاشف خليط Clevage ثلاثي الأيزوبروبيل سيلان (TIS) MERCK KGaA (دارمشتات ، ألمانيا) 233781 ألدريتش كاشف خليط Clevage الأسيتونيتريل (ل UPLC / LCMS) سيجما ألدريتش لابورشيميكيالين جي إم بي إتش 34967-1 لتر المذيبات الأسيتونيتريل (ل HPLC) VWR الدولية المحدودة ، إنجلترا 83639.32 المذيبات ثنائي إيثيل إيثر VWR الدولية المحدودة ، إنجلترا هاتف: 23811.326 مذيب لترسيب الببتيد ديثيوتريتول (DTT) VWR الدولية المحدودة ، إنجلترا 0281-25 جرام كاشف خليط Clevage TentaGel S RAM Fmoc حلبة التزلج راتنج أميد Rapp Polymere GmbH (توبينغن ، ألمانيا) S30023 المرحلة الصلبة ل SPPS تخليق الببتيد 5 مل محاقن مع مرشحات مضمنة Intavis AG (كولونيا ، ألمانيا) 34.274 دولار أنبوب التفاعل ل SPPS وللتركيب من المرحلة الصلبة مرشح بولي تترافلورو إيثيلين (PTFE) سارتوريوس ستيديم (أوبان، فرنسا) 11806-50-ن تصفية الببتيدات المترسبة فلتر حقنة البولي فينيل فلوريد (PVDF) Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe كيه سي 78.1 التصفية المسبقة ل HPLC مركب الببتيد إنتافيس، كولونيا، ألمانيا ريسبيب إس إل مركب الببتيد الآلي ذو الطور الصلب تحالف المياه HPLC ووترز ، ميلفورد ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية المياه 2998 ، المياه e2695 كروماتوغرافيا السائل ذات الضغط العالي شبه التحضيري (HPLC) بوليمر إكس ، حجم حبة 10 ميكرومتر ، 250 × 10 مم Phenomenex المحدودة ألمانيا 00 ز - 4328 - ن 0 البوليسترين المسامي ديفينيل بنزين HPLC العمود Milli-Q Advantage A10 ، مع مرشح Milli-Q شركة EMD Millipore ، بيليريكا ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية LCPAK0001 نظام تنقية المياه وحدة الترشيح سارتوريوس ستيديم (أوبان، فرنسا) 16307 وحدة الترشيح لهطول الأمطار الببتيد UPLC Aquity مع كاشف الأشعة فوق البنفسجية ووترز ، ميلفورد ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية M09UPA 664 م الطور العكسي التحليلي الفائق HPLC ل LC-MS ACQUITY UPLC BEH C18 ، حجم حبة 1.7 ميكرومتر ، 50x2.1 مم ووترز ، ميلفورد ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية 186002350 العمود التحليلي C18 كاشف ACQUITY TQ ووترز ، ميلفورد ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية QBB908 قياس الطيف الكتلي للتأين بالرش الكهربائي (ESI-MS) كريست ألفا 2-4 LD بلس + فراغ RZ6 Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH ، ألمانيا 16706 ، 101542 آلة تجفيد المياه مع مضخة الفراغ قارئ لوحة نموذجي بيكمان كولتر MESAB (إيثيل إم أمينوبنزوات ميثان سولفونات) سيجما ألدريتش أ 5040 أطباق بتري سارستيدت 821.472 دولار محلول ملحي مخزن بالفوسفات لايف تكنولوجيز ، جيبكو 10010-056 إِبْرَة بيكتون ديكنسون 305178 تشريح المجهر أوليمبوس ، لايكا ، زايس يختلف باختلاف الشركة المصنعة ملاقط دومون أدوات الدقة العالمية 501985 Gillies تشريح ملقط أدوات الدقة العالمية 501265 الشعيرات الدموية لحقن الزجاج أدوات الدقة العالمية TWF10 بيكو فوهة أدوات الدقة العالمية 5430-12 مضخة بيكو الهوائية أدوات الدقة العالمية نظام PV820 حلقة الإضاءة; دليل ضوء الحلقة باركلاند العلمية ILL-RLG