التسريب التجسيمي المباشر للدماغ لبروتينات أميلويد بيتا لنموذج مرض الزهايمر

الملخص

المصدر: Jean، Y. Y. et al. ، التسريب التجسيمي لأوليغوميريك أميلويد بيتا في الحصين الفأر. J. Vis. إكسب. (2015)

يوضح هذا الفيديو التسريب التجسيمي الدقيق لبيتا الأميلويد في التلفيف المسنن لإنشاء نموذج فأر لمرض الزهايمر. يؤدي التحديد الدقيق للإحداثيات والتسليم المتحكم فيه لبروتينات بيتا النشوانية إلى تدهور الخلايا العصبية ، وتعطيل معالجة الذاكرة والمساهمة في تطور مرض الزهايمر.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الأدوات والحلول الجراحية للجراحة

1. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ.
2. تحضير 70٪ من الإيثانول عن طريق تخفيف 200 من الإيثانول المطلق بالماء المقطر منزوع الأيونات من الدرجة الجزيئية المعقمة.
3. قم بتوصيل إبرة 29 جم بحقنة هاميلتون. قم بتنظيف الجزء الداخلي من حقنة هاميلتون والإبرة عن طريق سحب وإخراج الماء النقي النانوي بشكل متكرر لمدة 1 دقيقة. كرر هذا الإجراء مع 70٪ إيثانول.
   1. قم بإزالة المكبس والإبرة من حقنة هاميلتون. تجفيف الأجزاء بالهواء في غطاء التدفق الصفحي O / N.
   2. تشعيع الإبرة والحقنة بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
4. تحضير محلول ملحي عن طريق إذابة كلوريد الصوديوم (NaCl) في ماء جزيئي إلى تركيز نهائي من الوزن إلى الحجم بنسبة 0.9٪. عقم المحلول عن طريق تصفيته من خلال مرشح مسام 0.2 ميكرومتر.

< p class = "jove_title" >2. تحضير أوليغوميريك أميلويد بيتا (Aβ1-42)

1. أحادي وتعليق الإنسان المؤتلف Aβ1-42 في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى 5 ملي مولار تماما كما هو موضح في منشور Fa 'وغيرها.
2. خفف 5 ملي مولار Aβ1-42 بمحلول ملحي معقم (1x) مخزن بالفوسفات (PBS) إلى 100 ميكرومتر في اليوم السابق للجراحة.
3. امزج المحلول جيدا عن طريق التخلي.
4. احتضان محلول Aβ1-42 لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية < br / > ملاحظه: يجب تحضير حلول التحكم مثل تخفيف DMSO في PBS أو الببتيد Aβ1-42 المخفوق / العكسي بنفس طريقة Aβ1-42.

< p class = "jove_title" >3. تحديد إحداثيات الحقن

1. استخدم أطلس دماغ الفأر البالغ لتحديد الإحداثيات الأمامية الخلفية (AP) والإنسية الجانبية (ML) والظهرية البطنية (DV) الدقيقة لمنطقة الدماغ ذات الاهتمام.
   ملاحظه: لتوضيح هذه التقنية ، اخترنا التلفيف المسنن للحصين كهدف مع الإحداثيات التالية من البرجما: AP ، -2.00 مم ؛ مل ، ±1.3 مم ؛ DV ، -2.2 مم. تشير العلامة السالبة التي تسبق قيمة نقطة الوصول إلى أنها متأخرة بمقدار 2.00 مم من البريغما. تشير علامة ± التي تسبق قيمة ML إلى الاتجاه الأيسر والأيمن من المركز. أخيرا ، تشير العلامة السلبية التي تسبق DV إلى أنها تتحرك بطنيا من سطح الدماغ.

4. إعداد الإطار التجسيمي

1. ارتد قناعا جراحيا للوجه ومعطف مختبر نظيف وقفازات جراحية معقمة.
2. امسح الأداة التجسيمية ومحول الماوس بنسبة 70٪ من الإيثانول.
3. ضع ستارة جراحية معقمة على المنضدة.
4. ضع الأداة التجسيمية مع محول الماوس أعلى الستارة الجراحية المعقمة.
5. امسح وسادة تسخين الماوس بنسبة 70٪ من الإيثانول. ضع وسادة التسخين فوق سرير الإطار التجسيمي. استخدم شريط وضع العلامات المختبري للأغراض العامة للصق وسادة التسخين فوق سرير محول الماوس.
   1. قم بتوصيل وسادة التسخين بمضخة إعادة تدوير الماء الدافئ وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة.
   2. قم بتشغيل مضخة إعادة تدوير الماء الدافئ ، واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية ، وانتظر حتى تصل إلى درجة الحرارة هذه.
6. قم بلصق حقنة هاميلتون سعة 50 ميكرولتر بإبرة 29 جيجا على الإطار التجسيمي عن طريق تثبيتها على عمود الحقن الرأسي الآلي وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة.
7. قم بتشغيل معقم الخرز وانتظر حتى يصل إلى درجة الحرارة المحددة مسبقا للشركة المصنعة.
   ملاحظه: يستخدم هذا لتعقيم أدوات الفولاذ المقاوم للصدأ بين. يستغرق الأمر 20 ثانية من الاتصال بالخرز للتعقيم.
8. قم بتشغيل اللوح الساخن ، واضبطه على 42 درجة مئوية ، وضع قفصا فارغا نظيفا فوقه.
9. بينما يتم تثبيت حقنة هاميلتون على الإطار التجسيمي ، استخدم الحاقن التجسيمي الآلي لوضع الحل Aβ1-42.
   ملاحظه: ارسم أكثر من 4 ميكرولتر من المحلول في المحقنة ثم استخدم الحاقن التجسيمي لضبط حجم الحقن. قم بتشغيل الحاقن وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

< ص الفئة = "jove_title" >5. تحضير

1. حدد وزن الماوس باستخدام مقياس الوزن.
2. تخدير الفأر بكوكتيل الكيتامين / الزيلازين بمعدل 100 مجم / كجم من الكيتامين و 10 مجم / كجم زيلازين عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP). راقب عمق التخدير عن طريق فقدان منعكس قرصة إصبع القدم.
3. بعد تخدير الفأر ، خذ ماكينة قص الشعر واحلق رأسها لكشف الجلد فوق الجمجمة.
4. ضع الماوس أعلى وسادة التدفئة أعلى السرير التجسيمي.
5. استخدم الملعقة لفتح الفم ووضع الأسنان القاطعة داخل واقي الأسنان. ثبت قطعة الأنف على وجه الماوس. قم بتثبيته برفق وليس ضيقا جدا.
6. ضع العارضة الثنائية للأذن في الصماخ السمعي لتأمين الرأس. حرك كل عارضة للداخل حتى تصطدم بالجمجمة ، ثم أدر المسمار لقفله.
   1. للتأكد من أن الرأس مؤمن ، استخدم إصبعك السبابة للضغط برفق على الرأس. إذا تم تأمين الرأس بشكل صحيح ، فلن ينفجر أو يتحرك عند الضغط عليه.
7. ضعي قطرة من كريم العين أو قطرة عين على العينين للحفاظ على رطوبتهما. تأكد من رطوبة العينين طوال العملية الجراحية.
8. لتطهير موقع الجراحة ، استخدم مسحات قطنية معقمة لتطبيق محلول البيتادين على الجلد فوق الجمجمة ، متبوعا بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بإجراء تنظيف البيتادين المتناوب و 70٪ الإيثانول مرتين أخريين.

< p class = "jove_title" >6. الجراحة والتسريب

1. استخدم مشرطا لعمل شق 2-3 مم في خط الوسط لفروة الرأس ، ثم استخدم مقصا مستقيما دقيقا لتمديد خط الشق إلى 1.0-1.5 سم لكشف الخيط السهمي ، والبريجما ، واللامدا للجمجمة ، وهي معالم تستند إليها الإحداثيات التجسيمية. استخدم المشابك الدقيقة لإبعاد الجلد.
   ملاحظه: تم شرح مواقف بريجما ولاجدا في أطلس دماغ الفأر "دماغ الفأر في الإحداثيات التجسيمية".
2. خذ قطعة قطن وانقعها في محلول ملحي معقم واستخدمها لتنظيف الجمجمة. ثم استخدم قطعة قطن جافة نظيفة لتجفيف الجمجمة.
3. استخدم قلما معقما دقيقا لتمييز نقطة على البريجما. استخدم أداة المعالجة الدقيقة التجسيمية لوضع حقنة هاميلتون بحيث يلامس طرف الإبرة النقطة الموجودة على البريجما.
   1. سجل إحداثيات DV.
   2. للتحقق مما إذا كان محور AP للجمجمة مستويا ، حرك حقنة هاميلتون للخلف بحيث يلامس طرف الإبرة نقطة لامدا.
   3. سجل موضع DV. تأكد من أن إحداثيات DV ل bregma و lambda في حدود 0.5 مم
      ملاحظه: الهدف هو تقليل فرق DV بين بريجما ولامدا.
4. استخدم المعالج الدقيق لإعادة طرف إبرة حقنة هاميلتون إلى نقطة بريجما.
5. سجل موضع نقطة الوصول البدء.
6. احسب موضع نقطة الوصول النهائية بطرح 2.00 مم من إحداثيات نقطة الوصول البادئة.
7. استخدم المعالج الدقيق لإعادة وضع إبرة حقنة هاميلتون إلى إحداثيات نقطة الوصول النهائية.
8. سجل إحداثيات التعلم الآلي الحالية.
9. احسب إحداثيات ML الطرفية اليمنى واليسرى عن طريق إضافة أو طرح 1.3 مم من إحداثيات ML البدء.
10. استخدم المعالج الدقيق لنقل إبرة حقنة هاميلتون إلى إحداثيات ML النهائية.
    1. المس طرف الإبرة على سطح الجمجمة على كل من إحداثيات ML الطرفية وسجل إحداثيات DV وتأكد من أن القيم في حدود 0.5 مم.
       ملاحظة: الهدف هو تقليل فرق DV بين إحداثيي ML النهائيتين.
    2. أثناء إحداثيات النهاية ، اسحب الإبرة لأعلى 0.5-1 سم فوق الجمجمة. خذ قلما معقما دقيقا لتمييز نقطة على سطح الجمجمة. كرر هذه الخطوة للجانب المقابل للجمجمة.
11. تأرجح حقنة هاميلتون بعيدا عن الطريق.
12. قم بتوصيل رأس الحفر 0.8 مم بالمثقاب. خذ المثقاب بكلتا يديك ، ضع المرفقين على سطح الطاولة لتحقيق الاستقرار ، وضع رأس الحفر أعلى قليلا من نقطة الشاربي على إحداثيات ML اليسرى أو اليمنى. قم بتنشيط المثقاب ، وقم بخفض طرف الحفر على سطح الجمجمة لإدخال ثقب في الجمجمة. كرر هذه الخطوة للجانب المقابل.
    ملاحظه: قد يحدث بعض النزيف من الثقوب التي تم إدخالها حديثا. إذا كان هناك نزيف ، فاستخدم قطعة قطن نظيفة وجافة لتربيت الدم.
13. حرك حقنة هاميلتون مرة أخرى إلى موضعها فوق أي من فتحات ML التي تم إدخالها حديثا. اخفض إبرة هاميلتون بعد الجمجمة. في هذه المرحلة ، احرص على عدم ثقب الدماغ. للتأكد من أن الإبرة قد اجتازت الجمجمة، خذ إصبع السبابة وادفع الإبرة برفق على الجمجمة للتأكد من أن الإبرة لا تخرج من الفتحة.
14. سجل إحداثيات DV البدء.
15. احسب إحداثيات DV النهائية بطرح 2.2 مم من إحداثيات DV البادئة.
16. اخفض الإبرة لأسفل إلى إحداثيات DV النهائية.
17. قم بتنشيط مضخة الحاقن التجسيمية لضخ 4 ميكرولتر من Aβ1-42 في التلفيف المسنن بمعدل 0.5 ميكرولتر / دقيقة.
18. عند اكتمال التسريب ، اترك الإبرة في مكانها لمدة 1 دقيقة إضافية لتقليل التدفق العكسي للمحلول خارج موقع الحقن.
19. حرك الإبرة إلى الجانب الآخر من الدماغ وكرر الخطوات 6.13-6.18.

< p class = "jove_title" >7. إزالة ورعاية ما بعد الجراحة

1. قم بفك قضبان الأذن وواقي الوجه / الأنف. قم بإزالة الماوس من الجهاز.
2. استخدم ملقطا قياسيا للطالب لسحب فروة الرأس ثم إغلاق الجرح بخياطة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الكيتامين حمض الهيدروكلوريك (100 مجم / مل) هنري شاين الطبية 1049007 100 مجم كيتامين لكل 1 كجم من زيلازين (20 مجم / مل) هنري شاين الطبية غير متوفر 10 ملغ زيلازين لكل 1 كجم من أ 1-42 ديفيد تيبلو / جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس غير متوفر 100 ميكرومتر ؛ تم استخدام هذا الأميلويد في الورقة أ 1-42 باقيم [ه-1368] يمكن استخدامه بدلا من الأميلويد من مختبر Teplow أ 1-42 الببتيد الأمريكي 62-0-80 ب يمكن استخدامه بدلا من الأميلويد من مختبر Teplow مخفوق Aβ1-42 الببتيد الأمريكي 62-0-46 ب يمكن استخدامه كببتيد تحكم لمقارنة Aβ1-42 GenTeal زيوت التشحيم جل العين نوفارتيس غير متوفر للحفاظ على رطوبة عيون الفأر أثناء الجراحة ؛ يمكن العثور عليها في متاجر الصيدليات المحلية Refresh Optive Lubricant Eye قطرات العين اليرجان غير متوفر للحفاظ على رطوبة عيون الفأر أثناء الجراحة ؛ يمكن العثور عليها في متاجر الصيدليات المحلية ؛ يمكن استخدامها بدلا من GenTeal البيتادين ستويلتينج 50998 للتعقيم والتطهير ملعقة مستديرة / مدببة VWR 82027-490 لفتح فم مشابك بولدوج Serrefines (خافت الفك. 9X1.6mm ؛ الطول 28 مم) أدوات العلوم الدقيقة 18050-28 اختياري; للحفاظ على جلد فروة الرأس بعيدا أثناء الحقن مقص ناعم مستقيم (حافة القطع 25 مم ؛ الطول 11.5 سم) أدوات العلوم الدقيقة 14060-11 لقطع فروة الرأس # 3 مقبض مشرط أدوات العلوم الدقيقة 10003-12 # 11 شفرة جراحية أدوات العلوم الدقيقة 10011-00 لعمل شق فروة الرأس ملقط نمط الطالب القياسي (طرف يخفت 2.5 × 1.5 مم ؛ الطول 11.5 سم) أدوات العلوم الدقيقة 91100-12 لإبقاء فروة الرأس مغلقة أثناء الخياطة طقم كومبو الانتهازي كينت العلمية CL9990-1201 لحلاقة الشعر T / مضخة إعادة تدوير الماء الدافئ كينت العلمية تي بي -700 لتدفئة أثناء الجراحة وسادة تعدين قابلة لإعادة الاستخدام (5 × 10 بوصات) كينت العلمية TPZ-0510FEA لتثبيته على جهاز تدوير الماء الدافئ T / Pump لتدفئة أثناء الجراحة مثقاب صغير لاسلكي ستويلتينج 58610 استخدم نتوءات فولاذية 0.8 مم لحفر ثقوب في الجمجمة أداة تجسيمية قياسية للمختبر مع محول الفأر والفئران لحديثي الولادة ستويلتينج 51615 [م] فقط لأداة Stereotaxic الماوس ستويلتينج 51730 يمكن استخدام هذا بدلا من Stoelting Cat. # 51615 حاقن التجسيمي الجوهري ستويلتينج 53311 معقم حبة الزجاج الجاف ستويلتينج 50287 لتعقيم أدوات الفولاذ المقاوم للصدأ ستارة جراحية معقمة (18 × 26 بوصة) ستويلتينج 50981 حقنة هاميلتون 50 مل، موديل 705 RN SYR، NDL شركة هاميلتون 7637-01 لحقن الدماغ ؛ استخدم محاقن مختلفة لمحاليل مختلفة 29 إبرة قياس ، محور صغير RN NDL شركة هاميلتون 7803-06 لتثبيته على حقنة هاميلتون لحقن الدماغ 1 مل محاقن BD Tuberculin VWR BD309659 لإدارة التخدير والمحلول الملحي إبرة قياس 30 (0.5 بوصة) VWR BD305106 لإدارة التخدير والمحلول الملحي مقياس سلسلة CS الإلكتروني المحمول (Ohaus) VWR 65500-202 لوزن لتحديد جرعة التخدير لوح تسخين (يعفت الطبق العلوي 7.25 × 7.25 بوصة) VWR 47751-148 لتدفئة بعد الجراحة خياطة الحرير سوفليك C-1 قطع 3/8 ، 12 مم كوفيديان S1173 لإغلاق الجرح لاصق الأنسجة Vetbond (3M) سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية SC-361931 اختياري: للمساعدة في إغلاق الجرح. استخدميه مع خياطة. أدوات تطبيق معقمة ذات رؤوس خشبية من القطن فيشر علمي 22-029-488 لتنظيف وتجفيف الجرح الجراحي شرائح مجهر Fisherbrand Superfrost Plus فيشر ساينتيك 12-550-15 لجمع أقسام الدماغ VWR غطاء زجاجي مايكرو 24 × 50 مم VWR 48393241 لتركيب شرائح المجهر فلتر حقنة نالجينز الحراري العلمي 0.2 ميكرومتر فيشر ساينتيك 194-2520 لتعقيم المحلول الملحي علامات بشرة معقمة مزدوجة الطرف من فيسكوت ميديكال ميدلاين VIS1422SRL91 لوضع علامات على الإحداثيات على الجمجمة