Method Article

دراسة تراكم ألفا سينوكلين في الخلايا العصبية الدوبامين الجنينية الأولية للفأر

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Er، S. et al. ، دراسة تراكم α-synnuclein المستحث عن الألياف المكونة مسبقا في الخلايا العصبية الدوبامين في منتصف الدماغ الجنيني الأولي للفأر.J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو عملية تحديد تراكم ألفا سينوكلين في الخلايا العصبية الدوبامين للفأر الجنيني المعالجة مسبقا بألياف ألفا سينوكلين المشكلة مسبقا. يحدد خطوات إصلاح وتلطيخ وقياس الخلايا العصبية الدوبامين التي تحتوي على مجاميع ألفا سينوكلين باستخدام التألق المناعي.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

< p class = "jove_title" >1. التحضير

  1. تحضير وسط الخلايا العصبية الدوبامين (DPM) مع 0.46٪ D-glucose ، 1٪ L-glutamine ، 1٪ N2 ، 0.2٪ بريموسين ، مكتمل ب DMEM / F12. قم بتصفية DPM بعد خلط المكونات. قم بتخزين DPM عند 4 درجات مئوية وقم بتسخين كل كمية مرة واحدة فقط.
    ملاحظه: يجب ألا يحتوي DPM على عامل التغذية العصبية المشتق من الخلايا الدبقية (GDNF) ، لأنه سيقلل من تراكم α سينوكلين في الخلايا العصبية الدوبامين.
  2. قم بإعداد ماصات زجاجية مصنوعة من السيليكون شديدة الكارهة للماء، وبالتالي تقليل الالتصاق بالسطح وفقدان الخلايا أثناء المعالجة الأولية للخلايا العصبية الجنينية.
    1. أضف 10 مل من سائل السيليكون إلى 1 لتر من الماء المقطر واخلطه عن طريق التقليب في وعاء سعة 2 لتر. اترك الماصات الزجاجية مغمورة في محلول السيليكون لمدة 15 دقيقة.
    2. اشطف الماصات 3-5 مرات بالماء المقطر. جفف الماصات طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (RT) أو لمدة 1-2 ساعة عند 100-120 درجة مئوية ، وقم بتسخين مساحة معقمة لتسريع عملية التجفيف.
    3. قم بتعقيم الماصات عن طريق التعقيم القياسي في كيس الأوتوكلاف محكم الغلق.
  3. قم بإعداد 96 لوحة بئر مطلية ب 96 بئر مع قيعان شفافة عن طريق إضافة 60 ميكرولتر من محلول PO في الآبار الوسطى للوحة البئر 96 لاستخدامها في بذر الخلايا العصبية ، مع ترك صف / عمود واحد على الأقل من الآبار عند حواف اللوحة لتجنب تأثيرات الحافة. احتفظ باللوحة المطلية طوال الليل عند 4 درجات مئوية أو 4 ساعات عند RT.
  4. قبل طلاء الخلايا ، قم بشفط الفم تماما واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من محلول ملحي عازل للفوسفات 1x (PBS). قم بشفط 1x PBS من الآبار واحتفظ بغطاء اللوحة مفتوحا للتجفيف الكامل.
    ملاحظه: من الممكن جمع أمر الشراء المستخدم وتصفيته لإعادة استخدامه. يمكن تكرار ذلك مرتين لنفس محلول أمر الشراء.
  5. أضف 50 ميكرولتر من DPM إلى الآبار المطلية مسبقا. قم بشفط DPM من الآبار بطرف بلاستيكي 100 ميكرولتر وخدش قاع البئر في نفس الوقت بحركات دائرية لإزالة الطلاء في محيط كل بئر. ستبقى جزيرة مطلية ب PO في منتصف البئر.
  6. تحت غطاء رقائقي ، أضف 10 ميكرولتر من DPM إلى منتصف كل جزيرة مطلية لإنشاء جزر صغيرة.
    ملاحظه: يمكن الاحتفاظ بلوحة ذات جزر صغيرة مغطاة ب DPM تحت غطاء التدفق الرقائقي لمدة 1-2 ساعة أثناء عزل الخلايا.
فئة

2. عزل أرضية الدماغ المتوسط البطني عن أجنة الفأر E13.5

ملاحظة: راجع الشكل 1 لخطوات تشريح قاع منتصف الدماغ.

  1. قبل التشريح ، املأ طبق بتري مقاس 10 سم بمخزن Dulbecco واحتفظ به على الجليد.
  2. قتل أنثى فأرة حامل E13.5 وفقا لإرشادات المؤسسة. ضع الماوس بشكل مسطح على ظهره ورش الجسم الأمامي بنسبة 70٪ من الإيثانول. رفع الجلد فوق الرحم بالملقط وعمل شق بمقص جراحي لكشف الرحم.
  3. قم بإزالة الرحم بعناية وضعه في طبق بتري المعد مسبقا على الثلج.
  4. باستخدام مقص جراحي تحت غطاء المحرك الصفحي في RT ، قم بإزالة الأجنة بعناية من الرحم. قم بإزالة جميع بقايا المشيمة من الأجنة بالملقط وضعها في طبق بتري جديد مقاس 10 سم مملوء بمخزن Dulbecco.
  5. باستخدام ملقط أو إبر التشريح ، قم بقطع الجزء الخلفي من الرأس من الأماكن المميزة بأسهم سوداء في الشكل 1 أ. خذ القطعة المقطوعة بعيدا عن باقي الجنين (الشكل 1 ب).
  6. ضع الجزء الخلفي من القطعة المقطوعة باتجاه المراقب (الشكل 1 ج) واقطعه برفق من الذيلية إلى الجمجمة (الشكل 1 د). من 0.5 مم تحت فتحة الجمجمة ، قم بقطع منطقة 2 مم2-3 مم2 ، كما هو موضح في الشكل 1E.
  7. اجمع أرضية الدماغ المتوسط البطني (انظر الشكل 1F) في أنبوب فارغ للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل. احتفظ بأنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد حتى يتم جمع جميع أرضيات منتصف الدماغ فيه.
    ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن جمع أرضيات الدماغ المتوسط باستخدام ماصة دقيقة سعة 1 مل بعد تشريح جميع أدمغة الأجنة.
< p class = "jove_title" >3. إنشاء مزارع الدماغ المتوسط الجنينية الأولية من أجنة الفئران E13.5 في شكل 96 لوحة بئر

  1. بعد جمع أرضيات الدماغ المتوسط من جميع الأجنة في نفس الأنبوب سعة 1.5 مل ، قم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي ل Dulbecco واغسل قطع المناديل ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من Ca2+ ، Mg2+ - خال من محلول الملح المتوازن من Hank (HBSS).
  2. قم بإزالة HBSS وأضف 500 ميكرولتر من 0.5٪ تريبسين إلى الأنبوب. احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. أثناء الحضانة ، قم بتسخين 1.5 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) عند 37 درجة مئوية ، أضف 30 ميكرولتر من DNase I إلى FBS واخلطه. أيضا ، قم بتلميع طرف ماصة زجاجية من السيليكون. تأكد من أن الفتحة لا تحتوي على حواف حادة وبنفس حجم طرف الماصة الدقيقة سعة 1 مل.
    ملاحظة: كبديل ، يمكن استخدام طرف ماصة دقيقة منخفضة الالتصاق سعة 1 مل للتصاق. ومع ذلك ، يبدو أن الماصات الزجاجية المصنوعة من السيليكون تعطي أفضل النتائج.
  4. بمجرد انتهاء الحضانة في الخطوة 3.2 ، أضف 500 ميكرولتر من مزيج FBS / DNase إلى الأنسجة المهضومة جزئيا. استخدم الماصة الزجاجية لترتيب الأنسجة في مزيج FBS / التربسين. ثلاثي الأبعاد حتى تنفصل الأنسجة إلى جزيئات صغيرة بالكاد مرئية. تجنب الفقاعات أثناء التجربة.
  5. دع الجسيمات المتبقية تترسب في قاع أنبوب الطرد المركزي الدقيق عن طريق الجاذبية. دون سحب الراسب في الأسفل ، اجمع المادة الطافية في أنبوب بولي بروبيلين مخروطي فارغ سعة 15 مل.
  6. قم بتخفيف FBS/DNase I من الخطوة 3.3 (98:2) باستخدام 1,000 ميكرولتر من HBSS للحصول على FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50). امزج عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. أضف 1,000 ميكرولتر من المزيج الجديد إلى الجسيمات المتبقية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. ثلاثي الأبعاد مرة أخرى وكرر الخطوة 3.5.
  7. كرر الخطوة السابقة مرة أخرى لاستخدام جميع FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
  8. بمجرد جمع كل المادة الطافية داخل الأنبوب سعة 15 مل (من الخطوات 3.5 و 3.7 و 3.8) ، استخدم جهاز طرد مركزي منضدي لتدوير المادة الطافية (~ 3 مل) عند 100 × جم ، لمدة 5 دقائق.
  9. اغسل حبيبات الخلية بإضافة 2 مل من DPM إلى الأنبوب وقم بتدويرها عند 100 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وكرر الغسيل 2x لتقليل الحطام في الخلايا المحببة.
    ملاحظة: استخدم دائما DPM الطازج والدافئ للخلايا العصبية المستنبتة. بالنسبة لخطوات الغسيل ، لا يجب أن يكون DPM طازجا ولكن يجب تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
  10. تمييع الخلايا ب DPM طازج ودافئ ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. تعتمد كمية DPM للتخفيف على عدد الأجنة المستخدمة في تشريح الأنسجة. على سبيل المثال ، استخدم 150 ميكرولتر من DPM لتخفيف الخلايا التي تم الحصول عليها من عشرة أجنة.
  11. نقل 10 ميكرولتر من الخلايا في DPM إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. امزجها مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ بقعة تريبان زرقاء. عد الخلايا الحية (أي Trypan blue السلبية) باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي.
    ملاحظة: استخدم 30,000 خلية للطلاء لكل بئر للحصول على ~ 1,000 خلية عصبية الدوبامين لكل بئر. إذا كانت كثافة الخلية أعلى من ~ 30,000 خلية لكل 6 ميكرولتر ، فقم بتخفيف الخلايا باستخدام DPM قبل الطلاء بحيث لا يقل حجم البذر عن 6 ميكرولتر.
  12. دون لمس قاع الآبار ، قم بإزالة DPM من الجزر الصغيرة التي تم إنشاؤها في الخطوة 1.6.
  13. من أجل الحصول على كثافة خلية قابلة للتكرار في كل بئر ، قم بخلط الخلايا عن طريق سحب العينة اللطيف قبل الطلاء في البئر. باستخدام ماصة دقيقة من 1 إلى 10 ميكرولتر ، أضف 6 ميكرولتر من الخلايا إلى منتصف البئر في موقع كل جزيرة صغيرة سابقة.
  14. املأ الآبار الفارغة عند حواف اللوحة ب 150 ميكرولتر من الماء أو 1x PBS لتقليل التبخر من الآبار التي تحتوي على مزارع عصبية. احتضان اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 1 ساعة.
  15. بعد 1 ساعة ، أخرج اللوحة من الحاضنة ، وأضف 100 ميكرولتر من DPM في كل بئر به خلايا ، ثم ضعها مرة أخرى في الحاضنة.
  16. بعد يومين من الطلاء (اليوم في المختبر 2 ، أو DIV2) ، قم بإزالة 25 ميكرولتر وأضف 75 ميكرولتر من DPM الطازج لرفع حجم الوسائط النهائي إلى 150 ميكرولتر وتجنب التبخر قدر الإمكان.
  17. استبدل نصف الوسط ب DPM طازج (أي إزالة 75 ميكرولتر وإضافة 75 ميكرولتر DPM طازج) في DIV5. لا تقم بإجراء أي تغييرات على الوسائط بعد DIV5.
< p class = "jove_title" >4. تحريض مجاميع α-synuclein في الخلايا العصبية الدوبامين الجنينية الأولية عن طريق البذر باستخدام ألياف مسبقة التشكيل

بعد أي عمل مع ألياف α-synuclein مسبقة التكوين (PFFs) ، قم بتنظيف الغطاء الرقائقي أو أي معدات قد تكون قد اتصلت ب PFFs باستخدام 1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، ثم بنسبة 70٪ من الإيثانول.

  1. قبل التجربة ، قم بتخفيف PFFs ب 1x PBS إلى تركيز نهائي يبلغ 100 ميكروغرام / مل. قم بتشغيل PFFs المخففة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة باستخدام جهاز صوتي للحمام بقوة عالية مع تبريد حمام مائي عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دورات ، 30 ثانية ON / 30 ثانية OFF.
    ملاحظه: من الأهمية بمكان أن تكون الألياف صوتنة بشكل صحيح لتوليد شظايا ~ 50 نانومتر. يمكن قياس حجم PFFs الصوتية مباشرة من صور المجهر الإلكتروني للإرسال من PFFs الملطخة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام جهاز صوتي طرف. يمكن تخزين PFFs الصوتية عند -80 درجة مئوية في حصص صغيرة لتجنب دورات التجميد / الذوبان المتعددة.
  2. في DIV8 ، أضف 3.75 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل من PFFs لكل بئر إلى 150 ميكرولتر من الوسط في البئر إلى التركيز النهائي البالغ 2.5 ميكروغرام / مل. استخدم نفس المقدار من 1x PBS لمجموعة التحكم.
  3. قم بإعداد 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في 1x PBS وقم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية. للقيام بذلك ، اتبع الخطوات أدناه.
    ملاحظة: PFA سام. ارتد قناعا وقفازات أثناء التحضير ، واعمل دائما تحت غطاء رقائقي ، وتخلص من جميع نفايات PFA الصلبة والسائلة وفقا لتوجيهات المؤسسة.
    1. دافئ 500 مل من 1x PBS في وعاء سعة 1 لتر. ضع قضيب تحريك في الوعاء وضع الوعاء على محرك مغناطيسي مع وظيفة التسخين. اضبط درجة الحرارة بين 40-60 درجة مئوية لمنع الغليان مع الحفاظ على المحلول دافئا.
    2. قم بقياس 20 جم من مسحوق PFA تحت غطاء المحرك في حاوية قياس بلاستيكية يمكن التخلص منها. أضف مسحوق PFA بعناية إلى الوعاء المملوء ب 1x PBS. ابدأ في تحريك المحلول.
    3. أضف 200 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 5 M إلى المحلول واستمر في التقليب لمدة ~ 15 دقيقة حتى يذوب PFA تماما.
    4. بعد أن يبدو المحلول متجانسا ، أضف 168 ميكرولتر من كلوريد الهيدروجين 5 M لموازنة الرقم الهيدروجيني إلى ~ 7. تحقق من الرقم الهيدروجيني باستخدام شرائط مؤشر الأس الهيدروجيني الثابتة بالألوان التي يمكن التخلص منها.
    5. أخرج الوعاء من السخان واتركه ليبرد حتى يصل إلى RT. قم بتصفية المحلول وحصة التخزين عند -20 درجة مئوية. قم بإذابة الكميات في RT قبل الاستخدام ، ولا تقم بإعادة التجميد بعد ذلك.
  4. في DIV15 ، قم بإزالة جميع الوسائط من الآبار عن طريق سحب العينات. أضف 50 ميكرولتر من 4٪ PFA إلى كل بئر لإصلاح الخلايا واحتضانها لمدة 20 دقيقة في RT. بعد الحضانة ، قم بإزالة PFA من الآبار وأضف 100 ميكرولتر من 1x PBS إلى كل بئر لغسل الخلايا. قم بإزالة 1x PBS وغسل 2x أكثر.
  5. اترك 100 ميكرولتر من 1x PBS في كل بئر لتجنب الجفاف. قم بتخزين الطبق على حرارة 4 درجات مئوية حتى يتم إجراء الكيمياء المناعية.
فئة

5. تلطيخ الفلورسنت المناعي والتصوير الآلي للخلايا العصبية الدوبامين الجنينية الأولية في 96 لوحة بئر

  1. قم بإزالة 1x PBS ونفاذية الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 0.2٪ Triton X-100 في PBS (PBST) لكل بئر واحتضانها في RT لمدة 15 دقيقة.
  2. قم بإزالة PBST وأضف 50 ميكرولتر من مصل الحصان العادي بنسبة 5٪ (NHS) لكل بئر إلى PBST. لمنع نشاط المستضد غير المحدد ، احتضن في RT لمدة 1 ساعة.
  3. تمييع الأجسام المضادة الأولية ضد هيدروكسيلاز التيروزين (TH) و pS129-αsyn (1: 2,000) في 5٪ NHS في PBST. أضف 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة إلى كل بئر واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  4. قم بإزالة الأجسام المضادة وأضف 100 ميكرولتر من 1x PBS إلى كل بئر لغسل الخلايا. قم بإزالة 1x PBS وكرر الغسيل 2x.
  5. لمنع تبييض جزيئات الفلورسنت ، ابدأ العمل في ظل الحد الأدنى من ظروف الإضاءة. تمييع الأجسام المضادة الثانوية المسماة بالفلورسنت (1: 400) في PBST. أضف 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة إلى كل بئر واحتضن في RT لمدة 1 ساعة.
  6. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة وأضف 100 ميكرولتر من 1x PBS إلى كل بئر لغسل الخلايا. قم بإزالة 1x PBS وكرر الغسيل 2x.
  7. قم بإزالة 1x PBS ، وأضف 50 ميكرولتر من 200 نانوغرام / مل 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) لكل بئر لتلطيخ نوى الخلايا المستنبتة ، واحتضانها في RT لمدة 10 دقائق.
  8. اغسل الخلايا 3x مع 100 ميكرولتر من 1x PBS لمدة 5 دقائق لكل منها. احتفظ ب 100 ميكرولتر من 1x PBS في كل بئر بعد آخر غسلة. غطي الطبق بورق الألمنيوم واحفظيه على حرارة 4 درجات مئوية حتى التصوير.
  9. صورة الخلايا العصبية الدوبامين الجنينية الأولية في لوحة عرض جيدة 96 مع ماسح ضوئي عالي المحتوى (انظر جدول المواد) مزود بهدف 10x.
  10. اضبط الإعدادات بناء على مواصفات لوحة البئر 96 ، مثل نوع اللوحة والشركة المصنعة والحجم والمسافة بين الآبار وكذلك نوع وكمية الوسط.
  11. حدد منطقة التصوير للبئر لتغطية جميع الخلايا في جزيرة صغيرة. اختر مثالا جيدا لضبط التركيز البؤري التلقائي. أسس التركيز الأولي على DAPI.
  12. معايرة وقت الاستحواذ لكل قناة فلورية بناء على شدة التلوين في آبار التحكم. اضبط المعلمات بحيث يمكن للمرء أن يميز بوضوح في آبار التحكم المعالجة ب PFF خلايا الدوبامين التي تحتوي على مجاميع pS129-αsyn في سوما الخلية ، مما يسمح بقياس كمي لا لبس فيه للخلايا الإيجابية pS129-αsyn و pS129-αsyn السلبية.
    ملاحظه: يجب ألا تحتوي الآبار التي لا تحتوي على PFFs على أي تلطيخ ل pS129-αsyn ؛ لذلك ، يمكن استخدام هذه الآبار كتحكم سلبي لضبط شدة pS129-αsyn.
  13. قم بتصوير جميع الآبار المحددة بهدف 10x في وقت واحد لجميع القنوات ذات تلطيخ التألق المناعي بنفس المعلمات تماما.
  14. اختياريا ، قم بتسمية شوائب α-synuclein في مجموعة فرعية من الآبار مع الأجسام المضادة الخاصة ب α-synuclein الخيطية لتأكيد أن التغييرات في عدد الشوائب الإيجابية pS129-αsyn تعكس الانخفاض في تراكم البروتين بدلا من تثبيط الفسفرة أو إزالة الفسفرة من pS129-αsyn.
  15. كرر الخطوة 5.3 ، واستبدل الجسم المضاد pS129-αsyn بالجسم المضاد لخيوط α-synuclein (1: 2,000). قم بتصوير α-synuclein المجمعة الملونة كما في الخطوة 5.13.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: تشريح أرضية الدماغ المتوسط من جنين الفأر E13.5. (أ) يتم تمييز مواقع القطع في الجزء الخلفي من الرأس بأسهم سوداء وخطوط بيضاء متقطعة. (ب) تمت إزالة القطعة من باقي الجنين. القطعة التي تمت إزالتها محاطة بدائرة. (ج) تم تدوير القطعة بزاوية 90 درجة لمواجهة الخلف باتجاه المراقب. (د) تم فتح القطعة من الأسهم السوداء ، من الذ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments 0.4٪ صبغة تريبان بلو جيبكو ، ثيرمو ساينتيفيك ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية 15250061 15 مل أنبوب بولي بروبلين CELLSTAR Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, ألمانيا 188261 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية 10236276001 5 م حمض الهيدروكلوريك غير متاح غير متاح المطبخ الإعلامي، معهد التكنولوجيا الحيوية، جامعة هلسنكي 5 م هيدروكسيد الصوديوميد غير متاح غير متاح المطبخ الإعلامي، معهد التكنولوجيا الحيوية، جامعة هلسنكي لوحة عرض 96 بئر (أسود) بيركين إلمر ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية 6005182 99.5٪ إيثانول (EtOH) Altia Oyj, Rajamäki, فنلندا غير متاح سائل السيليكون AquaSil ثيرمو ساينتفيك، والثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية TS-42799 أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل معقم غير متاح غير متاح المطبخ الإعلامي، معهد التكنولوجيا الحيوية، جامعة هلسنكي جهاز صوتنة Bioruptor دياجينود ، لييج ، بلجيكا B01020001 محلول الملح المتوازن من Ca2 + ، Mg2 + خال من Hank (HBSS) جيبكو ، ثيرمو ساينتيفيك ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية هاتف: 14175-053 حزم برامج CellProfiler و CellAnalyst غير متاح غير متاح برنامج مجاني مفتوح المصدر جهاز طرد مركزي 5702 Eppendorf AG ، هامبورغ ، ألمانيا 5702000019 حاضنة CO2 هيرا سيل ، ثيرمو ساينتيفيك ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية غير متاح غرفة العد شركة BioRad ، هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 1450015 DeltaVision مجهر فائق الدقة مع طاولة هوائية وخزانة جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياة ، بوسطن ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية 29254706 ديوكسيربونوكلياز I (Dnase I) روش ، بازل ، سويسرا 22098700 د-الجلوكوز سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية جي 8769 DMEM / F12 جيبكو ، ثيرمو ساينتيفيك ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية 21331–020 حمار مضاد للفأر AlexaFluor 488 ثيرمو ساينتفيك، والثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية أ 21202 الحمار المضاد للأرانب AlexaFluor 647 ثيرمو ساينتفيك، والثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية أ31573 الحمار المضاد للأغنام AlexaFluor 488 ثيرمو ساينتفيك، والثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية أ 11015 عازلة Dulbecco غير متاح غير متاح المطبخ الإعلامي، معهد التكنولوجيا الحيوية، جامعة هلسنكي مصل الأبقار الجنينية (FBS) جيبكو ، ثيرمو ساينتيفيك ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية 10500056 فيشربراند عادي الاقتصاد PTFE شريط التحريك فيشر العلمي ، Thermo Scientific ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية 11507582 نظام التصوير الآلي ImageXpress Nano الأجهزة الجزيئية ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية غير متاح ل-جلوتامين جيبكو ، ثيرمو ساينتيفيك ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية 25030–032 الفأر أحادي النسيلة المضاد للتيروزين هيدروكسيلاز ميليبور ، ميرك KGaA ، دارمشتات ، الألمانية MAB318 مكمل N2 جيبكو ، ثيرمو ساينتيفيك ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية 17502–048 مصل الحصان العادي شركة Vector Laboratories Inc. ، Burlingame ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة إس-2000 بارافورمالدهيد (PFA) سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية 158127 مسحوق بارافورمالدهايد ، 95٪ سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية 158127 pH-Fix، شرائط مؤشر ثابتة اللون Macherey-Nagel ، دورين ، ألمانيا 92110 محلول ملحي عازلة الفوسبوهيات (PBS) غير متاح غير متاح المطبخ الإعلامي، معهد التكنولوجيا الحيوية، جامعة هلسنكي بولي إل أورنيثين سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية ص 4957 بريموسين إنفيفوجين، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية النمل-PM-1 ، النمل-PM-2 خيوط الأرانب أحادية النسيلة المضادة لألفا سينوكلين Abcam, Cambridge, المملكة المتحدة أب209538 أرنب أحادي النسيلة مضاد للفوسفا سيرين 129-ألفا سينوكلين Abcam, Cambridge, المملكة المتحدة أب51253 RCT أساسي ، IKA النمام المغناطيسي IKA-Werke® GmbH ، Staufen ، ألمانيا 3810000 عامل التغذية العصبية المشتق من الخلايا الدبقية البشرية المؤتلف (hGDNF) PeproTech ، روكي هيل ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية أو Prospec ، نيس صيونا ، إسرائيل 450-10 (PeproTech) ، CYT-305 (Prospec) ألفا سينوكلين الفأر المؤتلف ألفا سينوكلين الألياف مسبقة التكوين (PFFs) غير متاح غير متاح هدية من المتعاون البروفيسور كلفن سي لوك نظام المجهر المجهري البحثي شركة أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان SZX10 الأغنام متعددة النسيلة المضادة للتيروزين هيدروكسيلاز ميليبور ، ميرك KGaA ، دارمشتات ، الألمانية أب1542 TC 20 عداد الخلايا الآلي شركة BioRad ، هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 1450102 تريتون X-100 سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية 11332481001 تربسين MP Biomedicals ، شركة Valiant Co. ، يانتاي ، شاندونغ ، الصين هاتف: 2199700

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Alpha Synuclein AccumulationPre formed FibrilsDopamine NeuronsImmunofluorescence StainingPhosphorylated Alpha SynucleinFluorescence Plate ScannerPrimary Mouse Embryonic NeuronsCell PermeabilizationAntibody BindingNuclear Staining

Related Articles