Method Article

تشريح المضيف للفيروسات التفاعل في النسخ المتماثل التحللي من الفيروسة الموديل

DOI:

10.3791/3140

October 7th, 2011

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفنا بروتوكول لتحديد الأدوار الرئيسية للجزيئات إشارة المضيف في النسخ المتماثل للهربس التحللي نموذج، غاما هربس 68 (γHV68). استخدام سلالات الفئران المعدلة وراثيا والخلايا الليفية الجنينية لتكرار التحللي γHV68، وبروتوكول يسمح كل من توصيف المظهري والجزيئي للفيروس الاستجواب في استضافة التفاعلات في النسخ المتماثل التحللي الفيروسية.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في استجابة للعدوى الفيروسية، مجموعة تطوير استجابات دفاعية مختلفة، مثل تفعيل المناعة الفطرية مسارات الإشارات التي تؤدي إلى 1،2 المضادة للفيروسات خلوى الإنتاج. من أجل استعمار المضيف والفيروسات هي تلزم للتهرب من الردود المضادة للفيروسات المضيف والتلاعب مسارات الإشارات. وكشف التفاعل المضيفة للفيروسات تسليط الضوء على وضع استراتيجيات علاجية جديدة ضد العدوى الفيروسية.

الفئران γHV68 يرتبط ارتباطا وثيقا هربس ساركومة المرتبطة الإنسان أنكجنيك كابوزي وEpsten بار فيروس 3،4. γHV68 العدوى في الفئران المعملية يوفر لين العريكة نموذج حيواني صغير لفحص كامل للاستجابات المضيف والعدوى الفيروسية في الجسم الحي، والتي هي غير متاحة للالهربس الإنسان. في هذا البروتوكول، نقدم لجنة من الأساليب لتوصيف المظهري والجزيئي للمكونات تشريح المضيفة في إشارة γHV68 replic التحلليأوجه كل من في الجسم الحي وفيفو السابقين. توافر سلالات الفئران المعدلة وراثيا يسمح استجواب أدوار مسارات الإشارات المضيف خلال العدوى الحادة γHV68 في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الماوس الخلايا الليفية الجنينية (MEFs) المعزولة من هذه السلالات الماوس ناقصة لتشريح مزيد من أدوار هذه الجزيئات خلال تكرار التحللي γHV68 فيفو السابقين.

باستخدام فحوصات الفيروسية البيولوجيا الجزيئية و، يمكننا تحديد الآلية الجزيئية للفيروسات من المضيف التفاعلات وتحديد المضيف والجينات الفيروسية الأساسية للنسخ المتماثل التحللي الفيروسية. وأخيرا، كروموسوم اصطناعي البكتيرية (BAC) نظام يسهل إدخال طفرات في عامل فيروسي (ق) التي يقطع على وجه التحديد التفاعل المضيفة للفيروسات. ويمكن استخدام المؤتلف γHV68 تحمل هذه الطفرات لاستعادة أحد الظواهر من تكرار التحللي γHV68 في MEFs نقص في إشارة المضيف مفتاح المكونات.هذا البروتوكول يوفر استراتيجية ممتازة لاستجواب المضيف الممرض التفاعل على مستويات متعددة للتدخل في الجسم الحي وفيفو السابقين.

مؤخرا، اكتشفنا أن يغتصب γHV68 على مسار الإشارات الفطرية في مأمن من تشجيع تكرار التحللي الفيروسية 5. على وجه التحديد، γHV68 العدوى نوفو دي ينشط المناعة، وكيناز IKKβ IKKβ تنشيط العامل الرئيسي phosphorylates النسخ الفيروسية، والنسخ وtransactivator (RTA)، لتعزيز تفعيل النسخي الفيروسية. في القيام بذلك، γHV68 الأزواج بكفاءة تفعيله النسخي لاستضافة تنشيط جهاز المناعة الفطرية، وبالتالي تيسير النسخ الفيروسية وتكرار التحللي. هذه الدراسة مثالا ممتازا التي يمكن تطبيقها على الفيروسات الأخرى لاستجواب المضيفة للفيروسات التفاعل.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. عدوى الفأر مع γHV68

  1. وتستخدم الفئران littermate ستة إلى ثمانية أسابيع من العمر، والجنس المطابقة (8 إلى 12 الفئران / المجموعة) لعدوى فيروسية. تسمح الفئران ليتأقلم على مدى أربعة أيام كاملة (96 ساعة) بعد الشحن.
  2. وينبغي إجراء الخطوات باستخدام بروتوكول الفيروس في تشكيل حكومة من مستوى السلامة الأحيائية 2 (BSL2) باستخدام معيار BSL2 الاحتياطات.
  3. إعداد التعليق الفيروسية (40 إلى 1 × 10 5 البلاك تشكيل وحدات [PFU]) من γHV68 في 30 ميكرولتر من....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في استجابة للعدوى الفيروسية، يتم تنشيط مافريكس التي تعتمد على المناعة الفطرية مسارات الإشارات لتعزيز إنتاج السيتوكينات الالتهابية المضادة للفيروسات 10-14. باستخدام γHV68 الفئران ك فيروس هربس ساركومة نموذجا للالمرتبطة الإنسان أنكجنيك كابوزي وفيروس ابشتاين بار 3،4، اكتشفنا أن γHV68 يغتصب مسار مافريكس-IKKβ لتشجيع تكرار التحللي الفيروسية عن طريق تفعيل النسخي 5. توظيف MEFs المعدلة وراثيا والتقنيات في علم الفيروسات الجزيئية، ويسمح تحديد كفاءة يشير مكونات.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور جيمس (تشى جيان) تشن (UT جنوبي غربي، البيولوجيا الجزيئية) لتوفير الكواشف الضرورية، بما في ذلك مافريكس - / - الفئران، والدكتور رينيه الشمس (جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس، والصيدلة الطب الجزيئي ) لتوفير كروموسوم البكتيريا الصناعي من γHV68 لهذه الدراسة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة كتالوج رقم
Lipofectamine 2000 إينفيتروجن 11668-019
MAX الخلايا الكهربائية DH10B المختصة إينفيتروجن 18290-015
ميثيل سيجما M0512
POWERPREP HP البلازميد Miniprep النظام أوريجنس NP100004
POWERPREP HP البلازميد Midiprep النظام أوريجنس NP100006

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
  2. Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449, 819-826 (2007).
  3. Speck, S. H., Virgin, H. W.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Herpesvirus Lytic ReplicationHost virus InteractionGamma HV68Mavs Knockout MiceMouse Embryonic FibroblastsPlaque AssayReal time PCRViral Titer MeasurementInnate Immune SignalingBacterial Artificial Chromosome

Related Articles