فحص البلعمة الحية للخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام المشابك العصبية البشرية

الملخص

المصدر: Funes, S., et. al. ، الخلايا الشبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة البشرية: التمايز من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ومقايسة البلعمة ذات الخلايا الحية في المختبر باستخدام المشابك البشرية. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو اختبارا لدراسة القدرة البلعمية للخلايا الشبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام المشابك العصبية الفلورية الحساسة للأس الهيدروجيني.

البروتوكول

1. Live-cell parasisis
   1. Plate 20-30 × 10⁴ PMPs في 96 بئر في 100 ميكرولتر من الوسط الكامل iMG واتبع عملية التمايز لمدة 10 أيام.
   2. في يوم الفحص ، قم بإعداد محلول التلوين النووي عن طريق إضافة قطرة واحدة من البقعة النووية للخلايا الحية إلى 2 مل من الوسط القاعدي iMG.
   3. قم بإزالة 40 ميكرولتر من الوسط لكل بئر من اللوحة المكونة من 96 بئرا وأضف 10 ميكرولتر من محلول التلوين النووي باستخدام ماصة متعددة القنوات. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة ساعتين.
   4. قم بإذابة المشبك العصبي المسمى على الجليد وصوتي برفق باستخدام مكبر صوت مائي لمدة 1 دقيقة. قم بتخفيف الجسيمات العصبية المسماة في وسط iMG الكامل بنسبة 1 ميكرولتر من المشابك العصبية لكل 50 ميكرولتر من الوسط.
      NOTE: يعتمد تركيز المشابك على الفحص وقد يتطلب تحسينا. للحفاظ على نسبة منخفضة نسبيا (أي 0.1٪ أو أقل) من DMSO في الوسط ، ينصح بعدم إضافة أكثر من 2 ميكرولتر من المشابك العصبية لكل بئر.
   5. كعنصر تحكم سلبي، قم بمعالجة بعض الآبار باستخدام السيتوكالاسين D لتثبيط بلمرة الأكتين ، وبالتالي البلعمة. تحضير محلول 60 ميكرومتر من السيتوكالاسين D في وسط iMG كامل. أضف 10 ميكرولتر من هذا المحلول إلى كل بئر للحصول على تركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر واحتضانه عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 30 دقيقة.
   6. قم بإزالة اللوحة من الحاضنة واحتضانها عند 10 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
   7. الطرد المركزي للوحة عند 270 × جم لمدة 3 دقائق عند 10 درجات مئوية وحافظ على اللوحة على الجليد حتى الحصول على التصوير.
2. Imaging Acquisition and analysis
   1. أدخل اللوحة في قارئ تصوير الخلية الحية وحدد الآبار المراد تحليلها.
   2. حدد عدسة موضوعية 20x.
   3. ضبط التركيز وكثافة الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) ووقت التكامل وكسب القنوات الساطعة والأزرق (4',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]). يجب أن يكون التألق المشبكي ضئيلا في النقطة الزمنية الأولية. استخدم قناة الحقل الساطع كمرجع للتركيز على القناة الحمراء (RFP). يمكن أن يختلف وقت التكامل والكسب بين التجارب. استخدم هذه الإعدادات الأولية للقناة الحمراء: LED: 4 ، وقت التكامل: 250 ، والكسب: 5.
   4. حدد عدد البلاطات الفردية التي سيتم الحصول عليها في مونتاج لكل بئر (على سبيل المثال، احصل على 16 بلاطة في وسط البئر، وبالتالي تصوير ما يقرب من 5٪ من إجمالي مساحة البئر). اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية والفاصل الزمني المطلوب للتصوير.
      ملاحظة: تم الحصول على الصور كل 1-2 ساعة لمدة تصل إلى 16 ساعة في هذه الدراسة.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td style = 'padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> مواد زراعة الخلايا < td style = 'padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> < td style = 'padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> < td style = 'padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '>Primaria 96-well Clear Flat Bottom MicroplateCorning353872 CellAdhere Laminin-521STEMCELL التكنولوجيا < td style = 'padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> 77004 < td style = 'padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> يشار إليه إلى laminin 521 < td style = 'padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> مكونات الوسائط الأساسية iMG < td style = 'padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> < td style = 'padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> < td style = 'padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> Advanced DMEM/F12Gibco12634010Final Concentration 1xGlutaMAXGibco35050061التركيز النهائي 1xN2 supplement, 100xGibco17502-048التركيز النهائي 1xالبنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) < نمط td = 'الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛'>Gibco < td style = 'padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom;' >15140122التركيز النهائي 100 U / mL < td style = 'padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> مكونات وسائط iMG الكاملة < td style = 'padding: 0px 3px ؛ vertical-align: bottom ؛ '> < td style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> 55 mM 2-mercaptoethanolGibco21985023التركيز النهائي 55 ميكرومترIL-34PeproTech أو Biologend200-34 أو 577904التركيز النهائي 100 نانوغرام/مل<td style='الحشوة:0px 3px;vertical-align:bottom;'>iMG base media التركيز النهائي 1xM-CSFPeproTech300-25التركيز النهائي 5 نانوغرام/ملTGF-βPeproTech100-21التركيز النهائي 50 نانوغرام/مل<td style='الحشوة:0px 3px;>'vertical-alignsis<td stylestd style='padding:0px 3px;'vertical-align:bottom;'> NucBlue Live Ready reagentInvitrogenR37605 pHrodo Red, succinimidyl esterThermoFisher ScientificP36600يشار إليها إلى صبغة حساسة لدرجة الحموضةكواشف ثقافة الخلية الأخرى Cytochalasin DSigma التركيز النهائي 10 μMSoftware and Equipment CentrifugeEppendorfModel 5810R Cytation 5 Live cell imaging readerBiotek Gen5 Microplate Reader and Imager SoftwareBiotekversion 3.03< نمط TD = 'الحشوة: 0 بكسل 3 بكسل ؛ المحاذاة الرأسية: أسفل ؛'>