كشف متعددة من البكتيريا الموجودة في مجمع العينات السريرية والبيئية باستخدام قليل النوكليوتيد ، بالإضافة نيون المجهرية

Summary

نحن تصف طريقة متعددة للكشف عن الكائنات الدقيقة ضمن عينة باستخدام الخرز ، بالإضافة الفلورسنت قليل النوكليوتيد. غير المهجنة Amplicon من جميع الكائنات الحية داخل عينة على لجنة التحقيق ، إلى جانب الخرز. وتستخدم أداة أو Luminex بيو الصفيف إلى الاستعلام كل حبة حبة لنوع وإشارة التهجين.

Abstract

التهاب المهبل الجرثومي (BV) هو متلازمة متعدد المكروبات المتكررة التي يتميز تغيير في مجهريات البقعة "طبيعية" من ​​يهيمن عليها الملبنة لمجهريات البقعة التي تهيمن عليها لعدد من أنواع البكتيريا ، بما في ذلك الغاردنريلة المهبلية ، Atopobium المهبل ، و ^1-3 الآخرين. ويرتبط هذا الشرط مع مجموعة من نتائج سلبية على الصحة ، بما في ذلك اكتساب فيروس نقص المناعة البشرية ⁴ ، وأنه يمكن أن يكون من الصعب على إدارة سريريا ^5. وعلاوة على ذلك ، اعتمد تشخيص BV على استخدام بقع غرام من المسحات المهبلية المسحة التي سجلت على معايير مختلفة ^6،7 العددية. في حين أن هذا التشخيص غير بسيطة وغير مكلفة ، ويناسب المناطق ذات الموارد المحدودة ، ويمكن ان تعاني من مشاكل تتعلق التفسيرات الذاتية وأنها لا تعطي صورة تفصيلية للتكوين المهبل مجهريات البقعة ^8. وقد كشفت مؤخرا جهود التسلسل عميقة ومتنوعة غنية مجهريات البقعة مع المهبليةواضح الخلافات بين عينات أخذت من الأفراد الذين يتم تشخيصهم مقارنة مع BV لأولئك الأفراد الذين يعتبرون ^9،10 العادية ، مما أدى إلى تحديد عدد من الاهداف المحتملة للتشخيص الجزيئي لBV ^11،12. وقد وفرت هذه الدراسات وجود ثروة من المعلومات المفيدة ، ولكن تسلسل عميق ليس بعد العملية كوسيلة تشخيصية في عملية إعداد سريرية. وقد وصفت لنا في الآونة الأخيرة وسيلة لتنميط بسرعة مجهريات البقعة المهبل في شكل متعدد باستخدام قليل النوكليوتيد ، إلى جانب الخرز الفلورسنت مع الكشف على منصة Luminex ^13. هذا الأسلوب ، مثل الطرق الحالية وصمة عار على أساس غرام ، هو سريعة وبسيطة ولكنها تضيف ميزة إضافية لاستغلال المعرفة الجزيئية الناجمة عن التسلسل الدراسات في تصميم المسبار. هذا الأسلوب يوفر بالتالي وسيلة لملف كبير الكائنات الحية الدقيقة الموجودة في المسحة المهبلية التي يمكن أن تستخدم لتشخيص BV مع خصوصية عالية الحساسية وشركاتحمراء مكتوب لصبغة جرام بينما توفر معلومات إضافية حول وجود وفرة الأنواع وبطريقة شبه الكمي والسريع. هذا الأسلوب متعددة قابلة للتوسع إلى ما وراء نطاق المقايسات الحالية PCR الكمي للكائنات معينة ، والتي تقتصر حاليا على 5 أو 6 فحوصات مختلفة في عينة واحدة ^14. الأهم من ذلك ، لا يقتصر على أسلوب للكشف عن البكتيريا في مسحات مهبلية ويمكن تكييفها بسهولة للملف بسرعة أي ما يقرب من المجتمع الميكروبي من الفائدة. على سبيل المثال ، بدأنا مؤخرا في تطبيق هذه المنهجية في تطوير أدوات تشخيصية للاستخدام في محطات معالجة مياه الصرف الصحي.

Protocol

وقد استخدم هذا الأسلوب في البحث عنها في Dumonceaux وآخرون. J. كلين. . Microbiol 47 ، 4067-4077 ، دوى : 10.1128/jcm.00112-09 (2009).

يتم تقديم رسم تخطيطي يصور الداخلي الإجمالي في الشكل 1.

1. حبة اقتران

هذا يصف الطرق التي ستستخدم لاقتران قليل النوكليوتيد تحقيقات لحبات Luminex البوليسترين (انظر الجدول 2). يتم تكييفها وحدات التخزين قليلا لتقييم تحقيقات التقاط جديد على أساس تجريبي ، وترد هذه الكميات بين قوسين.

Discussion

خصوصية توليد إشارة ذات أهمية حاسمة ، يجب أن تكون على ثقة من أن لاحظ إشارة تعكس حقا كشف amplicon المتولدة من ذلك الحي. يمكن لبرامج مثل PrimerPlex (الدوري Biosoft) على تصميم التحقيقات التي من شأنها أن يهجن بكفاءة ، لكنها قد تكون أو لا إلى الأنواع غير المستهدفة عبر هجن. عندما تستخدم بادئات PCR عالمية كما هو موضح في هذا البروتوكول ، من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن إنشاء amplicon يمثل جميع الكائنات الحية الموجودة في العينة. من المهم ، لذلك ، لتحليل التحقيقات المحتملة لإمكانية التهجين ا.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم قليل النوكليوتيد	شركة	تسلسل 1
H279BP	Invitrogen ، IDT ، أو غيرها من	البيوتين OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC
H280		YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT
H1612BP		البيوتين OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC
H1613		CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT
1O ، phosphorothioate - C ، E ، G - phosphorothioate ؛ F ، phosphorothioate - A ، وأنا ، إينوزين ؛ Y ، C أو تي ، R ، A أو G ، K ، T أو G ، S ، C أو G.

اسم الكاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
1 - 3 - الأثيل (3 - dimethylamiopropyl) carbodiimide حمض الهيدروكلوريك (EDC)	ثقب	22980
الخرز البوليسترين فلوري : MicroPlex المجهرية (Luminex) ، أو البيولوجية الصفيف COOH الخرزة (بيو راد)	Luminex أو بيو راد ،	بيو راد : 171 506xxx حيث xxx يناظر معرف حبة	حبات مغناطيسية أصبحت متاحة للاقتران قليل النوكليوتيد ويمكن أن تقدم مزايا معينة. لم يحاكموا من قبل هؤلاء الكتاب.
[أليغنوكليوتيد] القبض على (5 'الأمينية تعديل C12)	Invitrogen ، IDT ، أو غيرها من	مختلف	المحلاة مستوى نقاء مقبولة. يتم توفير سلاسل من التحقيقات التقاط المستخدمة لتوصيف مسحات مهبلية في المخطوطة التي يستند إليها هذا البروتوكول 13.
T7نوكلياز خارجية	نيو انغلاند Biolabs	M0263S
Streptavidin - R - فيكوإيريترين (SA - PE)	Invitrogen	S - 866	كن حذرا للحصول على درجة نقاوة عالية SA - PE ؛ ينصح هذا الرقم التسويقي
96 Thermowell جيدا لوحات PCR	الصياد	CS006509	تناسب كلا thermocycler 96 - جيدا وآلة BioPlex
Thermowell ختم حصيرة	الصياد	CS006555	ويمكن إعادة استخدامها ؛ تغسل بالماء والصابون ، شطف جيدا ، والجافة
5M TMAC	سيغما	T3411
الحيوي الصفيف أو صك Luminex	بيو راد أو Luminex	بيو راد : 171-000201
PrimerPlex برنامج لتصميم المسبار	رئيس الوزراء Biosoft	www.premierbiosoft.com	واقترح لتحقيق Luminex ديتوقيع ، على الرغم من يمكن استخدام منصات البرامج الأخرى

مكون	ميكروليتر / مقايسة	μl/100 المقايسات	التركيز النهائي
10X PCR العازلة (Invitrogen)	5	500	1X
50 ملي MgCl 2 (Invitrogen)	2.5	250	2.5 ملم
10 ملي dNTP	1	100	0.2 ملم كل
H279BP ، 25 ميكرومتر	0.25	25	375 نانومتر
H1612BP ، 25 ميكرومتر	0.75	75	125 نانومتر
H280 ، 25 ميكرومتر	0.25	25	375 نانومتر
H1613 ،25 ميكرومتر	0.75	75	125 نانومتر
ماء	34	3400	---
المجاميع	44.5	4450