نحن تصف طريقة متعددة للكشف عن الكائنات الدقيقة ضمن عينة باستخدام الخرز ، بالإضافة الفلورسنت قليل النوكليوتيد. غير المهجنة Amplicon من جميع الكائنات الحية داخل عينة على لجنة التحقيق ، إلى جانب الخرز. وتستخدم أداة أو Luminex بيو الصفيف إلى الاستعلام كل حبة حبة لنوع وإشارة التهجين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
كشف متعددة من البكتيريا الموجودة في مجمع العينات السريرية والبيئية باستخدام قليل النوكليوتيد ، بالإضافة نيون المجهرية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التهاب المهبل الجرثومي (BV) هو متلازمة متعدد المكروبات المتكررة التي يتميز تغيير في مجهريات البقعة "طبيعية" من يهيمن عليها الملبنة لمجهريات البقعة التي تهيمن عليها لعدد من أنواع البكتيريا ، بما في ذلك الغاردنريلة المهبلية ، Atopobium المهبل ، و 1-3 الآخرين. ويرتبط هذا الشرط مع مجموعة من نتائج سلبية على الصحة ، بما في ذلك اكتساب فيروس نقص المناعة البشرية 4 ، وأنه يمكن أن يكون من الصعب على إدارة سريريا 5. وعلاوة على ذلك ، اعتمد تشخيص BV على استخدام بقع غرام من المسحات المهبلية المسحة التي سجلت على معايير مختلفة 6،7 العددية. في حين أن هذا التشخيص غير بسيطة وغير مكلفة ، ويناسب المناطق ذات الموارد المحدودة ، ويمكن ان تعاني من مشاكل تتعلق التفسيرات الذاتية وأنها لا تعطي صورة تفصيلية للتكوين المهبل مجهريات البقعة 8. وقد كشفت مؤخرا جهود التسلسل عميقة ومتنوعة غنية مجهريات البقعة مع المهبليةواضح الخلافات بين عينات أخذت من الأفراد الذين يتم تشخيصهم مقارنة مع BV لأولئك الأفراد الذين يعتبرون 9،10 العادية ، مما أدى إلى تحديد عدد من الاهداف المحتملة للتشخيص الجزيئي لBV 11،12. وقد وفرت هذه الدراسات وجود ثروة من المعلومات المفيدة ، ولكن تسلسل عميق ليس بعد العملية كوسيلة تشخيصية في عملية إعداد سريرية. وقد وصفت لنا في الآونة الأخيرة وسيلة لتنميط بسرعة مجهريات البقعة المهبل في شكل متعدد باستخدام قليل النوكليوتيد ، إلى جانب الخرز الفلورسنت مع الكشف على منصة Luminex 13. هذا الأسلوب ، مثل الطرق الحالية وصمة عار على أساس غرام ، هو سريعة وبسيطة ولكنها تضيف ميزة إضافية لاستغلال المعرفة الجزيئية الناجمة عن التسلسل الدراسات في تصميم المسبار. هذا الأسلوب يوفر بالتالي وسيلة لملف كبير الكائنات الحية الدقيقة الموجودة في المسحة المهبلية التي يمكن أن تستخدم لتشخيص BV مع خصوصية عالية الحساسية وشركاتحمراء مكتوب لصبغة جرام بينما توفر معلومات إضافية حول وجود وفرة الأنواع وبطريقة شبه الكمي والسريع. هذا الأسلوب متعددة قابلة للتوسع إلى ما وراء نطاق المقايسات الحالية PCR الكمي للكائنات معينة ، والتي تقتصر حاليا على 5 أو 6 فحوصات مختلفة في عينة واحدة 14. الأهم من ذلك ، لا يقتصر على أسلوب للكشف عن البكتيريا في مسحات مهبلية ويمكن تكييفها بسهولة للملف بسرعة أي ما يقرب من المجتمع الميكروبي من الفائدة. على سبيل المثال ، بدأنا مؤخرا في تطبيق هذه المنهجية في تطوير أدوات تشخيصية للاستخدام في محطات معالجة مياه الصرف الصحي.
البروتوكول
وقد استخدم هذا الأسلوب في البحث عنها في Dumonceaux وآخرون. J. كلين. . Microbiol 47 ، 4067-4077 ، دوى : 10.1128/jcm.00112-09 (2009).
يتم تقديم رسم تخطيطي يصور الداخلي الإجمالي في الشكل 1.
1. حبة اقتران
هذا يصف الطرق التي ستستخدم لاقتران قليل النوكليوتيد تحقيقات لحبات Luminex البوليسترين (انظر الجدول 2). يتم تكييفها وحدات التخزين قليلا لتقييم تحقيقات التقاط جديد على أساس تجريبي ، وترد هذه الكميات بين قوسين.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
خصوصية توليد إشارة ذات أهمية حاسمة ، يجب أن تكون على ثقة من أن لاحظ إشارة تعكس حقا كشف amplicon المتولدة من ذلك الحي. يمكن لبرامج مثل PrimerPlex (الدوري Biosoft) على تصميم التحقيقات التي من شأنها أن يهجن بكفاءة ، لكنها قد تكون أو لا إلى الأنواع غير المستهدفة عبر هجن. عندما تستخدم بادئات PCR عالمية كما هو موضح في هذا البروتوكول ، من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن إنشاء amplicon يمثل جميع الكائنات الحية الموجودة في العينة. من المهم ، لذلك ، لتحليل التحقيقات المحتملة لإمكانية التهجين ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر البرتو Severini وGoleski فانيسا للمساعدة في تطوير فحص والتعليقات الهامة على هذا المخطوط. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل وكالة الصحة العامة في كندا لتقديم المساعدة وبرنامج البحوث الصناعية (المجلس القومي للبحوث في كندا). تم الحصول على دعم إضافي من جامعة ساسكاتشوان الصندوق النشر.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم قليل النوكليوتيد | شركة | تسلسل 1 | |
| H279BP | Invitrogen ، IDT ، أو غيرها من | البيوتين OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC | |
| H280 | YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT | ||
| H1612BP | البيوتين OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC | ||
| H1613 | CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT | ||
| 1O ، phosphorothioate - C ، E ، G - phosphorothioate ؛ F ، phosphorothioate - A ، وأنا ، إينوزين ؛ Y ، C أو تي ، R ، A أو G ، K ، T أو G ، S ، C أو G. |
الجدول 1. متواليات من الجميع لتعديل [أليغنوكليوتيد] cpn60 PCR.
| اسم الكاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
|---|---|---|---|
| 1 - 3 - الأثيل (3 - dimethylamiopropyl) carbodiimide حمض الهيدروكلوريك (EDC) | ثقب | 22980 | |
| الخرز البوليسترين فلوري : MicroPlex المجهرية (Luminex) ، أو البيولوجية الصفيف COOH الخرزة (بيو راد) | Luminex أو بيو راد ، | بيو راد : 171 506xxx حيث xxx يناظر معرف حبة | حبات مغناطيسية أصبحت متاحة للاقتران قليل النوكليوتيد ويمكن أن تقدم مزايا معينة. لم يحاكموا من قبل هؤلاء الكتاب. |
| [أليغنوكليوتيد] القبض على (5 'الأمينية تعديل C12) | Invitrogen ، IDT ، أو غيرها من | مختلف | المحلاة مستوى نقاء مقبولة. يتم توفير سلاسل من التحقيقات التقاط المستخدمة لتوصيف مسحات مهبلية في المخطوطة التي يستند إليها هذا البروتوكول 13. |
| T7نوكلياز خارجية | نيو انغلاند Biolabs | M0263S | |
| Streptavidin - R - فيكوإيريترين (SA - PE) | Invitrogen | S - 866 | كن حذرا للحصول على درجة نقاوة عالية SA - PE ؛ ينصح هذا الرقم التسويقي |
| 96 Thermowell جيدا لوحات PCR | الصياد | CS006509 | تناسب كلا thermocycler 96 - جيدا وآلة BioPlex |
| Thermowell ختم حصيرة | الصياد | CS006555 | ويمكن إعادة استخدامها ؛ تغسل بالماء والصابون ، شطف جيدا ، والجافة |
| 5M TMAC | سيغما | T3411 | |
| الحيوي الصفيف أو صك Luminex | بيو راد أو Luminex | بيو راد : 171-000201 | |
| PrimerPlex برنامج لتصميم المسبار | رئيس الوزراء Biosoft | www.premierbiosoft.com | واقترح لتحقيق Luminex ديتوقيع ، على الرغم من يمكن استخدام منصات البرامج الأخرى |
الجدول 2. الكواشف معينة والمعدات.
| مكون | ميكروليتر / مقايسة | μl/100 المقايسات | التركيز النهائي |
|---|---|---|---|
| 10X PCR العازلة (Invitrogen) | 5 | 500 | 1X |
| 50 ملي MgCl 2 (Invitrogen) | 2.5 | 250 | 2.5 ملم |
| 10 ملي dNTP | 1 | 100 | 0.2 ملم كل |
| H279BP ، 25 ميكرومتر | 0.25 | 25 | 375 نانومتر |
| H1612BP ، 25 ميكرومتر | 0.75 | 75 | 125 نانومتر |
| H280 ، 25 ميكرومتر | 0.25 | 25 | 375 نانومتر |
| H1613 ،25 ميكرومتر | 0.75 | 75 | 125 نانومتر |
| ماء | 34 | 3400 | --- |
| المجاميع | 44.5 | 4450 |
مقترح الجدول 3. مخاليط لPCR مع UT تعديل الاشعال cpn60 (الجدول 1). تم تعيين مقايسة لمدة 5 ميكرولتر من الحمض النووي القالب و 0.5 ميكروليتر (2.5U) من الحمض النووي بوليميريز طق (Invitrogen). عادة ما يتم إعداد كميات كبيرة (على سبيل المثال يكفي لمدة 100 المقايسات) وتخزينها في -20 درجة مئوية.
المراجع
- Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. Bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).
- Hay, P. Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot. Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).
- Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
