يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تصور انواع معينة ايليجانس استخدام الصبغة الحيوية محبة للدهون ، صلاح الغيدان

17.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/3362

⸱

يناير 30, 2012

 , 
1Department of Molecular and Cellular Medicine, Texas A&M University System Health Science Center, College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

نقدم طريقة لتصور العيش في إهاب C. ايليجانس باستخدام صبغ أحمر فلوري محبة للدهون الجاذبة (1،1 '- dioctadecyl - 3 ، 3،3' ، 3' - tetramethylindocarbocyanine البركلورات) ، والذي يستخدم عادة في C. ايليجانس لتصور العصبونات المعرضة بيئيا. مع هذا البروتوكول الأمثل ، وجناح الكبير الملون والحلقي هياكل جليدية بواسطة الجاذبة ولاحظ باستخدام المجهر المركب.

الملخص

إهاب من C. ايليجانس هو بنية شديدة المقاومة التي تحيط الخارجي للحيوان 1-4. إهاب لا يحمي فقط من الحيوان والبيئة ، ولكن كما يحدد شكل الجسم ويلعب دورا في حراك 4-6. عدة طبقات يفرز من قبل خلايا البشرة تتكون من إهاب ، بما في ذلك طبقة الدهون الأبعد 7.

دعا التلال كفافي في إهاب للحلقة نمط طول الحيوان وموجودة في جميع مراحل التنمية 8. أجنحة هي التلال الطولية التي موجودة خلال مراحل معينة من التنمية ، بما في ذلك L1 ، dauer ، ومراحل البالغين 2،9. يمكن أن الطفرات في الجينات التي تؤثر على المنظمة جليدية تغيير بنية الكولاجين جليدية والحيوان التشكل 5،6،10،11 الجسم. بينما التصوير المجهري باستخدام جليدية مجمع مدينة دبي للإنترنت مع البصريات هو ممكن ، الطرق الحالية التي تبرز هياكل جليدية تشمل fluores12 في المائة التحوير التعبير ، وتلطيخ الضد 13 ، والمجهر الإلكتروني 1. جرثومة القمح المسمى راصة (WGA) كما تم استخدامها لتصور جليكوبروتينات جليدية ، ولكن محدودة في حل هياكل جليدية الدقيقة 14. وقد لوحظ تلون سطح جليدية باستخدام صبغة الفلورسنت ، ولكن لم تتميز بالتفصيل 15. نقدم طريقة لتصور العيش في C. إهاب ايليجانس باستخدام صبغ أحمر فلوري محبة للدهون الجاذبة (1،1 '- dioctadecyl - 3 ، 3،3' ، 3' - tetramethylindocarbocyanine البركلورات) ، والذي يستخدم عادة في C. ايليجانس الخلايا العصبية لتصور المعرضة بيئيا. هذا البروتوكول الأمثل لتلطيخ الجاذبة هو بسيط ، طريقة قوية لرؤية ارتفاع القرار من الفلورسنت للحلقة ، جناح الكبير والفرج ، وذيل الذكور ، وارتفاع الذيل خنثى في C. ايليجانس.

البروتوكول

1. إعداد صلاح الغيدان وصمة عار

  1. يعد حل سهم الجاذبة ملغ / مل 20 (Biotium ، شركة ، هايوارد ، كاليفورنيا) في DMF. صلاح الغيدان هو الضوء الحساسة وحمايتها حتى من الضوء الجاذبة التي التفاف في احباط.
  2. إنشاء تخفيف العمل الجاذبة بإضافة 0،6 الأسهم الجاذبة ميكرولتر إلى 399.4 M9 ميكرولتر لكل السكان. هذا يجب أن تعطي تخفيف العمل النهائية من 30 ميكروغرام / مل الجاذبة في M9. يمكن زيادتها لتصل هذه تلطيخ السكان متعددة في وقت واحد. درع الجاذبة من الضوء التفاف الأنبوب (ق) في احباط.

2. إعداد النيماتودا

  1. استخدام لوحة 60 ملم تحتوي على عدد سكان الديدان الخيطية غير ملوثة. غسل الحيوانات من لوحة باستخدام حل تريتون 0.5 ٪ X - 100 في M9 العازلة التي يحوم السائل بلطف في حركة دائرية على سطح اللوحة لتخفيف جميع الحيوانات اليرقات وتعليم الكبار. يغسل نقل في أنبوب معقم مل 1.5.
  2. تدور على الفور من الحيوانات عند 2000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. إزالة والتخلص من أكبر قدر سوبernatant ممكن من دون إزعاج كتلة الحيوانات في قاع الأنبوب.
  3. للحد من تريتون المتبقية X - 100 ، شطف الحيوانات باستخدام M9 العازلة ، وتدور ، وإزالة طاف. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
  4. إضافة 400 ميكروليتر من محلول الجاذبة العاملة في M9 في أنبوب لفترة وجيزة إلى دوامة resuspend الحيوانات في الحل.
  5. هز أنبوب عند 20 درجة مئوية لمدة 3 ساعات أفقيا في 350 دورة في الدقيقة في بيئة محمية الضوء. إذا رغبت في ذلك ، يمكن المحتضنة الحيوانات تصل إلى 16 ساعة للتلوين.
  6. لتقليل كمية من الصبغة غير منضم ، وتدور باستمرار على الحيوانات في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 20 ثانية. إزالة وتجاهل وطاف أكبر قدر ممكن من دون إزعاج كتلة الحيوانات.
  7. Resuspend الحيوانات في 400 العازلة M9 ميكرولتر وسكب السائل على جزء البكتيريا خالية من طبق آغار NGM المصنف مع E. OP50 القولونية. سماح للحيوانات لاسترداد ما لا يقل عن 30 دقيقة. خلال فترة الانتعاش ينبغي أن الحيوانات الزحف بعيدا عن السائل تلطيخ الجاذبة وعلى الطعام. هذه الخطوةمضان الخلفية يقلل من الجاذبة الحرة.

3. تصاعد ومراقبة العينات

  1. آغار تذوب في الماء 4 ٪ باستخدام الأوتوكلاف أو ميكروويف.
  2. إنشاء الفواصل التي يعاد استخدامها ، والتي يمكن استخدامها لضمان سمك موحد لوحة آغار ، من خلال طبقات قطعتين من الشريط مختبر على شريحة زجاجية. هل جعل الشرائح two الإجمالي.
  3. ترتيب شريحة زجاجية نظيفة بين الشرائح هل اثنين. ماصة حوالي 150 ميكروليتر (أربع نقاط) من 4 ٪ المنصهر أغار على مركز للشريحة زجاجية نظيفة. تغطية بسرعة آغار المنصهر باستخدام شريحة إضافية لتشكيل لوحة آغار. إزالة الغطاء بعناية الشريحة ، والحفاظ على وسادة تركز على الجزء العلوي من الشريحة المتزايدة.
  4. ماصة حوالي 5 ميكرولتر من مخدر الخيطية (100 ميكرون -- 1 levamisole ملم ، على سبيل المثال) على وسادة.
  5. جبل 8-12 الحيوانات في التخدير ، وتغطي مع ساترة المجهر.
  6. مراقبة الحيوانات باستخدام المجهر المركب أو مبائر مزودة objecti على الأقل 40X لقد وDSRed / TRITC (أو غيرها متوافق) التصفية. الحد الأقصى من الإثارة مضان الجاذبة هو 549 نانومتر ، والحد الأقصى من الانبعاثات هو 565 نانومتر لصبغ منضم (Biotium ، شركة ، هايوارد ، كاليفورنيا).

4. ممثل النتائج

البقع الجاذبة للبشرة من نوع جيم البرية ومتحولة ايليجانس. دعا التلال طولية جليدية على سطح يحتوي على فصل للحلقة التي الأخاديد وكفافي ، في بعض المراحل ، جناح الكبير. كل مرحلة تنموية وهياكل جليدية مع تركيبات مختلفة 2. التلال أو الأخاديد كل من أجنحة وصمة عار للحلقة fluorescently ، اعتمادا على تكوين سطح ، طوال مراحل اليرقات والكبار وتبقى مرئية حتى بعد يوم من استرداد باستخدام هذا الأسلوب. ولوحظت بقع الفلورسنت الخلفية في بعض الأحيان (أرقام 2F ، G) ، ولكن ليس بشكل روتيني. (الشكل 1 ، الشكل 2A - E ، H ، I) وقد اتخذت كافة الصور مع مبائر القرص أو الغزل ، وعندما لاحظت ، widefield المجهر المركب (WF).

الأنف والحنجرة "> الشكل 1
الشكل 1. البقع الجاذبة بشرة والخلايا العصبية المعرضة بيئيا. L2 المرحلة الحيوانية. 630x التكبير. تم القبض على قطع الفسيفساء باستخدام صورة iVision ماك البرمجيات (BioVision تكنولوجيز ، إكستون ، والسلطة الفلسطينية). وانضم الصور باستخدام أدوبي فوتوشوب CS3 ​​(أدوبي سيستمز ، سان خوسيه ، كاليفورنيا). شريط النطاق = 10 ميكرون. الجاذبة أيضا fluorescently البقع والخلايا العصبية الحسية amphid فصمية في الرأس والذيل على التوالي (سهام علامة بعض).

الشكل 2
الشكل 2. الجاذبة البقع fluorescently جيم ايليجانس جليدة في جميع مراحل تطور الجنين في مرحلة ما بعد. 630x التكبير. شريط النطاق = 10 ميكرون. تلون من النوع البري والحيوانات في L1) ؛ ب) L2 ، C) dauer ؛ D) L3 ؛ E) L4 ، وF) في المراحل الكبار. هي ملطخة fluorescently التلال أجنحة والحلقي في الحيوانات وL1 dauer (A ، C). بقع التلال الحلقي الجاذبة في الحيوانات L2(B). الحلقي الأخاديد وصمة عار في L3 L4 والحيوانات (D ، E). في الأخاديد من جناح الكبير والملون للحلقة في الحيوانات الكبار (FH). وتتكون من اثنين من أجنحة التلال الخمس ، أو ثلاث ، (في L1 ، dauer ، أو الحيوانات البالغة على التوالي) ، التي تعمل على طول الحيوان (الأسهم) 16. للحلقة خلق التلال كفافي حول الحيوانية (النصال وواو وياء). إهاب الحيوانات طافرة الكبار العرض المعتدلة عيوب المنظمة جليدية (GH). G) ومرتفعات من أجنحة متقطعة (WF). H) وتنصهر التلال أجنحة الزائدين ومتشعبة متفرعة أو (WF). المسوخ الجين الكولاجين المعرض أجنحة وعيوب التنظيم الحلقي (IJ). I) في الحيوانات المعدلة وراثيا overexpressing pRF4 (رول - 6 (su1006)) ، التلال تكمن جناح الكبير في زاوية لطول الحيوان. J) للحلقة المعدلة وراثيا في pRF4 overexpressing الحيوانات (رول - 6 (su1006)) عرض على نمط منتظم.

الشكل 3
الشكل 3. خارجيهي مضيئة بن هياكل شكلية بواسطة تلطيخ الجاذبة. 630x التكبير. أشرطة النطاق = 10 ميكرون. الجاذبة كما يبرز المزايا الخارجية الأخرى ، بما في ذلك A) أشعة الكبار الكبار خنثى الفرج ، B) ومروحة الذيل الذكور ، وجيم). خنثى ارتفاع الذيل (متشعب في هذه الخلفية متحولة)

الشكل 4
الشكل 4. البشرة وقتا أطول لطخه مع صلاح الغيدان من الخلايا العصبية المعرضة بيئيا. 630x التكبير. شريط النطاق = 10 ميكرون. بعد ساعتين من تلطيخ ، ملطخة بما فيه الكفاية amphid (لا يظهر) والخلايا العصبية الحسية فصمية (الأسهم). في المقابل ، إهاب الأصغر سنا حيوانات ليست سوى جزئيا في بقع ملطخة (رأس السهم).

غسل وصمة عار حل (+ الجاذبة) حضانة الوقت بشرة ملون
M9 آر + 0.5 ٪iton X - 100 M9 تريتون + 0.5 ٪ X - 100 2 ساعات لا
M9 تريتون + 0.5 ٪ X - 100 M9 تريتون + 0.5 ٪ X - 100 3 ساعات لا
M9 تريتون + 0.5 ٪ X - 100 M9 2 ساعات جزئي
M9 تريتون + 0.5 ٪ X - 100 M9 3 ساعات نعم
M9 تريتون + 0.5 ٪ X - 100 H 2 0 2 ساعات جزئي
M9 تريتون + 0.5 ٪ X - 100 H 2 0 3 ساعات نعم

الجدول 1. تم اختبار تلطيخ جليدية تحت ظروف مختلفة. حضانة حلول مختلفة ومرات لتحسين تلطيخ جليدية في الحيوانات. H 2 0 ، ماء مقطر معقم. تلطيخ جزئية تشير تلطيخ متفاوتة من إهاب اليرقات (الشكل 4) ، على الرغم من البقع بشرة الكبار جonsistently.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

طريقة تلوين الجاذبة المقدمة هنا يسمح للطريقة سريعة ومريحة نسبيا لتصور في إهاب ايليجانس جيم. بواسطة repurposing وتحسين طريقة تستخدم عادة لصورة الخلايا العصبية الحسية 15،17 المعرضة بيئيا ، يمكن أن تستخدم لصبغ الجاذبة fluorescently كلا أجنحة وهياكل حلقية (الشكلان 1 و 2) ، فضلا عن الفرج ، وذيل الذكور ، وارتفاع الذيل خنثى (الشكل 3). لقد وجدنا أن الحل الحضانة والنفوذ الوقت قدرة الجاذبة للبشرة وصمة عار على الدوام (الجدول 1 ، الشكل 4). طريقة لتلوين الخلايا العصبية الجا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

شكر وتقدير

نود أن نشكر S. تانيجا - Bageshwar ، Beifuss K. ، Kedroske S. ، والمراكز الصحية. هسياو للمناقشات مفيدة. وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق بدء الأموال من وزارة TAMHSC الطب الجزيئي والخلوي. تم شراؤها في نطاق المجمع والقرص الغزل مع الأموال المقدمة من قبل الدائرة ومكتب TAMHSC عميد. وقدمت بعض سلالات من قبل مركز علم الوراثة انواع معينة ، والذي يتم تمويله من قبل المركز الوطني لبحوث الموارد. وكان pRF4 (رول - 6 (su1006)) هدية من الحرائق أ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكواشف مرادفات شركة فهرس العدد تعليقات
صلاح الغيدان 1،1 '- Dioctadecyl - 3 ، 3،3' ، 3' - tetramethylindocarbocyanine بيركلورات Biotium ، وشركة 60010 الأسهم التخفيف :
20 ملغ / مل في DMF
تمييع العمل : 30 ملغ / مل
DMF ثنائي ميثيل الفورماميد سيغما الدريخ ، وشركة D4551
تريتون نصف إله عند الإغريق
X - 100 		Octylphenoxypolyethoxyethanol VWR الدولية ، ذ. EM - 9410
M9 22mm و KH 2 PO 4 ، 42mM نا 2 هبو 4 ، 86mM كلوريد الصوديوم ، 1MM MgSO 4
NGM الخيطية النمو المتوسطة المكافحة المتكاملة للآفات والعلم ، وشركة 11006-501 يمكن أن تكون مستعدة بعد بروتوكول آغار NGM 18
أجار أجار EMD كيماويات ، وشركة 1،01614 4 ٪ في الماء
Levamisole Levamisole هيدروكلوريد سيغما الدريخ ، وشركة 31742 100 ميكرون -- 1 ملي levamisole على النحو المطلوب
مجهر الشرائح VWR الدولية ، ذ. 16005-106
النظارات المجهر تغطية VWR الدولية ، ذ. 16004-302
مجمع نطاق كارل زايس ، وشركة A1m استخدام الأهداف لتلبية احتياجات التجربة
متوافق تصفية TRITC أو غيرها &نبسب ؛ صفاء شركة تكنولوجيا 49005 باءت بالفشل DSRed (TRITC/Cy3) تعيين مرشح -- ET

المراجع

  1. Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization. The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).
  2. Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S. The cuticle of Caenorhabditis elegans. II. Stage-specific changes in ultrastructure and protein composition during postembryonic development. Dev. Biol. 86, 456-470 (1981).
  3. Hall, D., Altun, Z. C. elegans Atlas. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  4. Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. The C. elegans Research Community. , WormBook. (2007).
  5. Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis. Cell. 55, 555-565 (1988).
  6. Mende, N. von, Bird, D. M., Albert, P. S., Riddle, D. L. dpy-13: a nematode collagen gene that affects body shape. Cell. 55, 567-576 (1988).
  7. Blaxter, M. L. Cuticle surface proteins of wild type and mutant Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 268, 6600-6609 (1993).
  8. Costa, M., Draper, B. W., Priess, J. R. The role of actin filaments in patterning the Caenorhabditis elegans cuticle. Dev. Biol. 184, 373-384 (1997).
  9. Sapio, M. R., Hilliard, M. A., Cermola, M., Favre, R., Bazzicalupo, P. The Zona Pellucida domain containing proteins, CUT-1, CUT-3 and CUT-5, play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol.. 282, 231-245 (2005).
  10. Johnstone, I. L. Cuticle collagen genes. Expression in Caenorhabditis elegans. Trends Genet. 16, 21-27 (2000).
  11. Kramer, J. M., French, R. P., Park, E. C., Johnson, J. J. The Caenorhabditis elegans rol-6 gene, which interacts with the sqt-1 collagen gene to determine organismal morphology, encodes a collagen. Mol. Cell Biol. 10, 2081-2089 (1990).
  12. Thein, M. C. Caenorhabditis elegans exoskeleton collagen COL-19: an adult-specific marker for collagen modification and assembly, and the analysis of organismal morphology. Dev. Dyn. 226, 523-539 (2003).
  13. McMahon, L., Muriel, J. M., Roberts, B., Quinn, M., Johnstone, I. L. Two sets of interacting collagens form functionally distinct substructures within a Caenorhabditis elegans extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 14, 1366-1378 (2003).
  14. Link, C. D., Ehrenfels, C. W., Wood, W. B. Mutant expression of male copulatory bursa surface markers in Caenorhabditis elegans. Development. 103, 485-495 (1988).
  15. Tong, Y. G., Burglin, T. R. Conditions for dye-filling of sensory neurons in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Methods. 188, 58-61 (2010).
  16. Singh, R. N., Sulston, J. E. Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans. Nematologica. 24, 63-71 (1978).
  17. Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 148, 187-200 (1998).
  18. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

قشيرة C. elegansصبغ DiIصبغة فلوريةتصوير القشيرةصبغ الديدان الخيطيةالحلقات والأجنحةمجهر الفلورةصبغة محبة للدهونبنية القشيرةالتصوير الحي
تصور انواع معينة ايليجانس استخدام الصبغة الحيوية محبة للدهون ، صلاح الغيدان
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.