يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل LacZ - معربا عن خلايا من أنسجة الأذن الداخلية باستخدام الماوس التدفق الخلوي

11.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/3432

⸱

ديسمبر 23, 2011

 ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Stanford University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يُعد قياس التدفق الخلوي أداة قوية تتيح عزل ودراسة مجموعات خلوية محددة. يصف هذا البروتوكول خطوات عزل الخلايا التي تعبر عن LacZ من أنسجة القوقعة في الفئران المعدلة وراثياً حديثة الولادة. وقد تم وسم خلايا القوقعة المفككة باستخدام ركائز مقترنة بفلوروكوم في إنزيم β-galactosidase قبل عملية الفصل عن طريق قياس التدفق الخلوي.

الملخص

يتيح عزل أنواع محددة من الخلايا تحليل المجموعات الخلوية النادرة مثل الخلايا الجذعية/السلفية. ويطرح هذا النهج في دراسة أنسجة الأذن الداخلية تحدياً فريداً بسبب ندرة الخلايا المستهدفة وقلة نماذج الفئران المعدلة وراثياً التي تحمل بروتينات مبلّغة. نصف هنا بروتوكولاً يستخدم مسابير مقترنة بالفلورسنت لوسم الخلايا الإيجابية لـ LacZ بشكل انتقائي من القوقعة في حديثي الولادة.

تتمثل الحالة المرضية الأساسية الأكثر شيوعاً لفقدان السمع الحسّي العصبي في التلف غير القابل للعلاج وفقدان الخلايا الشعرية الحسية القوقعية، وهي الخلايا الضرورية لتحويل الموجات الصوتية إلى نبضات عصبية. وتشير الأدلة الحديثة إلى أن الأعضاء السمعية والدهليزية لدى الفئران تحتوي على خلايا جذعية/سلفية قد تمتلك قدرة تجديدية1,2. وتستوجب هذه النتائج إجراء المزيد من الاستقصاءات، بما في ذلك تحديد أنواع خلوية محددة تتميز بخصائص الخلايا الجذعية/السلفية. وقد ثبت أن مسار إشارات Wnt يلعب دوراً حاسماً في الحفاظ على مجموعات الخلايا الجذعية/السلفية في العديد من أجهزة الجسم3-7. وقد حددنا مؤخراً خلايا تعبر عن Axin2 وتستجيب لـ Wnt في القوقعة لدى حديثي الولادة، ولكن وظائف هذه الخلايا لا تزال غير معروفة إلى حد كبير8.

لفهم سلوك هذه الخلايا المستجيبة لـ Wnt بشكل أفضل in vitro، قمنا بتطوير طريقة لعزل الخلايا التي تعبر عن Axin2 من القوقعات الخاصة بفئران مراسلة Axin2-LacZ9. وباستخدام قياس التدفق الخلوي لعزل الخلايا الموجبة لـ Axin2-LacZ من القوقعات حديثة الولادة، تمكنا بدورنا من إجراء مجموعة متنوعة من التجارب على الخلايا الحية لاستقصاء سلوكها كخلايا جذعية/سليفة. ونصف هنا بالتفصيل خطوات التشريح المجهري للقوقعة حديثة الولادة، وتفكيك هذه الأنسجة، ووسم الخلايا الموجبة لـ LacZ باستخدام ركيزة مولدة للفلورة، وفرز الخلايا. وقد سبق وصف تقنيات تفكيك القوقعات إلى خلايا مفردة وعزل خلايا القوقعة عبر قياس التدفق الخلوي2,10-12. وقد أجرينا تعديلات على هذه التقنيات لوضع بروتوكول جديد لعزل الخلايا التي تعبر عن LacZ من القوقعة حديثة الولادة.

البروتوكول

1. التشريح المجهري للقوقعة

  1. تجهيز مجهر التشريح تحت غطاء التدفق الصفحي عن طريق مسح الأسطح بـ 70% ethanol ووضع قوالب الثلج.
  2. تجهيز 10-15 طبق بتري مقاس 35 mm تحت ظروف معقمة وملء نصفها (~2 ml) بمحلول الأملاح المتوازن لهانكس مع الكالسيوم (HBSS) المعقم.
  3. تجهيز طبقين بتري مقاس 35 mm تحت ظروف معقمة وملء نصفهما (~2 ml) بمحلول الفوسفات المنظم (PBS) المعقم بتركيز 1x.
  4. تعقيم الملاقط الدقيقة في أنبوب Falcon مخروطي سعة 50 ml يحتوي على 70% ethanol.
  5. في غرفة منفصلة عن غطاء التعقيم، استخدم مقص القزحية لقطع رؤوس 12-15 فأراً من سلالة Axin2LacZ/+ المبلّغة، بعمر 0-3 أيام بعد الولادة (P)، وضع الرؤوس في طبق بتري مقاس 60 mm فوق قالب ثلج.
  6. باستخدام ملاقط Dumont رقم 5 ومقص القزحية، يتم استئصال الفك السفلي واللسان، والقطع عبر قاعدة الجمجمة عند مستوى الحنك.
  7. إزالة الجلد الذي يغطي القحف وقطع قاعدة الجمجمة عن طريق إدخال المقص من الجزء السفلي للثقبة العظمى وصولاً إلى منتصف الحنك.
  8. إجراء شق آخر بمقص القزحية من الحافة المقطوعة للحنك إلى الجانب العلوي من القحف على كلا الجانبين، مع الحرص على عدم إتلاف المحفظة الأذنية.
  9. إتمام عزل العظم الصدغي عن طريق إجراء شقين بزاوية 45 درجة بدءاً من الجانب العلوي للثقبة العظمى وصولاً إلى القطع الإكليلي عند الحنك الصلب.
  10. وضع العظام الصدغية المعزولة في أطباق بتري مقاس 35 mm تحتوي على HBSS فوق قالب ثلج.
  11. جمع العظام الصدغية من حوالي 12-15 حيواناً تم التضحية بها، ليكون الإجمالي 24-30 عظماً صدغياً.
  12. نقل طبق بتري الذي يحتوي على العظام الصدغية المعزولة إلى غطاء التشريح المعقم الذي تم تجهيزه مسبقاً (1.1).
  13. نقل أربعة عظام صدغية إلى كل طبق بتري مقاس 35 mm مجهز مسبقاً ويحتوي على HBSS (1.2) ووضعها فوق قالب ثلج.
  14. بدء التشريح الدقيق باستخدام ملقطين رقم 55 لإزالة القشرة وجذع الدماغ والمخيخ بلطف من العظم الصدغي الذي يغطي المحفظة الأذنية.
  15. بدون إزالة المحفظة الأذنية، يتم إزالة أجزاء من المحفظة القوقعية بدءاً من مدخل العصب الدهليزي القوقعي إلى المحفظة الأذنية.
  16. بعد كشف قاعدة القوقعة، يتم سحب القوقعة والأنسجة المحيطة بها بلطف. ثم تتم إزالة أي جزء متبقٍ من العقدة الحلزونية والشريط الوعائي بدءاً من القاعدة.
  17. نقل القوقعة إلى طبق بتري مقاس 35 mm يحتوي على PBS فوق قالب ثلج.
  18. لضمان الحيوية المثلى للأنسجة، يجب أن يكون الوقت الإجمالي للتشريح أقل من 60 min.
  19. تكرار الخطوات المذكورة أعلاه لـ 3-5 فئران من النوع البري (WT) بعمر P0-P3 كضوابط لفئران Axin2-LacZ.

2. تفكيك الخلايا (معدل عن الطرق الموصوفة سابقاً)2,10

  1. ضع 50 μl من محلول PBS المعقم في مركز بئر في طبق زراعة غير مطلي يحتوي على 6 آبار.
  2. انقل ما يصل إلى 20 قوقعة Axin2LacZ/+ إلى كل قطرة 50 μl من محلول PBS. يجب استخدام قطرة 50 μl جديدة من محلول PBS لكل مجموعة إضافية تزيد عن 20 قوقعة.
  3. قم بتدفئة مسبقة لحصص مقدارها 50 μl من التريبسين بتركيز 0.125% لمدة ~2 دقيقة في حمام مائي عند درجة حرارة 37°C.
  4. أضف 50 μl من التريبسين بتركيز 0.125% المُدفأ مسبقاً إلى محلول PBS الذي يحتوي على القواقع.
  5. ضع طبق الـ 6 آبار عند درجة حرارة 37°C لمدة 8 دقائق، مع الحرص على عدم هز الطبق.
  6. لإيقاف عملية التريبسين، أضف 50 μl من مثبط تريبسين فول الصويا إلى كل قطرة بحجم 100 μl.
  7. أضف 50 μl إضافية من الوسط الكامل (FM) (IGF-1 وEGF وbFGF وHS وأمبيسيلين في DMEM/F12)2
  8. باستخدام طرف ماصة غير حاد سعة 300 μl مع ماصة p200 مضبوطة على 125 μl، قم بتفتيت الخلايا برفق 80 مرة، مع الحرص على عدم تكوين فقاعات.
  9. بعد تفتيت كل قطرة، أضف 200 μl إضافية من الـ FM إلى كل بئر.
  10. مرر الخلايا عبر مصفاة خلايا Falcon الزرقاء بمسام 40 μm إلى بئر جديد.
  11. انقل الخلايا إلى أنابيب FACS قياسية من نوع Falcon (يتبقى حوالي 300 μl بعد التفتيت والترشيح).
    1. قسم الخلايا المستخلصة من قواقع النوع البري (wildtype) إلى ثلاثة أنابيب، مع تخفيف 100 μl باستخدام 300 μl من الـ FM في كل أنبوب. سيُستخدم أنبوب واحد كعينة تحكم فارغة، وسيتم صبغ أنبوب واحد بـ يوديد البروبيديوم (PI، بتركيز 1 μg/ml) فقط (لا يُضاف في هذه الخطوة)، بينما سيتم صبغ الأنبوب الأخير بـ 3-carboxyumbelliferyl β-D-galactopyranoside (CUG، انظر 2.15) للكشف عن الفلورة الخلفية.
    2. ضع 400 μl من الخلايا المفككة من قواقع Axin2-LacZ في كل أنبوب FACS. وكعينة تحكم بـ CUG فقط، خفف 10 μl من الخلايا في 390 μl من الـ FM (انظر الأنبوب F في الخطوة 2.15). أكمل حجم أي أنابيب متبقية إلى 400 μl.
  12. حضن الخلايا في حضانة رطبة عند درجة حرارة 37°C لمدة 10 دقائق.
  13. قم بتحضير محلول CUG:
    1. حضّر 200 μl من CUG لكل أنبوب FACS يتطلب الصبغ.
    2. خفف CUG في FM بنسبة 1:50 تحت غطاء سحب دخان مظلم مع تقليل التعرض للضوء إلى أدنى حد.
    3. قم بتدفئة CUG المخفف مسبقاً عند 37°C لمدة 3-5 دقائق.
  14. بعد ذلك، أضف 200 μl من CUG المخفف إلى كل أنبوب FACS مناسب. وبالنسبة للأنابيب غير المخصصة لإضافة CUG، أضف FM فقط (انظر 2.15).
  15. في هذه المرحلة، يجب أن يكون هناك خمس فئات من الأنابيب بالمحتويات التالية (لا تضف PI في هذه الخطوة):
    1. النوع البري - بدون CUG أو PI (من أجل التعويض، انظر الخطوات 3.5-6)
    2. النوع البري - مع PI فقط (من أجل التعويض)
    3. النوع البري - مع CUG وPI (كعينة تحكم مقابل خلايا Axin2-LacZ)
    4. Axin2-LacZ - مع CUG فقط (من أجل التعويض)
    5. Axin2-LacZ - مع CUG وPI (لفرز الخلايا الفعلي)
    6. Axin2-LacZ - مع CUG وPI (لتحليل الأحداث)
  16. احمِ جميع الأنابيب من الضوء واحضنها في حضانة رطبة عند درجة حرارة 37°C لمدة 25 دقيقة.
  17. حضّر محلول HEPES + مصل بقري جنيني (FBS) طازج لإيقاف التفاعل بعد التحضين:
    1. خفف 400 μl من FBS المذاب حديثاً في 10 ml من محلول HEPES المعقم بتركيز 10 mM (في PBS) في أنبوب Falcon سعة 15 ml.
    2. ضع الأنبوب على الثلج حتى اكتمال الخطوة 2.16.
  18. أضف 1.8 ml من محلول HEPES المبرد بالثلج إلى كل أنبوب FACS تحت غطاء سحب دخان معقم مع إطفاء الأنوار لتقليل التعرض للضوء.
  19. قم بطرد الخلايا مركزياً بسرعة 1200rpm لمدة 5 دقائق.
  20. أزل السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 300 μl من الـ FM، واجمع كل الحصص لعينة الفرز (Axin2-LacZ المصبوغة بـ CUG وPI).
  21. أضف PI إلى كل أنبوب للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1 μg/ml.
  22. ضع الخلايا على الثلج واحمهِا من الضوء.

3. قياس التدفق الخلوي

  1. نستخدم جهاز BD Aria II مجهزاً بأجهزة ليزر بطول موجي 488-nm و 633-nm و 407-nm. تم الكشف عن CUG باستخدام الليزر البنفسجي 407-nm، والكشف عن PI باستخدام الليزر الأزرق 488-nm في مرفق Stanford Shared FACS.
  2. يتطلب الأمر مشغلاً مدرباً على جهاز قياس التدفق الخلوي. انتقل إلى الخطوة التالية بعد تسخين أجهزة الليزر، ومعايرة كواشف جهاز قياس التدفق الخلوي وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، وضبط معلمات الفرز المثلى. ومن خلال خبرتنا، وجدنا أن استخدام فوهة بحجم 100 μm يحسن من حيوية الخلايا للتجارب اللاحقة.
  3. تم استخدام المعلمات التالية: حد العتبة عند 5,000 حدث، ومعدل تدفق أقل من 3,000 حدث/ثانية، والتشتت الأمامي (FSC) عند 125 فولت والتشتت الجانبي (SSC) عند 250 فولت، واستُخدمت قناة PE-Cy5 لـ PI وقناة Cascade Blue لـ CUG.
  4. قم بشطف غرفة جهاز قياس التدفق الخلوي بـ 70% ethanol و PBS مرتين لكل منهما بهذا الترتيب.
  5. ابدأ التحليل باستخدام خلايا النوع البري غير المصبوغة (الأنبوب A في الخطوة 2.15). اجمع 1,000 حدث لتحديد توزيع الخلايا على مخطط FSC مقابل SSC. إذا لم يكن التشتت مرغوباً، فقم بتعديل معلمات FSC و SSC.
  6. أجرِ عملية التعويض باستخدام خلايا النوع البري غير المصبوغة (الأنبوب A)، وخلايا النوع البري المصبوغة بـ PI (الأنبوب B)، وخلايا Axin2-LacZ المصبوغة بـ CUG (الأنبوب D). سيتيح التعويض تمييزاً أكثر دقة للإشارات بين أطوال موجات الليزر المختلفة.
  7. ابدأ التحليل باستخدام خلايا النوع البري المصبوغة بـ PI و CUG (الأنبوب C) واضبط معلمات البوابات (gating parameters) لـ:
    1. استبعاد الحطام بناءً على مخطط FSC مقابل SSC.
    2. استبعاد الثنائيات (doublets) والتجمعات باستخدام مخطط FSC-height مقابل FSC-area.
    3. استبعاد الخلايا الميتة بناءً على مخطط FSC-area مقابل PE-Cy5-area.
    4. إعداد مخطط FSC-area مقابل Cascade Blue-area مع وضع أي بوابة.
  8. بعد ذلك، حلل 10,000 حدث من أنبوب عينة الفرز الذي يحتوي على خلايا Axin2-LacZ المصبوغة بـ PI و CUG (الأنبوب F).
    1. يجب تطبيق جميع البوابات التي تم ضبطها باستخدام خلايا النوع البري هنا.
    2. باستخدام مخططات خلايا النوع البري، أنشئ بوابات للخلايا ذات الفلورة العالية لـ Cascade Blue (Cascade Blue-high) بحيث تمثل أقل من 1% من إجمالي عدد الأحداث.
    3. هذه البوابات نفسها للخلايا عالية Cascade Blue تشمل الآن حوالي 15-20% من الخلايا في عينة Axin2-LacZ، مما يجعل هذه الخلايا عالية التعبير عن Axin2 (Axin2-high).
    4. باستخدام مخطط تحليل خلايا Axin2-LacZ، أنشئ بوابة لأقل 15-20% من الخلايا من حيث الفلورة، والتي ستسمى من الآن فصاعداً خلايا منخفضة التعبير عن Axin2 (Axin2-low).
  9. بناءً على استراتيجية تحديد البوابات المذكورة سابقاً، افرز الخلايا في أنابيب FACS تحتوي على 500 μl FM، أنبوب واحد لخلايا Axin2-high والآخر لخلايا Axin2-low. تأكد من وضع أنابيب الجمع في غرفة مبردة عند 4°C أثناء عملية الفرز.
  10. سجل عدد الخلايا التي تم عدها بواسطة جهاز قياس التدفق الخلوي لكل مجموعة خلوية.

4. النتائج التمثيلية (انظر الشكل 2):

باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه، نستعيد عادةً 40-45% من الخلايا الخالية من الحطام من القوقعتين في كل من النوع البري و Axin2LacZ/+ (الشكلان 2A و B)، مع خلو حوالي 70% منها من الأزواج الخلوية (انظر الشكلين 2A' و B'). معظم الخلايا المفرزة كانت حيوية ولم تمتص PI (~95%) (الشكلان 2A'' و B''). في المتوسط، تُعتبر أعلى ~20% من الخلايا الموجبة لـ CUG خلايا موجبة لـ Axin2-LacZ (الشكل 2B''')، وهو ما يعادل حوالي 15,000 خلية ذات تعبير عالٍ لـ Axin2-LacZ لكل 10-12 حيواناً.

كشف تحليل إعادة الفرز باستخدام قياس التدفق الخلوي للخلايا ذات التعبير العالي عن Axin2 عن نقاوة تزيد عن 93% في قناة Cascade Blue. ومن أجل المزيد من التأكيد على هوية هذه الخلايا، أجرينا صبغاً مناعياً بعد الفرز لكل من الخلايا ذات التعبير العالي عن Axin2 والخلايا ذات التعبير المنخفض عن Axin2 باستخدام أجسام مضادة لـ β-galactosidase، ووجدنا أن الخلايا ذات التعبير العالي عن Axin2 احتوت على ~93.4% من الخلايا الموجبة لـ β-galactosidase (تم تحليل أكثر من 1,500 خلية) وأن الخلايا ذات التعبير المنخفض عن Axin2 احتوت على ~4.8% من الخلايا الموجبة لـ β-galactosidase.

الأشكال والجداول:

عملية عزل القوقعة ووسم LacZ؛ مخطط تحليل قياس التدفق الخلوي.
الشكل 1. النموذج التجريبي. يوضح الشكل أعلاه الاستراتيجية التجريبية العامة والتقنيات كما هو موضح في قسم البروتوكول. يتم حصاد القواقع من الفئران من النوع البري وفئران Axin2LacZ/+ وتفكيكها إلى خلايا مفردة، والتي عولجت بعد ذلك باستخدام CUG، وهو مادة ركيزة فلورية لإنزيم β-galactosidase. ثم تم فصل الخلايا ذات التعبير العالي والمنخفض لـ Axin2-LacZ عن طريق قياس التدفق الخلوي. انقر هنا لعرض نسخة بالحجم الكامل من هذه الصورة.

مخططات تشتت قياس التدفق الخلوي، النوع البري مقابل Axin2-lacZ، الحطام، الثنائيات، الحيوية، تحليل LacZ.
الشكل 2. استراتيجيات تحديد البوابات (Gating Strategies). يوضح هذا الشكل استراتيجيات تحديد البوابات المستخدمة في قياس التدفق الخلوي. أ) يتم هنا تحليل الخلايا المفككة من النوع البري التي خضعت لنفس المعاملة التي تعرضت لها خلايا Axin2-LacZ باستخدام إجمالي 10,000 حدث. توضح اللوحة الأولى منطقة التشتت الجانبي (SSC-A) مقابل منطقة التشتت الأمامي (FSC-A). هنا، تظهر مجموعة متميزة من الأحداث بحجم أكبر بكثير من تلك الأحداث القريبة من المحور y، وتسمى هذه الأحداث "سالبة الحطام" (Debris Negative). تقوم البوابة التالية، 'A، بتحليل خلايا "سالبة الحطام" من اللوحة A، والتي تمثل 43.8% من إجمالي عدد الأحداث (انظر الجدول أدناه). في هذه اللوحة، يُستخدم ارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H) مقابل FSC-A لاستبعاد الثنائيات (doublets)، حيث يتم استبعاد الأحداث التي تنحرف عن الطبيعة الخطية المتوقعة للمخطط. ينتج عن هذا التحضير عادةً حوالي 70% من الأحداث داخل البوابة المحددة، ويتم استبعاد الخلايا المتبقية. في اللوحة ''A، يُستخدم يوديد البروبيديوم (PI)، كما يتم الكشف عنه بواسطة قناة PE-Cy5، لوسم الخلايا الميتة (5.3%). في اللوحة التالية ('''A)، تُستخدم قناة Cascade blue للكشف عن الركيزة الفلورية CUG، وهنا تشمل بوابات LacZ-high أقل من 1% من إجمالي الأحداث. ب) يتم هنا تحليل الخلايا المفككة من فئران Axin2-LacZ المعالجة بـ CUG وPI باستخدام إجمالي 10,000 حدث. يتم تطبيق بوابات مطابقة لتلك الموجودة في اللوحة A هنا. تظهر 'B أن 29.5% من الخلايا استُبعدت كثنائيات، بينما توضح ''B أن 5.4% غير حيوية. تم رسم البوابات الأولية للخلايا ذات التعبير العالي (LacZ-high) والمنخفض (LacZ-low) باستخدام اللوحة '''B، حيث تم تعيين LacZ-high مبدئيًا بنسبة 19.7% وLacZ-low بنسبة 20.4%. انقر هنا لعرض نسخة كاملة الحجم من هذه الصورة.

  رقم الحدثنسبة مئوية
Aتحليل النوع البري10,000 
أ'خالٍ من الحطام4,38143.80%
أ''سالب المزدوج3,11671.10%
أ'''سالب لـ PI2,95194.70%
 عالية التعبير عن LacZ160.54%
 منخفض LacZ2,79094.50%
Bتحليل Axin2-LacZ10,000 
ب'خالٍ من الحطام4,21842.2%
ب''سالب المزدوج2,97370.50%
ب'''سالب PI2,81394.6%
 مستوى عالٍ من LacZ55319.70%
 منخفض LacZ57320.40%

الجدول 1. التحليلات الكمية لاستراتيجيات تحديد البوابات في الشكل 2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أوصفت دراسات بحثية مستقلة قدرة تجديدية محدودة داخل القوقعات حديثة الولادة2,10,12,13. وباستخدام فئران مُبلِّغة عن طريق GFP وقياس التدفق الخلوي، استخلص "وايت" وزملاؤه خلايا داعمة قوقعية محددة ووجدوا أنها تمتلك خصائص الخلايا السلفية12.

لقد ثبت أن مسار Wnt التقليدي يعمل كعلامة لمجموعات الخلايا الجذعية/السلفية في أنظمة أعضاء متعددة، بما في ذلك الدماغ، والغدة الثديية، والجهاز المكون للدم، والجلد، وخبايا الأمعاء في الجهاز الهضمي. وقد وجدت أعمال حديثة إشارات Wnt نشطة في مجموعة خل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نتوجه بالشكر إلى S. Heller و K. Oshima و R. Nusse و Y. Zeng على المناقشات المثمرة، وإلى C. Tang و A. Lee و E. Liaw وموظفي مرفق Stanford Shared FACS للمساعدة التقنية. تم دعم هذا العمل من خلال زمالة Howard Hughes Medical Institute للتدريب على البحوث الطبية، وبرنامج Stanford University Medical Scholars (كلاهما لـ T.A.J.)، وزمالة عميد جامعة Stanford (لـ R.C.)، و American Otological Society و Triological Society و Percy Memorial Award وصندوق Akiko Yamazaki and Jerry Yang Faculty Scholar، ومنحة NIDCD/NIH K08 DC011043 (جميعها لـ A.G.C.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طبق بتري، بوليسترين، معقم Geriner Bio-one 35 × 10 مم

VWR international82050-540

مصافي الخلايا BD Falcon، معقمة، BD Biosciences، زرقاء، 40 μمـ <بما أنك لم تقدم نصاً للمراجعة، يرجى تزويدي بالمحتوى الإنجليزي الذي ترغب في ترجمته إلى اللغة العربية، وسأقوم بصياغته بدقة علمية وأكاديمية وفقاً للمعايير المذكورة.>

VWR international21008-949

هانكس’ محلول ملحي متوازن (HBSS). محلول يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم، وخالٍ من الفينول الأحمر، معقم

VWR international45000-456

أنابيب طرد مركزي Cellstar، بولي بروبيلين، معقمة، greiner bio-one، 50 مل

VWR international82050-346

أنابيب طرد مركزي Cellstar، بولي بروبيلين، معقمة، greiner bio-one، ١٥ مل

VWR international82050-278

مكمل B-27 الخالي من المصل (50x)، سائل

Invitrogen17504-044

مكمل N-2 (١٠٠×)، سائل

Invitrogen17502-048

bFGF، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي البشري

Sigma-AldrichF0291

IGF-1، عامل النمو الشبيه بالإنسولين-1 من الفأر

Sigma-AldrichI8779

EGF، عامل نمو البشرة البشري <بـ>

Sigma-AldrichE9644

دولبيكو’وسط إيجل المعدل’وسط DMEM/Ham’مزيج F-12 50/50: تركيز 1X، مع L-Glutamine و15 ملي مولار من HEPES

VWR international45000-350

أنابيب BD Falcon ذات قاع مستدير، مخصصة للاستخدام مرة واحدة، بولي ستيرين، 12×75

VWR international60819-295<باء>

تريبسين، 0.25% (1X) مع EDTA 4Na، سائل

Invitrogen25200-056

رؤوس ماصات ep Dualfilter سعة 300 ميكرولتر، 960 رأساً<ب>

Eppendorf22491245

مثبط التريبسين، فول الصويا، منقى<بـ>

Worthington BiochemicalLS003570

مرشحات الخلايا BD Falcon بقطر 40 ميكرومتر

BD Biosciences21008-949

أطباق متعددة الآبار، بولي ستيرين، Greiner Bio-One، أطباق غير معالجة، 6 آبار

VWR international82050-846

مجموعة كشف إنزيم لاكتيز بيتا-جالاكتوزيداز (LacZ beta-Galactosidase) لـ Marker Gene FACS Blue<بسبب عدم وجود نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي الذي ترغب في ترجمته إلى العربية وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية المذكورة.>

تقنيات الجينات المَعلّمةM0255

المراجع

  1. Li, H., Liu, H., Heller, S. Pluripotent stem cells from the adult mouse inner ear. Nat. Med.. 9, 1293-1299 (2003).
  2. Oshima, K. Differential distribution of stem cells in the auditory and vestibular organs of the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 18-31 (2007).
  3. Barker, N. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
  4. Jaks, V. Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells. Nat. Genet. 40, 1291-1299 (2008).
  5. Kalani, M. Y. Wnt-mediated self-renewal of neural stem/progenitor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16970-16975 (2008).
  6. Willert, K. Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cell growth factors. Nature. 423, 448-452 (2003).
  7. Zeng, Y. A., Nusse, R. Wnt proteins are self-renewal factors for mammary stem cells and promote their long-term expansion in culture. Cell Stem Cell. 6, 568-577 Forthcoming.
  8. Chai, R. Dynamic Expression of Lgr5, a Wnt Target Gene, in the Developing and Mature Mouse Cochlea. J. Assoc. Res. Otolaryngol. , Forthcoming.
  9. Lustig, B. Negative feedback loop of Wnt signaling through upregulation of conductin/axin2 in colorectal and liver tumors. Mol. Cell Biol. 22, 1184-1193 (2002).
  10. Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 173-190 (2009).
  11. Savary, E. Cochlear stem/progenitor cells from a postnatal cochlea respond to Jagged1 and demonstrate that notch signaling promotes sphere formation and sensory potential. Mech. Dev. 125, 674-686 (2008).
  12. White, P. M., Doetzlhofer, A., Lee, Y. S., Groves, A. K., Segil, N. Mammalian cochlear supporting cells can divide and trans-differentiate into hair cells. Nature. 441, 984-987 (2006).
  13. Zhang, Y. Isolation, growth and differentiation of hair cell progenitors from the newborn rat cochlear greater epithelial ridge. J. Neurosci. Methods. 164, 271-279 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عزل أنسجة القوقعةتفكيك الأنسجةفرز الخلاياالوسم الفلوريصبغ يوديد البروبيديوممراسل Axin2-LacZقوقعة حديثة الولادة
عزل LacZ - معربا عن خلايا من أنسجة الأذن الداخلية باستخدام الماوس التدفق الخلوي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.