عزل LacZ - معربا عن خلايا من أنسجة الأذن الداخلية باستخدام الماوس التدفق الخلوي

ملخص

قياس التدفق الخلوي هو أداة قوية تسمح بعزل ودراسة مجموعات خلايا معينة. يصف هذا البروتوكول خطوات عزل الخلايا التي تعبر عن LacZ من أنسجة القوقعة الصناعية من الفئران المعدلة وراثيا حديثي الولادة. تم تصنيف خلايا القوقعة الصناعية المنفصلة باستخدام ركائز مترافقة بالفلورسنت من β-galactosidase قبل الفصل عن طريق قياس التدفق الخلوي.

الملخص

يسمح عزل أنواع معينة من الخلايا للمرء بتحليل مجموعات الخلايا النادرة مثل الخلايا الجذعية / السلفية. يمثل مثل هذا النهج لدراسة أنسجة الأذن الداخلية تحديا فريدا بسبب ندرة الخلايا ذات الأهمية وعدد قليل من نماذج الفئران المعدلة وراثيا. هنا ، نصف بروتوكولا يستخدم مجسات مترافقة بالفلورة لتسمية الخلايا الإيجابية ل LacZ بشكل انتقائي من قوقعة الأطفال حديثي الولادة.

أكثر الأمراض الأساسية شيوعا لفقدان السمع الحسي العصبي هو التلف الذي لا رجعة فيه وفقدان خلايا الشعر الحسية القوقعة الصناعية ، والتي تكون مطلوبة لتحويل الموجات الصوتية إلى النبضات العصبية. تشير الأدلة الحديثة إلى أن الأعضاء السمعية والدهليزية في الفئران تؤوي خلايا جذعية / سلفية قد يكون لها إمكانات التجدد^1،2. تستدعي هذه النتائج مزيدا من التحقيق ، بما في ذلك تحديد أنواع معينة من الخلايا ذات خصائص الخلايا الجذعية / السلفية. لقد ثبت أن مسار إشارات Wnt يلعب دورا مهما في الحفاظ على مجموعات الخلايا الجذعية / السلفية في العديد من أنظمة الأعضاء^3-7. لقد حددنا مؤخرا الخلايا التي تعبر عن Axin2 المستجيبة ل Wnt في قوقعة الأطفال حديثي الولادة ، لكن وظيفتها غير معروفة إلى حد كبير⁸.

لفهم سلوك هذه الخلايا المستجيبة ل Wnt في المختبر بشكل أفضل ، قمنا بتطوير طريقة لعزل الخلايا التي تعبر عن Axin2 من قوقعة الفئران Axin2-LacZ⁹. باستخدام قياس التدفق الخلوي لعزل الخلايا الإيجابية Axin2-LacZ من قوقعة الأطفال حديثي الولادة ، يمكننا بدورنا تنفيذ مجموعة متنوعة من التجارب على الخلايا الحية لاستجواب سلوكها كخلايا جذعية / سلف. هنا ، نصف بالتفصيل خطوات التشريح المجهري للقوقعة حديثي الولادة ، وتفكك هذه الأنسجة ، ووضع العلامات على الخلايا الإيجابية ل LacZ باستخدام ركيزة فلورية ، وفرز الخلايا. تم وصف تقنيات تفكيك القوقعة إلى خلايا مفردة وعزل خلايا القوقعة عن طريق قياس التدفق^{الخلوي 2،10-12}. لقد أجرينا تعديلات على هذه التقنيات لإنشاء بروتوكول جديد لعزل الخلايا التي تعبر عن LacZ من قوقعة الأطفال حديثي الولادة.

البروتوكول

1. التشريح المجهري للقوقعة

1. قم بإعداد مجهر تشريح تحت غطاء المحرك عن طريق مسح الأسطح بنسبة 70٪ من الإيثانول ووضع كتل الثلج.
2. قم بإعداد أطباق بتري مقاس 10-15 مقاس 35 مم في حالة معقمة واملأ نصف الطريق (~ 2 مل) بمحلول الملح المتوازن المعقم من هانك بالكالسيوم (HBSS).
3. قم بإعداد طبقين من بتري مقاس 35 مم في حالة معقمة واملأ منتصف الطريق (~ 2 مل) بمحلول معقم من الفوسفات 1x (PBS).
4. تعقيم الملقط الدقيق في أنبوب فالكون المخروطي سعة 50 مل مع 70٪ إيثانول.
5. في غرفة منفصلة عن الغطاء المعقم ، استخدم مقص القزحية لقطع رأس 12-15 بعد الولادة (P) من 0-3 أيام من الفئران البالغة من العمر 0-3 أيام ووضع الرؤوس على طبق بتري 60 مم على كتلة ثلجية.
6. باستخدام ملقط دومون # 5 ومقص القزحية ، قم باستئصال الفك السفلي واللسان وقطع قاعدة الجمجمة على مستوى الحنك.
7. قم بإزالة الجلد المغطى للكالفاريا وقم بتمرير قاعدة الجمجمة عن طريق إدخال المقص في الجزء السفلي من الثقبة العظمى إلى منتصف الحنك.
8. قم بعمل شق آخر بمقص القزحية من الحافة المقطوعة للحنك إلى الجانب العلوي من الكالفاريا على كلا الجانبين ، مع الحرص على عدم إتلاف كبسولة الأذن.
9. عزل كامل للعظم الصدغي عن طريق عمل شقين بزاوية 45 درجة بدءا من الجانب العلوي من الثقبة العظمى الممتد إلى القطع الإكليلي في الحنك الصلب.
10. ضع العظام الصدغية المعزولة في أطباق بتري 35 مم تحتوي على HBSS على كتلة ثلجية.
11. اجمع العظام الزمنية من حوالي 12-15 تم التضحية بها ، ليصبح المجموع 24-30 عظمة زمنية
12. انقل طبق بتري مع عظام الصدغية المعزولة إلى غطاء التشريح المعقم المعد مسبقا (1.1).
13. انقل أربع عظام زمنية إلى كل طبق بتري معد مسبقا مقاس 35 مم يحتوي على HBSS (1.2) وضعه على كتلة ثلجية.
14. ابدأ التشريح المجهري باستخدام ملقطين # 55 لإزالة القشرة وجذع الدماغ والمخيخ برفق في العظم الصدغي الذي يغطي كبسولة الأذن.
15. بدون إزالة الكبسولة الأذنية ، ابتعد عن أجزاء من كبسولة القوقعة الصناعية بدءا من مدخل العصب الدهليزي القوقعي في الكبسولة الأذنية.
16. بعد التعرض لقاعدة القوقعة ، اسحب القوقعة والأنسجة المحيطة بها برفق. قم بإزالة أي عقدة حلزونية متبقية والأوعية الدموية المخطط التي تبدأ من القاعدة.
17. انقل القوقعة إلى طبق بتري مقاس 35 مم يحتوي على PBS على كتلة ثلجية.
18. للحصول على بقاء الأنسجة المثلى ، يجب أن يكون الوقت الإجمالي للتشريح أقل من 60 دقيقة.
19. كرر الخطوات المذكورة أعلاه ل 3-5 فئران من النوع البري (WT) P0-P3 كعناصر تحكم للفئران Axin2-LacZ.

< p class = "jove_title" >2. تفكك الخلية (معدل من الطرق الموصوفة سابقا)^2،10

1. ضع 50 ميكرولتر من PBS المعقم في وسط البئر في طبق ثقافة غير مغلف مكون من 6 آبار.
2. انقل ما يصل إلى 20 Axin2^{LacZ / +} قوقعة في كل قطرة 50 ميكرولتر من PBS. يجب استخدام قطرة جديدة سعة 50 ميكرولتر من PBS لأكثر من 20 قوقعة.
3. قم بتسخين 50 ميكرولتر من 0.125٪ تربسين لمدة ~ 2 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
4. أضف 50 ميكرولتر من 0.125٪ تريبسين مسخن مسبقا إلى PBS الذي يحتوي على القوقعة.
5. ضع طبقا بسعة 6 آبار عند 37 درجة مئوية لمدة 8 دقائق ، مع الحرص على عدم رج الطبق.
6. لإنهاء التربسين ، أضف 50 ميكرولتر من مثبط التربسين من فول الصويا إلى كل قطرة 100 ميكرولتر.
7. أضف 50 ميكرولتر إضافيا من الوسائط الكاملة (FM) (IGF-1 و EGF و bFGF و HS و ampicillin في DMEM / F12)²
8. باستخدام طرف ماصة غير حاد سعة 300 ميكرولتر مع ماصة p200 مثبتة على 125 ميكرولتر، قم بترتيتر الخلايا برفق 80 مرة، مع الحرص على عدم تكوين فقاعات.
9. بعد تجربة كل قطرة ، أضف 200 ميكرولتر إضافي من FM إلى كل بئر.
10. مرر الخلايا عبر مصفاة خلية فالكون زرقاء 40 ميكرومتر إلى بئر جديد.
11. نقل الخلايا إلى أنابيب Falcon FACS القياسية (يبقى حوالي 300 ميكرولتر بعد التخلي والترشيح).
    1. قم بتقسيم الخلايا من القوقعة البرية إلى ثلاثة أنابيب ، مع تخفيف 100 ميكرولتر مع 300 ميكرولتر FM في كل أنبوب. سيتم استخدام أنبوب واحد كعنصر تحكم فارغ ، وسيتم تلطيخ أنبوب واحد بيوديد البروبيديوم (PI ، 1 ميكروغرام / مل) فقط (لا يتم إضافته في هذه الخطوة) ، بينما سيتم تلطيخ الأخير ب 3-carboxyumbelliferyl β-D-galactopyranoside (CUG ، انظر 2.15) للكشف عن مضان الخلفية.
    2. ضع 400 ميكرولتر من الخلايا المنفصلة من قوقعة Axin2-LacZ في كل أنبوب FACS. كعنصر تحكم CUG فقط ، قم بتخفيف 10 ميكرولتر من الخلايا في 390 ميكرولتر FM (انظر الأنبوب F في الخطوة 2.15). ارفع حجم أي أنابيب متبقية إلى 400 ميكرولتر.
12. احتضان الخلايا في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
13. تحضير حل CUG:
    1. قم بإعداد 200 ميكرولتر من CUG لكل أنبوب FACS يتطلب تلطيخا.
    قم
    2. بتخفيف CUG في FM 1:50 في غطاء المحرك الداكن مع الحد الأدنى من التعرض للضوء.
    3. CUG المخفف مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
14. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من CUG المخفف إلى كل أنبوب FACS مناسب. بالنسبة للأنابيب غير المخصصة لتحتوي على CUG ، أضف FM فقط (انظر 2.15).
15. في هذا المنعطف ، يجب أن يكون هناك خمس فئات من الأنابيب مع المحتويات التالية (لا تقم بإضافة PI في هذه الخطوة):
    1. Wildtype - بدون CUG أو PI (للتعويض، انظر الخطوة 3.5-6)
    2. Wildtype - مع PI فقط (للتعويض)
    3. Wildtype - مع CUG و PI (للتحكم ضد خلايا Axin2-LacZ)
    4. Axin2-LacZ - مع CUG فقط (للتعويض)
    5. Axin2-LacZ - مع CUG و PI (لفرز الخلايا الفعلي)
    6. Axin2-LacZ - مع CUG و PI (لتحليل الأحداث)
16. قم بحماية جميع الأنابيب من الضوء واحتضانها في حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.
17. تحضير محلول HEPES + مصل الأبقار الجنيني (FBS) الطازج لوقف رد الفعل بعد الحضانة:
    1. قم بتخفيف 400 ميكرولتر من FBS المذاب حديثا في 10 مل من HEPES المعقم 10 ملي مولار (في PBS) في أنبوب فالكون سعة 15 مل.
    2. ضع الأنبوب على الثلج حتى اكتمال 2.16.
18. أضف 1.8 مل من محلول HEPES المثلج إلى كل أنبوب FACS تحت غطاء معقم مع إطفاء الأضواء لتقليل التعرض للضوء.
19. خلايا الطرد المركزي عند 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
20. قم بإزالة المواد الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر FM ، وقم بتجميع جميع الحصص لعينة الفرز (Axin2-LacZ ملطخ ب CUG و PI).
21. أضف PI إلى كل أنبوب لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 1 ميكروغرام / مل.
22. ضع الخلايا على الجليد واحمي من الضوء.

فئة

3. قياس التدفق الخلوي

1. نحن نستخدم BD Aria II المجهز بليزر 488 نانومتر و 633 نانومتر و 407 نانومتر. تم الكشف عن CUG باستخدام الليزر البنفسجي 407 نانومتر و PI باستخدام الليزر الأزرق 488 نانومتر في منشأة FACS المشتركة بجامعة ستانفورد.
2. مطلوب مشغل مقياس التدفق الخلوي المدرب. انتقل إلى الخطوة التالية بعد تسخين الليزر ، ومعايرة كاشفات مقياس الخلايا باستخدام تعليمات الشركة المصنعة ، وتعيين معلمات الفرز المثلى. في تجربتنا ، وجدنا أن استخدام فوهة 100 ميكرومتر يحسن صلاحية الخلية للتجارب اللاحقة.
3. تم استخدام المعلمات التالية: عتبة عند 5,000 حدث ، ومعدل التدفق أقل من 3,000 حدث / ثانية ، والتشتت الأمامي (FSC) عند 125 فولت والمبعثر الجانبي (SSC) عند 250 فولت ، وقناة PE-Cy5 تم استخدامها ل PI و Cascade Blue ل CUG.
4. اغسل غرفة مقياس الخلوي بنسبة 70٪ من الإيثانول و PBS مرتين لكل منهما بهذا الترتيب.
5. ابدأ التحليل باستخدام خلايا النمط البري غير الملوثة (الأنبوب A في الخطوة 2.15). اجمع 1,000 حدث لتحديد توزيع الخلايا على مخطط FSC مقابل SSC. إذا لم يكن التشتت مرغوبا فيه ، فقم بضبط معلمات FSC و SSC.
6. قم بإجراء التعويض باستخدام WT غير الملوثة (الأنبوب A) ، WT الملون ب PI (الأنبوب B) ، وخلايا Axin2-LacZ (الأنبوب D) الملطخة ب CUG. سيسمح التعويض بتمييز إشارة أكثر دقة بين الأطوال الموجية المختلفة لليزر.
7. ابدأ التحليل باستخدام الخلايا الملطخة بالنوع البري PI و CUG (الأنبوب C) وقم بتعيين معلمات البوابات من أجل:
   1. استبعاد الحطام على أساس مخطط FSC مقابل مخطط SSC.
   2. استبعاد الزوجي والكتل باستخدام ارتفاع FSC مقابل مخطط منطقة FSC.
   3. استبعاد الخلايا الميتة على أساس منطقة FSC مقابل مخطط منطقة PE-Cy5.
   4. قم بإعداد قطعة أرض لمنطقة FSC مقابل منطقة تتالي الزرقاء مع أي موضع للبوابة.
8. بعد ذلك ، قم بتحليل 10,000 حدث من أنبوب عينة الفرز الذي يحتوي على خلايا ملطخة ب Axin2-LacZ PI و CUG (الأنبوب F).
   1. يجب تطبيق جميع البوابات التي تم تعيينها باستخدام خلايا النمط الوحشي هنا.
   2. باستخدام مخططات لخلايا النمط البري ، قم بإنشاء بوابات لخلايا تتالي زرقاء عالية أقل من 1٪ من إجمالي عدد الأحداث.
   3. تشمل هذه البوابات نفسها من Cascade Blue-high الآن ما يقرب من 15-20٪ من الخلايا في عينة Axin2-LacZ ، مما يجعل هذه الخلايا عالية Axin2.
   4. باستخدام مخطط تحليل خلايا Axin2-LacZ ، قم بإنشاء بوابة لأقل الخلايا الفلورية بنسبة 15-20٪ ، ومن الآن فصاعدا الخلايا المنخفضة Axin2.
9. بناء على استراتيجية البوابات المذكورة أعلاه ، قم بفرز الخلايا إلى أنابيب FACS تحتوي على 500 ميكرولتر FM ، وأنبوب واحد ل Axin2-high والآخر لخلايا Axin2-low. تأكد من وجود أنابيب التجميع في غرفة مبردة إلى 4 درجات مئوية أثناء الفرز.
10. سجل عدد الخلايا التي تم احتسابها بواسطة مقياس التدفق الخلوي لكل مجموعة سكانية.

< p class = "jove_title" >4. النتائج التمثيلية (انظر الشكل 2):

باستخدام البروتوكول أعلاه ، نستعيد عادة 40-45٪ من الخلايا الخالية من الحطام من كل من النوع البري و Axin2^{LacZ / +} قوقعة (الشكلان 2 أ و ب) ، مع حوالي 70٪ منها خالية من الزوجي (انظر الشكلين 2 أ و ب). معظم الخلايا التي تم فرزها قابلة للحياة ولم تتناول PI (~ 95٪) (الشكلان 2 أ و ب '). في المتوسط ، تعتبر الخلايا الإيجابية ل CUG ~ 20٪ من الخلايا الإيجابية Axin2-LacZ (الشكل 2 ب '') وترتبط بحوالي 15,000 خلية عالية من Axin2-LacZ لكل 10-12.

< p class = "jove_content" > كشف تحليل إعادة فرز قياس التدفق الخلوي للخلايا العالية Axin2 عن نقاء أكبر من 93٪ في قناة Cascade Blue. من أجل تأكيد هوية هذه الخلايا بشكل أكبر ، أجرينا تلطيخا مناعيا بعد الفرز لكل من خلايا Axin2-high و Axin2-low باستخدام الأجسام المضادة المضادة β-galactosidase ، ووجدنا أن الخلايا العالية Axin2 تحتوي على ~ 93.4٪ β- خلايا إيجابية الجالاكتوزيداز (أكثر من 1,500 خلية تم تحليلها) وأن خلايا Axin2-low تحتوي على ~ 4.8٪ β-galactosidase خلايا إيجابية.

الأشكال والجداول:

الشكل 1.النموذج التجريبي. يصور الشكل أعلاه الإستراتيجية والتقنيات التجريبية الشاملة كما هو موضح من خلال قسم البروتوكول. يتم حصاد القوقعة من الفئران البرية و Axin2^{LacZ / +} وفصلها إلى خلايا مفردة ، والتي تمت معالجتها بعد ذلك باستخدام CUG ، وهي ركيزة فلورية ل β-galactosidase. ثم تم فصل خلايا Axin2-LacZ العالية والمنخفضة عن طريق قياس التدفق الخلوي. انقر هنا لعرض نسخة كاملة الحجم من هذه الصورة.

< p class = "jove_content" >
الشكل 2.استراتيجيات البوابات. يوضح هذا الشكل استراتيجيات بوابات قياس التدفق الخلوي المستخدمة. أ) يتم تحليل الخلايا البرية المنفصلة التي خضعت لنفس العلاج مثل خلايا Axin2-LacZ هنا باستخدام ما مجموعه 10,000 حدث. توضح اللوحة الأولى منطقة التشتت الجانبي (SSC-A) مقابل منطقة الانتثار الأمامي (FSC-A). هنا ، مجموعة متميزة من الأحداث ذات حجم أكبر بكثير من تلك الأحداث الأقرب إلى المحور y. تم تصنيف هذه الأحداث على أنها "سلبية الحطام". تحلل البوابة التالية ، A '، خلايا "الحطام السلبي" من اللوحة A ، والتي تمثل 43.8٪ من إجمالي عدد الأحداث (انظر الجدول أدناه). في هذه اللوحة، يتم إستخدام ارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H) مقابل FSC-A لاستبعاد المضاعفات. يتم استبعاد الأحداث التي تنحرف عن الطبيعة الخطية المتوقعة للمؤامرة. ينتج عن هذا التحضير عادة ~ 70٪ أحداث داخل البوابة المحددة ، ويتم استبعاد الخلايا المتبقية. في اللوحة A '' ، يتم استخدام يوديد البروبيديوم (PI) كما تم اكتشافه بواسطة قناة PE-Cy5 ، لتسمية الخلايا الميتة (5.3٪). في اللوحة التالية (A'') ، يتم استخدام القناة الزرقاء المتتالية للكشف عن الركيزة الفلورية CUG. هنا ، تشمل بوابات LacZ العالية أقل من 1٪ من إجمالي الأحداث. ب) يتم تحليل الخلايا المنفصلة من الفئران Axin2-LacZ المعالجة ب CUG و PI هنا باستخدام ما مجموعه 10,000 حدث. يتم تطبيق بوابات متطابقة من اللوحة أ هنا. يوضح B' أن 29.5٪ من الخلايا مستبعدة كمزدوجات بينما يوضح B أن 5.4٪ غير قابلة للحياة. يتم رسم البوابات الأولية لخلايا LacZ-high و -low باستخدام اللوحة B ''' مع تعيين LacZ-high في البداية عند 19.7٪ و LacZ-low عند 20.4٪. انقر هنا لعرض نسخة كاملة الحجم من هذه الصورة.     رقم الحدث النسبه المئويه أ تحليل Wildtype 10,000   أ الحطام السلبي 4,381 43.80٪ أ '' سلبي مزدوج 3,116 71.10٪ أ ''' PI سلبي 2,951 94.70٪   LacZ-عالية 16 0.54٪   لاك زي منخفض 2,790 94.50٪ ب تحليل Axin2-LacZ 10,000   ب' الحطام السلبي 4,218 42.2٪ ب '' سلبي مزدوج 2,973 70.50٪ ب ''' PI سلبي 2,813 94.6٪   LacZ-عالية 553 19.70٪   لاك زي منخفض 573 م 20.40٪ < p class = "jove_content" > الجدول 1. التحليلات الكمية لاستراتيجيات البوابات في الشكل 2.

المناقشة

تميزت الدراسات البحثية المستقلة بقدرة تجديدية محدودة داخل قوقعة الأطفال حديثي الولادة^{2،10،12،13}. باستخدام فئران مراسل GFP وقياس التدفق الخلوي ، قام وايت وزملاؤه بعزل خلايا داعمة للقوقعة الصناعية ووجدوا أن لها خصائص الخلايا السلفية¹².

لقد ثبت أن مسار Wnt المتعارف عليه يحدد مجموعات الخلايا الجذعية / السلفية في أنظمة أعضاء متعددة بما في ذلك الدماغ والغدة الثديية والجهاز المكونة للدم والجلد وخبايا الجهاز الهضمي. وجدت الأعمال الحديثة إشارات Wnt النشطة في مجموعة خلايا سيئة الخص...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
طبق بتري ، بوليسترين ، معقم Geriner Bio-one 35 × 10 مم < >< / p >	VWR international	82050-540 < p>< / p >
BD Falcon Cell Strainers ، معقمة ، BD Biosciences ، أزرق ، 40 & mu ؛ م < / p>	VWR الدولية	21008-949 < / p>
Hanks ' محلول الملح المتوازن (HBSS). محلول بالكالسيوم والمغنيسيوم وبدون فينول أحمر ، معقم < p >< / p >	VWR الدولي	45000-456 < p>< / p>
أنابيب الطرد المركزي Cellstar ، بولي بروبيلين ، معقم ، Greiner bio-one ، 50 مل < p>< / p>	VWR international	82050-346 < / p>
الطرد المركزي Cellstar ، بولي بروبيلين ، معقم ، Greiner bio-one ، 15 مل < / p>	VWR international	82050-278 < / p>
B-27 مكمل خال من المصل (50x) ، سائل < / p>	Invitrogen	17504-044 < / p>
N-2 مكمل غذائي (100x) ، سائل < p>< / p>	Invitrogen	17502-048 < / p>
bFGF ، عامل نمو الخلايا الليفية - < / p>	Sigma-Aldrich	F0291 < / p>
منتدى إدارة الإنترنت-1, عامل النمو الشبيه بالأنسولين-1 من الفأر <ف>< / ع>	سيجما-ألدريتش	I8779 < / p>
EGF, عامل نمو البشرة البشري < / p>	سيجما ألدريتش	E9644 <ص>< / ع>
دولبيكو' s النسر المعدل s متوسط / لحم الخنزير s F-12 50/50 مزيج: 1X ، مع L-Glutamine و 15 ملي مولار HEPES < / p>	VWR الدولي	45000-350 < / p>
BD Falcon أنابيب مستديرة القاع ، يمكن التخلص منها ، بوليسترين ، 12x75 < / p>	VWR الدولية	60819-295 < / p>
Trypsin ، 0.25٪ (1X) مع EDTA 4Na ، سائل < p>< / p>	Invitrogen	25200-056 < / p>
ep Dualfilter TIPS 300uL ، 960 نصيحة < / p>	Eppendorf	22491245 < / p>
مثبط التربسين ، فول الصويا ، منقى < ص >< / ص >	ورثينجتون بيوكيميائي	LS003570< ص >< / ص >
BD Falcon 40um مصافي الخلايا < ص >< / ص >	BD Biosciences	21008-949 < ص >< / ص >
ألواح متعددة الآبار ، بوليسترين ، Greiner Bio-One ، ألواح غير معالجة ، 6 آبار < ص >< / ص >	VWR الدولية	82050-846 < ص >< / ص >
جين FACS Blue LacZ بيتا جالاكتوزيداز كيت الكشف < ص >< / ص >	ماركر جين	M0255 < ص >< / ص >