مقالة منهجية

فحص محتوى عالية في أمراض الاعصاب

DOI:

10.3791/3452

⸱

يناير 6, 2012

 ,  , 
1Department of Clinical Genetics, VU University Medical Center, 2Center for Neurogenomics and Cognitive Research, Neuroscience Campus Amsterdam

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف منهجية الجمع الآلي زراعة الخلايا على درجة عالية من المحتوى التصوير لتصور وتحديد العمليات الخلوية وهياكل متعددة ، بطريقة عالية الإنتاجية. يمكن أن تساعد في مثل هذه الأساليب الفنية الشرح مزيد من الجينوم فضلا عن تحديد شبكات الجينات المرض والمخدرات الأهداف المحتملة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يُعد التوصيف الوظيفي للجينومات، وبناء الشبكات الجزيئية، وتحديد أهداف دوائية جديدة، من التحديات الهامة التي يجب معالجتها بصورة عاجلة1-4. وقد قدمت مناهج "أوميكس" (omics) المتعددة والمتكاملة أدلة حول عوامل الخطر الجينية والآليات الممرضة التي تكمن وراء العديد من الأمراض التنكسية العصبية، إلا أن معظم هذه النتائج لا تزال تتطلب تحققاً وظيفياً5. على سبيل المثال، حددت دراسة حديثة للارتباط الجينومي الواسع لمرض باركنسون (PD) العديد من المواقع الجديدة كعوامل خطر للمرض، ولكن المتغير (أو المتغيرات) المسببة الكامنة أو الآلية الممرضة غير معروفة6, 7. وبما أن كل منطقة مرتبطة يمكن أن تحتوي على عدة جينات، فإن التقييم الوظيفي لكل جين من هذه الجينات على الأنماط الظاهرية المرتبطة بالمرض، باستخدام تقنيات بيولوجيا الخلية التقليدية، سيستغرق وقتاً طويلاً جداً.

هناك حاجة أيضاً لفهم الشبكات الجزيئية التي تربط الطفرات الجينية بالأنماط الظاهرية التي تسببها. ومن المتوقع أن تكون الأنماط الظاهرية للأمراض نتيجة لتفاعلات متعددة قد تعطلت. وسيكون إعادة بناء هذه الشبكات باستخدام الطرق الجزيئية التقليدية مستهلكاً للوقت. علاوة على ذلك، فإن تنبؤات الشبكة المستمدة من دراسات مستقلة للمكونات الفردية، وهو نهج الاختزال، ستؤدي على الأرجح إلى تقدير تعقيد الشبكة بأقل من قيمته الحقيقية8. وهذا التقدير الناقص قد يفسر، جزئياً، انخفاض معدل الموافقة على الأدوية بسبب الآثار الجانبية غير المرغوب فيها أو السامة. إن اكتساب منظور شبكي للمسارات المرتبطة بالأمراض باستخدام نهج الفحص الخلوي عالي الإنتاجية/عالي المحتوى (HT/HC)، وتحديد العقد الرئيسية ضمن هذه المسارات، قد يؤدي إلى تحديد أهداف أكثر ملاءمة للتدخل العلاجي.

يُعد الفحص عالي الإنتاجية (HTS) منهجية مثالية لمعالجة هذه المشكلات9-12، إلا أن الطرق التقليدية كانت عبارة عن مقايسات خلوية أحادية البعد لكامل البئر، والتي استخدمت قراءات مبسطة لعمليات بيولوجية معقدة. وقد كانت هذه الطرق غير قادرة على التحديد الكمي المتزامن للعديد من الأنماط الظاهرية الملاحظة في الأمراض التنكسية العصبية، مثل عجز النقل المحوري أو التغيرات في الخصائص المورفولوجية13, 14. ولم يكن من الممكن استخدام هذا النهج لاستقصاء الطبيعة الديناميكية للعمليات الخلوية أو الأحداث الممرضة التي تحدث في مجموعة فرعية من الخلايا. وللتحديد الكمي لمثل هذه السمات، يجب الانتقال إلى الأنماط الظاهرية متعددة الأبعاد والتي تسمى الفحص عالي المحتوى (HCS)4, 15-17. ويُعرف الفحص عالي المحتوى بأنه التحديد الكمي القائم على الخلايا لعدة عمليات في آن واحد، مما يوفر تمثيلاً أكثر تفصيلاً للاستجابة الخلوية للاضطرابات المختلفة مقارنة بالفحص عالي الإنتاجية.

يتمتع الفحص عالي المحتوى (HCS) بالعديد من المزايا مقارنة بالفحص عالي الإنتاجية (HTS)18, 19، ولكن إجراء فحص عالي الإنتاجية (HT) وعالي المحتوى (HC) في النماذج العصبية يمثل إشكالية بسبب التكلفة العالية، والتباين البيئي، والخطأ البشري. ومن أجل الكشف عن الاستجابات الخلوية على نطاق "الفينوميات" (phenomics) باستخدام التصوير عالي المحتوى (HC)، يجب تقليل التباين والخطأ، مع زيادة الحساسية وقابلية التكرار.

نصف هنا طريقة لإجراء مسوحات shRNA بدقة وموثوقية باستخدام الزراعة الآلية للخلايا20 والتصوير عالي المحتوى (HC) في نماذج خلوية عصبية. ونشرح كيف استخدمنا هذه المنهجية لتحديد مُعدِّلات لبروتين معين، وهو DJ1، الذي يتسبب طفرته في الإصابة بمرض باركنسون المتنحي جسديًا21.

من خلال الجمع بين تعدد استخدامات التصوير عالي المحتوى (HC) وطرق الإنتاجية العالية (HT)، يمكن قياس مجموعة كبيرة من الأنماط الظاهرية بدقة. ويمكن استخدام ذلك لاحقاً لتعزيز فهمنا للجينوم، والمسارات المشاركة في إمراضية المرض، فضلاً عن تحديد الأهداف العلاجية المحتملة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الآلي خلية ثقافة ملتصقة العملية (الشكل 1) 20

  1. إعداد خلية ثقافة النظام الآلي لإدخال لوحات ثقافة الخلية. تحميل المواد الاستهلاكية (مثل نصائح ماصة ، لوحات زراعة الخلايا ، لوحات مقايسة) في النظام باستخدام واجهة المستخدم الرسومية (GUI). الفوسفات مخزنة ضمان عدم وجود ما يكفي من وسائل الإعلام ثقافة الخلية ، المالحة (PBS) ، والتربسين في النظام الآلي.
  2. لوحات البذور يدويا omnitray مع اثنين 2 × 6 10 خلايا لكل لوحة ، من خط الخلية العصبية SH - SY5Y. الحفاظ على الخلايا في OPTI - MEM مع 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS). وضع لوحات في الخلية ثقافة الروبوت باستخدام واجهة المستخدم الرسومية. وسيتم المحتضنة الخلايا في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
  3. اختيار أي خلية بروتوكول الثقافة يجب أن يكون شرع 20. يمكن للمرء أن يختار من عملية الخلايا ثقافة ملتصقة 22 ، والتوسع في زراعة الخلايا الجنينية (ES) تغذية الخلايا الجذعية في 23 أو الماوس للزراعة سل تعليق22 ليرة سورية.
  4. حدد خلية ثقافة ملتصقة البروتوكول (الشكل 1) ، وضمان ضبط خلية ملتصقة ملفات معلمة سطر معين بحيث يتم تعيين العتبة التقاء (منطقة من لوحة omnitray يحتوي على خلايا) في 70 ٪. تعيين مجموع الوقت trypsinization إلى دقيقتين.
  5. إرشاد الروبوت لإعداد لوحات omnitray جديدة ، مع بذر عدد الخلايا من الخلايا 2 × 6 10 لكل لوحة.
  6. لوحات omnitray الإدخال في الخلية باستخدام النظام الآلي الثقافة خلية ثقافة ملتصقة بروتوكول (الشكل 1). هذا البروتوكول ينطوي على الخطوات التالية : يتم تصوير المحتضنة لوحات وحتى وصولها إلى عتبة التقاء محددة مسبقا. إذا الخلايا لا تصل إلى عتبة التقاء في غضون 5 قراءات ، تتم إزالة لوحات من النظام. عند بلوغ عتبة التقاء المعرفة ، تغسل الخلايا ، trypsinized وفرزها. يتم إضافة عدد محدد مسبقا من الخلايا لوحات omnitray جديدة وإذا كان هناك عدد كاف من الخلايا ، وهو مخدر المحدديتم نقلها من لوحات إيه مقايسة إلى سطح السفينة وعدد محدد من الخلايا في كل الاستغناء جيدا. ويمكن تصوير لوحات الفحص مباشرة باستخدام المجهر المتكاملة أو الإخراج من النظام لمزيد من المعالجة.
  7. تعليمات النظام لإعداد لوحات مقايسة 4 في لوحة omnitray ، مع ما مجموعه 5000 في الخلايا بشكل جيد.

2. shRNA إنتاج الفيروسات والطلاء في لوحات الفحص (الوقت المطلوب : 6 أيام)

  1. تنمو البكتيريا التي تحتوي على مخزونات الجلسرين ناقلات shRNA (فتح النظم البيولوجية ، TRC1) بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام 2ml المتوسطة لوريا ، Bertani تحتوي على 100 ميكروغرام / مل من ampicilin (سيغما الدريخ).
  2. استخراج البلازميدات بعد بروتوكول الشركة المصنعة (Promega معالج MagneSil Tfx).
  3. إنتاج الفيروس باستخدام الكونسورتيوم رني الإنتاجية العالية الإنتاج Lentiviral (96 لوحة جيدا) البروتوكول 24. العمل مع الفيروسة البطيئة هي آمنة نسبيا لأن جزيئات الفيروس المستخدمة لتنبيغ يتم تكرارها من نقص وانقسامتستخدم استراتيجيات التعبئة والتغليف جين لإنتاجها. ومع ذلك ، عند العمل مع الفيروسة البطيئة ، إضافية إجراءات السلامة البيولوجية اللازمة لتقليل الخطر على النفس والآخرين 25. ويجب إجراء جميع التجارب في مستوى MLII أو BSL2 مختبر السلامة. وينبغي حضنت جميع اللدائن (الماصات ، والأطباق البلاستيكية ، ووسائل الإعلام) التي كان على اتصال مع الجسيمات الفيروسة البطيئة مع التبييض لمدة 24 ساعة قبل التخلص منها.
  4. حساب تعدد عدوى (وزارة الداخلية) من الفيروسة البطيئة من خلال تحديد نسبة الخلايا GFP إيجابية باستخدام GFP pLKO.1 البلازميد (سيغما الدريخ).
  5. الفيروسة البطيئة لوحة في لوحات مقايسة ، مع وزارة الداخلية من 3.

3. Lentiviral تنبيغ وتمايز الخلايا العصبية من الخلايا SH - SY5Y (الوقت المطلوب : 6 أيام)

  1. تضاف إلى الخلايا لوحات الفحص (انظر الخطوة 1.7). تحميل لوحات تحتوي على مقايسة shRNA الفيروسة البطيئة في النظام الآلي خلية ثقافة.
  2. بعد 24 ساعة ، وسائل الإعلام علىسيتم تغيير لوحات لفحص OPTI - MEM يحتوي على 0.5 ٪ و 0.1 FBS حمض الريتينويك ميكرومتر لبدء عملية التمايز. تمايز الخلايا SH - SY5Y يسمح التصور من هياكل لالتهاب الأعصاب وتزامن انقسام الخلية.
  3. تستمر حضانة لوحات الفحص في وسائل الإعلام التفريق لمدة 5 أيام. هذا يضمن أقصى ضربة قاضية في التعبير الجيني الهدف.
  4. في يوم 5 و 50 ميكرومتر إضافة H 2 O 2 إلى نصف لوحات الفحص لمدة 24 ساعة لتحفيز إزفاء من DJ1 إلى الميتوكوندريا.
  5. في يوم 6 ، إضافة CmxROS Mitotracker (Invitrogen) إلى الخلايا ، وعند تركيز 200 نانومتر النهائي للبئر الواحد واحتضان في 37 دقيقة لمدة 30 درجة مئوية.
  6. يمكن للمرء أن يوعز النظام لوحات الصور مباشرة باستخدام تصوير HC أو يمكن تصديرها لوحات من النظام لمزيد من المعالجة.

4. immunostaining الآلي لوحات الفحص (الوقت المطلوب : 2 أيام)

جودة الصورة paramounر لإجراء HCS حساسة وموثوق بها. يمكن أن الأضرار التي لحقت أحادي الطبقة الخلوية بسبب pipetting غير دقيقة يؤدي إلى سوء جودة الصورة والنتائج irreproducible. وكان من أجل تقليل الضرر طبقة الخلية ، أجرى immunostaining باستخدام محطة الروبوتية. هذا الإجراء هو مشابهة لتلك التي وصفت من قبل 26 ولكن تم تخصيصها لزيادة الإنتاجية وتقليل استخدام المستهلكات.

  1. إصلاح الخلايا مع 100 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4 ٪ قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. غسل الخلايا مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ، 3 مرات.
  3. احتضان لوحات مقايسة مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1 ٪ تريتون (PBST) لمدة 10 دقيقة.
  4. غسل الخلايا مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ، 3 مرات.
  5. احتضان لوحات مقايسة مع 200 ميكرولتر من كتلة عازلة (FBS PBST مع 5 ٪) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  6. غسل الخلايا مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ، 3 مرات.
  7. احتضان مع الفلبين عشية وضحاها بسبب الأجسام المضادة الأولية في 4 درجات مئوية :
    1. الماعز DJ1 N20 (سانتا كروز ، 5 ميكروغرام / مل)
    2. الأرنب β - III تويولين (سيغما الدريخ ، 1 ميكروغرام / مل)
  8. في اليوم التالي ، وغسل الخلايا مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ، 3 مرات.
  9. احتضان لوحات مقايسة مع ما يلي الثانوية 1 ساعة الأضداد في درجة حرارة الغرفة :
    1. AlexaFluor 488 حمار المضادة للماعز (Invitrogen ، 2 ميكروغرام / مل)
    2. AlexaFluor 647 الماعز المضادة للأرنب (Invitrogen ، 2 ميكروغرام / مل
  10. غسل الخلايا مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ، 3 مرات.
  11. احتضان خلايا مع هويشت (Invitrogen ؛ 1 ميكروغرام / مل) لمدة 10 دقيقة.
  12. غسل الخلايا مع 200 PBS ميكرولتر لمدة 5 دقائق ، 3 مرات.
  13. لوحات يمكن تخزين عند 4 درجات مئوية حتى يمكن تصوير فيها.

5. ارتفاع تحليل المحتوى اقتناء وصورة صورة (الوقت المطلوب : 5 أيام)

  1. صورة ما مجموعه 30 في حقول جيدا باستخدام عدسة الهدف 20X. تصور DJ1 مع FITC تصفية مجموعة ، الميتوكوندريا مع تعيين مرشح TRITC ، β - III تويولين مع مجموعة Cy5 تصفية ونوى به مجموعة الأشعة فوق البنفسجية مرشح (الشكل 3).
  2. تحليل الصور باستخدام التحليل Bioapplication Compartmental (Cellomics ، ThermoFisher) لتحديد متوسط ​​كثافة الإشارة Mitotracker داخل الميتوكوندريا. (الشكل 4B ، F).
  3. لتحديد معامل التداخل بين متوسط ​​DJ1 والميتوكوندريا ، وتحليل الصور باستخدام bioapplication Colocalisation Cellomics (Cellomics ، ThermoFisher). تحديد المناطق ذات الاهتمام (ROI) على النحو التالي : ROI أ -- النواة (الشكل 4A ، E) ، وعائدات الاستثمار ب -- الميتوكوندريا (الشكل 4 باء ، F). استبعاد ROI ألف باء من عائد الاستثمار لضمان تحليل السيتوبلازم فقط. تحديد المنطقة المستهدفة والميتوكوندريا الأول وDJ1 هدفا المنطقة الثانية (الشكل 4C ، G).
  4. تحليل الصور باستخدام bioapplication التنميط متعلق بالخلايا العصبية (Cellomics ، Thermofisher) لتتبع متوسط ​​أطوال neurites من تلطيخ تويولين β - III (الشكل4D ، H).
  5. لوحات الصور باستخدام LX أوبرا الآلي مبائر القارئ (بيركن ، إلمر). صورة ما مجموعه 30 في حقول جيدا باستخدام عدسة الهدف 60x مع غمر المياه. تصور الميتوكوندريا مع ليزر 561 نانومتر ، ونوى مع الإثارة الأشعة فوق البنفسجية.
  6. تحليل الصور باستخدام سبوت الحافة ريدج (SER) الملمس ميزات الخوارزمية. مرشح SER - ريدج ينقل كثافة في تشكيل خلية الحرف مثل الأنماط. أكثر تجزئة الميتوكوندريا ، وارتفاع درجة SER - ريدج (الشكل 8).

6. تحليل البيانات والتطبيع

  1. استيراد البيانات من برمجيات تحليل الصور في حزمة CellHTS2 BioConductor للبيئة برنامج R (R الإصدار 2.11.1 ، الإصدار BioConductor 2.6).
  2. قاعدة اللوغاريتم (2) تحويل البيانات السابقة للتطبيع وسيطة مقرها في لوحة 27 ، 28. لا تنطبق تسوية التباين في اللوحة.
  3. لتحديد المعدلات من النمط الظاهري ، استخدم ANOVA اتجاهين بين احتدافعت مجموعات NT أي علاج الخلايا المصابة دون علاج ضد سموم تدافعت الخلايا المعالجة مقابل هدف علاج الخلايا الجينات الجين الخلايا مقابل هدف المعالجة (الشكلان 5-7).

7. ممثل النتائج

الطفرات داخل DJ1 تؤدي إلى ظهور باركنسونية المتنحية - 21 في وقت مبكر ، ولكن ليس من الواضح مدى فقدان DJ1 يؤدي إلى النمط الظاهري المرض. ومن المعروف أن الخلايا قصور DJ1 هم أكثر عرضة للموت الخلية الإجهاد التأكسدي الناجم عن وردا على الاكسدة ، DJ1 translocates من السيتوبلازم إلى الميتوكوندريا 29 ، 30. عن طريق بناء المقايسات HC لرصد هذه الظواهر ، يمكننا التعرف على الجينات التي تنظم أو تؤثر على الظواهر المرتبطة DJ1. يمكن لهذا النهج أن يساعد في فك المسارات التي يمكن أن تكون ضمن المشاركين DJ1 الوظائف وذلك في التسبب بالمرض.

مثال على التفاعل مع روكبي DJ1 (الشكل 5) : ضربة قاضية للDJ1 في الخلايا المعرضةإلى نتائج توكسين في خسارة أكبر من قابلية الخلية (BAR - B : صورة - B) مقارنة مع الخلايا المصابة تدافعت الفيروسة البطيئة (BAR - A : صورة - A). ضربة قاضية لاستهداف الجين له تأثير مماثل لذلك الذي لوحظ في الخلايا مع ضربة قاضية DJ1 (BAR - C : صورة - C). ضربة قاضية لكل من DJ1 والجينات المستهدفة ويؤدي إلى خسارة أكبر بكثير من بقاء الخلية من الخسارة إما الجينات وحدها (BAR - D : صورة - D). هذا يدل على وجود تفاعل بين روكبي DJ1 واستهداف ألف جينة

مثال على الجينات التي تنظم DJ1 إزفاء (الشكل 6) : عندما تتعرض الخلايا لمادة سامة ، DJ1 translocates من السيتوبلازم إلى الميتوكوندريا ، وهي كمية أعلى من معامل التداخل بين DJ1 والميتوكوندريا (BAR - A : صورة ومقابل BAR - C : صورة C). في الخلايا حيث تم إسكات الجينات المستهدفة B ، وأقل DJ1 translocates إلى الميتوكوندريا عندما تتعرض الخلايا لالسم. هذا يشير إلى أن الهدف هو المشاركة ب الجينات في نقل DJ1 إلى الميتوكوندريا. (BAR - B : صورة وباء BAR D - : صورة D)

مثال على الجين يشارك في ثمرة العصبية (الشكل 7) : ضربة قاضية جيم الجينات المستهدفة في نتائج النوع البري الخلايا SH - SY5Y في زيادة كبيرة في طول neurite (BAR - B : صورة - B) مقارنة مع الخلايا المصابة الفيروسة البطيئة معربا عن تدافعت shRNA (BAR - A : صورة A). يتم فقدان هذا التأثير في الخلايا المحتضنة مع توكسين (BAR - C و D).

مثال على الجين يشارك في التشكل الميتوكوندريا (الشكل 8) : العدوى من الخلايا البرية SH - SY5Y نوع مع shRNA استهداف الجين D النتائج إلى انخفاض في قيمة تجزئة الميتوكوندريا SER - ريدج (الشكل 8 ، C و D صورة) مقارنة الخلايا المصابة مع تدافعت الفيروسة البطيئة (الشكل 8 ، صورة وباء).

الشكل 1.
الشكل 1 مخطط الآلي خلية بروتوكول الثقافة :

ntent "> الشكل 2.
الشكل 2 نظرة عامة تخطيطي لعملية الفرز ، وتحليل الصور والأساليب الإحصائية المستخدمة خلال عملية الفرز : يتم تربيتها ط) حتى تكون خلايا متكدسة ومطلي لاحقا في لوحات تحتوي على مقايسة shRNA الفيروسة البطيئة. هي خلايا متمايزة لمدة 5 ايام وثم اضاف السم إلى لوحات لمدة 24 ساعة. لوحات الفحص يتم إخراج من النظام وimmunostained. يشار إلى كمية الوقت الذي يستغرقه كل من هذه العمليات في أقواس. ب) يتم الحصول على البيانات باستخدام جهاز تصوير HC (بقاء الخلية ، إزفاء البروتين ونمو الخلايا العصبية) ، وتصوير مبائر الآلي (مورفولوجيا الميتوكوندريا). ويتم تصدير البيانات إلى حزمة CellHTS2 داخل R ، وقاعدة (2) وسجل تحول تطبيع. ويستخدم في اتجاهين ANOVA لتحديد تفاعلات كبيرة بين المتغيرات المختلفة.

معشوقة = "jove_content"> الشكل 3.
الشكل 3. الصور المركبة من الخلايا التي اكتسبها التصوير HC. أ) الخلايا غير المعالجة ، B) خلايا تعامل مع H 2 O 2. هو المسمى DJ1 باللون الأخضر والأحمر في الميتوكوندريا ونوى في الزرقاء. لم يتم تسليط الضوء Neurite تلطيخ.

الشكل 4.
الشكل 4. الكمي لميزات عدة الخلوية التي تم الحصول عليها من HCS. م) غير المعالجة SH - SY5Y الخلايا. EH) H 2 O 2 تعالج SH - SY5Y الخلايا. A ، E تجزئة النواة) وتعريف العائد على الاستثمار ؛ B ، F) تحديد وتقدير حجم الميتوكوندريا ب ROI ، و C ، G) تحديد DJ1 ، قناة الهدف الثاني ؛ D ، G) تحديد وحساب طول neurite المتوسط. وتستبعد الخلايا على مقربة من حافة الصورة من التحليل. أقحم الصور هي صور قبل التحليل.

figure-protocol-5 الشكل 5. التعرف على الجينات في قشوة مع DJ1 (رسائل على أشرطة تتوافق مع الحروف على الصور). صور A خلال D هي SH - SY5Y الخلايا المسمى مع CMXRos Mitotracker (الحمراء) التي تم استخدامها لتقدير صحة الخلية.

الشكل 6.
الشكل 6 : تحديد الجين تنظيم DJ1 إزفاء (رسائل على أشرطة تتوافق مع الحروف على الصور). صور A خلال D هي SH - SY5Y الخلايا المسمى لDJ1 (الأخضر) ، الميتوكوندريا (الحمراء) ونوى (الأزرق) التي تم استخدامها لتقدير حجم DJ1 إزفاء إلى الميتوكوندريا.

الشكل 7.
الرقم 7. تحديد الجين يشارك في ثمرة العصبية (رسائل على أشرطة تتوافق مع الحروف على الصور). صور A خلال D هي SH - SY5Y الخلايا المسمى لβ - III تويولين (الخضراء) ونوى (الأزرق) والتي كانت تستخدم لتحديد مقدار طول neurite.

الشكل 8.
الشكل 8. تحديد الجين يشارك في تنظيم التشكل الميتوكوندريا. صورة A و C هي صور مركبة من SH - SY5Y الخلايا المصابة مع shRNA مشوشة أو استهداف الجينات shRNA D على التوالي. الميتوكوندريا هي الملونة باللون الأحمر ، بينما هي النواة الملونة باللون الأزرق. صورة B و D هي تصورات لتقدير SER - ريدج.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع تقلص تكاليف HT / HC أنظمة الفحص الخلوي ، جنبا إلى جنب مع توافر الأدوات الجينوم على نطاق وظيفة قوية لتعديل الجينات ، HT / HC شاشات أصبحت شائعة في الأوساط الأكاديمية. وقد تم بالفعل تطبيق هذا النهج بنجاح في مجالات متنوعة من الأبحاث ، مثل تحديد أهداف المخدرات في سرطان 9 ، 31-33 ، 34-36 التنمية الجنينية وحتى إمكانية لتطبيقها في فك المسارات المشاركة في الاضطرابات العصبية والنفسية 37،38. لكن تنفيذ مثل هذا النظام يتطلب استثمارا كبيرا من الوقت والجهد مع عملية التحسين وغالبا ما يأخذ ما لا يقل عن 6 أشهر. جميع الخطوات ، مثل trypsinization مرات ، وبسرعة وكثافة بذر pipetting يتعين تعديلها ، للتأكد من أن الخلايا السليمة وتنمو باستمرار. الوقاية من التلوث الجرثومي هي واحدة من أصعب التحديات التي تواجه الثقافة الآلي خلية الأسبوعية مع بروتوكولات التنظيف في جombination مع الشطف المستمر لجميع خطوط تحمل السائل مع الايثانول 70 ٪ كونها ضرورية للثقافات التلوث الحرة. وسوف يكون من الضروري أيضا تحسين الروبوتات بحيث الأدوات الإضافية ، مثل المجاهر مبائر لدقة أعلى ويمكن أن تكون متكاملة -80 درجة مئوية الثلاجات لتخزين المجمع.

وهناك أيضا القيود التي يتعين معالجتها من أجل تحسين حساسية ، وسرعة وفائدة هذه الطريقة لدراسة شبكات الجينات وتحديد الجينات المسؤولة عن المسارات الجزيئية المسببة للأمراض.

لإجراء الشاشة HT / منسق الشؤون الإنسانية وتحرص على جمع البيانات الموثوق بها ، وجوانب عدة لا بد من تحسينها. أولا ، الاعتماد على قياس أهمية قصوى ، ويعتمد على قوة وحساسية مقايسة. على سبيل المثال ، المقايسات المبينة أعلاه هي مناسبة لشاشات أصغر حجما ، ولكن من الصعب تنفيذها على نطاق واسع الجينوم ، ويرجع ذلك إلى تجهيز عدد الخطوات المطلوبة قبل الحصول على الصور.وهكذا ، فإن المرء لابد لبناء خطوط الخلايا مستقرة التعبير عن الجينات المراسل ، التي من شأنها أن تسمح للتصوير المباشر ويؤدي إلى تباين انخفضت بسبب انخفاض عدد خطوات التجهيز. في الوقت الحاضر ، تصميم مقايسة أن يصور بدقة وبشكل موثوق الكمي النمط الظاهري للاهتمام هو عقبة رئيسية في عملية الفرز HC.

وتجرى العديد من الشاشات في خلايا الثدييات باستخدام مختلف المكتبات رني ، وكلها تعاني من آثار خارج الهدف ، ومحدودية الكفاءة إسكات الجينات وغير مكتملة تغطية الجينوم. وبالتالي الحاجة إلى المكتبات التي تكون أكثر تحديدا ، قوية ولها تغطية أفضل. هناك جهود جارية لإنشاء مثل هذه ومن المؤمل هذه المساعي من شأنها تحسين استنساخ HT / HC scre ان يضرب.

وجود قيود على العديد من الشاشات الكبيرة الحجم الخلية القائمة على أنها تجري في الخلايا العصبية لأنه لا يمكن التلاعب بها وراثيا وتربيتها لأعداد كبيرة مع السهولة النسبية. ومع ذلك ، فإن أهمية "يضرب" التي حددت في السابق من النماذج الحية لزراعة الخلايا في وظائف الجسم الحي هو مشكوك فيه ، خصوصا أن الدماغ يتكون من أنواع الخلايا المتخصصة جدا التي تشكل شبكة كثيفة ومعقدة من الاتصالات المشبكية لتعمل كوحدة متكاملة إلى حد كبير. نتيجة لذلك ، فمن الشائع أن يضرب تحديدها باستخدام نهج الفرز المبينة أعلاه ، يتم التحقق من صحة في الشاشات الثانوية باستخدام تقنيات إضافية وأكثر النماذج ذات الصلة في 39 الفسيولوجية. من أجل تحسين الترجمة من الزيارات التي تم تحديدها خلال HCS ، ونماذج أكثر تمثيلا وأكثر تطورا ، مثل الخلايا الأولية والخلايا الجذعية أو أنظمة متباينة المشترك ثقافة تحتاج إلى تطوير وتكييفها لHT / HC النهج.

ntent "> مع مزيج من زراعة الخلايا الآلي والتصوير HC أحد يستطيع كسب السريع رؤى جديدة في كيفية الخلايا العصبية وظيفة وتحديد المسارات التي تعتبر هامة لتطور المرض. الجمع بين HCS / HTS البيانات مع المعلومات الناتجة عن النهج الأخرى omics" ، فإنه سيتم عندئذ من الممكن لبناء نظرة عامة على نظم بيولوجيا أمراض الدماغ ، وبالتالي تسهيل التنمية العلاجية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا ما تكشف

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر هاميلتون المبرمجين والمتخصصين لتقديم الدعم المستمر وBlaas إيفا للحصول على المساعدة التقنية. وأيد هذا العمل من قبل اثنين من المنح للاستثمار NWO (911-07-031 و40-00506-98-10011) ، وبياتريس فون Prinses Wetenschapsprijs 2009 وحرم أمستردام العصبية ؛ معتمد من قبل TI - SJ فارما : T5 - 207.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم الكاشف شركة كتالوج رقم
AI.CELLHOST HAMILTON http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/
OPTI - MEM INVITROGEN 31985-054
حمض الريتينويك SIGMA الدريخ R2625
لوحات OMNITRAY نونك 465219
96 استغلال الثقافة لوحات جرينير 655086
DJ1 N20 الأضداد سانتا كروز SC27004
BETA - III تويولين الأضداد SIGMA الدريخ T3952
MITOTRACKER CMXROS INVITROGEN M - 7512
هويشت - 33342 INVITROGEN H1399
هيدروجين البيروكسايد SIGMA الدريخ 216763 - 100ML
التربسين INVITROGEN 25050014
مخزنة فوسفات DULBECCO 'Sالمالحة INVITROGEN 14190086
PROMEGA WIZARD MAGNESIL TFX PROMEGA A2380
SHRNA الحيوانات المستنسخة OPEN النظم البيولوجية http://www.openbiosystems.com / رني / shRNALibraries / TRCLibraryDetails /
BIOAPPLICATIONS CELLOMICS THERMO - FISHER http://www.thermo.com/hcs

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461, 908-915 (2009).
  2. Ge, H., Walhout, A. J., Vidal, M. Integrating 'omic' information: a bridge between genomics and systems biology. Trends. Genet. 19, 551-560 (2003).
  3. Zhu, H., Snyder, M. 'Omic' approaches for unraveling signaling networks. Curr. Opin. Cell. Biol. 14, 173-179 (2002).
  4. Jain, S., Heutink, P. From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease. Neuron. 68, 207-217 (2010).
  5. Manolio, T. A. Finding the missing heritability of complex diseases. Nature. 461, 747-753 (2009).
  6. Nalls, M. A. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies. Lancet. 377, 641-649 (2011).
  7. Simon-Sanchez, J. Genome-wide association study confirms extant PD risk loci among the Dutch. Eur. J. Hum. Genet. 19 (6), 655-661 (2011).
  8. Van Regenmortel, M. H. Reductionism and complexity in molecular biology. Scientists now have the tools to unravel biological and overcome the limitations of reductionism. EMBO. Rep. 5, 1016-1020 (2004).
  9. Aherne, G. W., McDonald, E., Workman, P. Finding the needle in the haystack: why high-throughput screening is good for your health. Breast. Cancer. Res. 4, 148-154 (2002).
  10. An, W. F., Tolliday, N. J. Introduction: cell-based assays for high-throughput screening. Methods. Mol. Biol. 486, 1-12 (2009).
  11. Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 580-588 (2009).
  12. Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 445-451 (2000).
  13. Conrad, C., Gerlich, D. W. Automated microscopy for high-content RNAi screening. J. Cell. Biol. 188, 453-461 (2010).
  14. Thomas, N. High-content screening: a decade of evolution. J. Biomol. Screen. 15, 1-9 (2010).
  15. Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3840-3845 (2005).
  16. Dragunow, M. High-content analysis in neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 9, 779-788 (2008).
  17. Varma, H., Lo, D. C., Stockwell, B. R. High throughput screening for neurodegeneration and complex disease phenotypes. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 238-248 (2008).
  18. Durr, O. Robust hit identification by quality assurance and multivariate data analysis of a high-content, cell-based assay. J. Biomol. Screen. 12, 1042-1049 (2007).
  19. Miller, J. Quantitative relationships between huntingtin levels, polyglutamine length, inclusion body formation, and neuronal death provide novel insight into huntington's disease molecular pathogenesis. J. Neurosci. 30, 10541-10550 (2010).
  20. Jain, S., Sondervan, D., Rizzu, P., Bochdanovits, Z., Caminada, D., Heutink, P. The Complete Automation of Cell Culture. Journal of Biomolecular Screening. 16 (8), (2011).
  21. Bonifati, V. Mutations in the DJ-1 gene associated with autosomal recessive early-onset parkinsonism. Science. 299, 256-259 (2003).
  22. Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (16), e755-e755 (2008).
  23. Kent, L. Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).
  24. Moffat, J. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124, 1283-1298 (2006).
  25. Volksgezondheid, M. V. Integrale versie van de Regeling genetisch gemodificeerde organismen en het Besluit genetische gemodificeerde. Organismen. , (2004).
  26. Anderl, J. L., Redpath, S., Ball, A. J. A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (27), e1173-e1173 (2009).
  27. Wiles, A. M., Ravi, D., Bhavani, S., Bishop, A. J. An analysis of normalization methods for Drosophila RNAi genomic screens and development of a robust validation scheme. J. Biomol. Screen. 13, 777-784 (2008).
  28. Canet-Aviles, R. M. The Parkinson's disease protein DJ-1 is neuroprotective due to cysteine-sulfinic acid-driven mitochondrial localization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 9103-9108 (2004).
  29. Blackinton, J. Formation of a stabilized cysteine sulfinic acid is critical for the mitochondrial function of the parkinsonism protein DJ-1. J. Biol. Chem. 284, 6476-6485 (2009).
  30. Gupta, P. B. Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening. Cell. 138, 645-659 (2009).
  31. Luo, J. A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene. Cell. 137, 835-848 (2009).
  32. Mouchet, E. H., Simpson, P. B. High-content assays in oncology drug discovery: opportunities and challenges. IDrugs. 11, 422-427 (2008).
  33. Vogt, A. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Dev. Dyn. 238, 656-663 (2009).
  34. Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
  35. Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. (40), e1900-e1900 (2010).
  36. Ross, P. J., Ellis, J. Modeling complex neuropsychiatric disease with induced pluripotent stem cells. F1000. Biol. Rep. 2, 84-84 (2010).
  37. Ebert, A. D., Svendsen, C. N. Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges. Nat. Rev. Drug. Discov. 9, 367-372 (2010).
  38. An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Mol. Biotechnol. 45, 180-186 (2010).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

shRNA SER

مقالات ذات صلة