مقالة منهجية

توصيف بالسكان خلية كهربية من GFP - يعرب عن السليمة في الشبكية

DOI:

10.3791/3457

⸱

نوفمبر 14, 2011

 ,  ,  , 
1Department of Neurobiology, University of Oldenburg

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا المقال يصور تسجيل الخلايا العصبية الفردية من السكان الموسومة fluorescently في الشبكية الماوس سليمة. باستخدام اثنين الفوتون الإثارة الأشعة تحت الحمراء تم استهداف الخلايا المسمى transgenetically عن التصحيح ، المشبك تسجيل لدراسة ردودهم الخفيفة ، وخصائص الحقل تقبلا ، والتشكل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دراسة الخصائص الفيزيولوجية واتصالات متشابك معينة من الخلايا العصبية في أنسجة سليمة يشكل تحديا لتلك الخلايا التي تفتقر إلى السمات المورفولوجية واضح أو إظهار كثافة السكانية المنخفضة. هذا ينطبق بشكل خاص على الخلايا الشبكية عديم الاستطالات ، وهي فئة استثنائية في interneurons المتعددة الأشكال والتي تضم ما يقرب من 30 في الثدييات فرعية 1. على الرغم من كونها جزءا مهما من معالجة البصرية من خلال وضع الإخراج الشبكية 2 ، لم تكن معظم هذه الأنواع الفرعية درست حتى الآن في سياق وظيفي لمواجهة هذه الخلايا مع القطب تسجيل هو حدث نادر.

في الآونة الأخيرة ، عدد كبير من خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي تتوفر علامات التعبير عن بروتين فلوري مثل الفلورسنت الأخضر (GFP) تحت سيطرة المروجين لمستقبلات الغشاء أو الانزيمات التي هي محددة لمجموعة فرعية فقط من الخلايا العصبية في نسيج معين 3،4. هذه الخلايا ما قبل المسمى بالتالي فهي accessibl ه لتوجيه microelectrode استهداف تحت السيطرة المجهرية ، والسماح للدراسة منهجية خصائصها الفسيولوجية في الموقع. ومع ذلك ، ويرافق إثارة علامات الفلورسنت من خطر الضيائية للأنسجة الحية. في شبكية العين ، ويعوق هذا النهج بالإضافة إلى المشكلة التي تسبب الإثارة ضوء التحفيز المناسب للمبصرات مما كبد صباغ متبدل بالضوء تبيض ونقل الدوائر الشبكية في حالة الضوء مكيفة. يتم التغلب على هذه العوائق باستخدام الأشعة تحت الحمراء الإثارة التي تقدمها ليزر وضع تخوض نبضات قصيرة من نطاق الفيمتو ثانية. الإثارة ثنائي الفوتون يوفر طاقة كافية لاستثارة fluorophore ، وفي الوقت نفسه يحد من الإثارة إلى وحدة تخزين صغيرة الأنسجة التقليل من مخاطر photodamage 5. أيضا ، فإنه يترك الشبكية تستجيب لمحفزات بصرية منذ ضوء الأشعة تحت الحمراء (> 850 نانومتر) هو ضعيف فقط تمتصه photopigments 6.

ق = "jove_content"> نحن في هذه المقالة لشرح استخدام الفأرة في شبكية العين وراثيا لتحقيق الكهربية في تسجيلات الموقع من GFP ، معربا عن الخلايا التي يتم استهداف بصريا من قبل اثنين من الفوتون الإثارة. مستعدة شبكية العين والمحافظة عليها في الظلام ويمكن أن يتعرض للمؤثرات الضوئية التي يتوقع عبر المكثف من المجهر (الشكل 1). ويمكن الجمع بين التصحيح ، المشبك تسجيل الاستجابات ضوء صبغ مع ملء الكشف عن التشكل وصبغ للتحقق من مفرق بوساطة الفجوة اقتران إلى الخلايا المجاورة ، بحيث يمكن دراستها من قبل الخلية الهدف على مستويات مختلفة التجريبية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الوصف التالي يفترض أن لديه فهم المجرب الأساسية للبنية شبكية العين ، وتسجيل التصحيح ، المشبك ، والفحص المجهري لمدة الفوتون. للحصول على معلومات مفيدة حول إنشاء وتشغيل الإعداد التصحيح ، المشبك واثنين من الفوتون نظام التصوير نرى الحكام [7-12].

1. الأنسجة الحيوانية وإعداد

  1. إبقاء الماوس مظلمة مكيفة لا يقل عن 3 ساعة في غضون ذلك ، وإعداد 1-2 لتر من حل خارج الخلية التي تتكون من (مم) 125 كلوريد الصوديوم ، و 2.5 بوكل ، 1 CaCl 2 و 1.6 MgCl 2 و 25 NaHCO 3 و 10 مد الجلوكوز ويوازن إلى 7.4 درجة الحموضة بالغاز مع كربوجين (CO 2 5 ٪ في O 2) في درجة حرارة الغرفة.
    2. a
  2. الموت ببطء الماوس في غرفة محكمة الغلق بواسطة جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون 2 تليها خلع عنق الرحم. يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء ، والخطوات التالية في الظلام. استخدام خافت الإضاءة طويلة الموجة (نحن كتلة موجات قصيرة من مصدر ضوء بارد من قبل 690 نانومتر longpasفلتر) لدعم رؤية شخصية مع الحفاظ على أعين الحيوان مظلمة مكيفة (الفئران لا تملك إلا ضعف البصر في الجزء الأحمر من الطيف الضوء). لاستكمال العمل في إنارة الظلام استخدام الأشعة تحت الحمراء (> 800 نانومتر) ، وارتداء نظارات للرؤية الليلية.
  3. عيون استأصل مع زوج من مقص القزحية المنحنية ونقلها إلى طبق من حل خارج الخلية وضعت تحت مجهر تشريح.
  4. إزالة القرنية والجسم الهدبي من خلال فتح العين على طول لمبة أورا مشرشر (على الحدود بين الشبكية والجسم الهدبي) مع زوج من مقص الربيع (التي نستخدمها لأول مرة لانسيت اختراق نقطة انطلاق لعدة قطاعات). تأخذ بها العدسة والشبكية منفصلة بعناية من الظهارة الصبغية. إذا كان التوجه للشبكية أمر حاسم لدراستك ، تشير إلى أنه في مثل المرجع [12]. قطع العصب البصري بين شبكية العين والبشرة وإزالة صبغة الشبكية من فنجان العين. لاحظ اتجاه الأسطح الشبكية : داخل الشبكية كرة لولبية من المتابعة هو ganglايون الجانب الخلية ؛ الخارج هو الجانب مبصرة.
  5. إزالة الجسم الزجاجي من سطح الشبكية الداخلية عن طريق سحب بلطف تشغيله مع المعونة من مسواك خشبي. لهذا الغرض ، واستخدام وحدة تخزين صغيرة من حل خارج الخلية التي تغطي فقط في شبكية العين. ويمكن سحب العصي الزجاجي إلى مسواك وcentrifugally قبالة الشبكية. ثم ، وتطبيق شقوق قصيرة على طول محيط الشبكية لتسهيل التسوية من الأنسجة.
  6. نقل الشبكية الى غرفة تسجيل مبصرة ، الجانب السلبي ، تنتشر بها على أسفل الزجاج (نستخدم فرشاة غرامة) ، وذلك مع شل النايلون موتر إطار من الفولاذ المقاوم للصدأ. تعد الثانية في شبكية العين بنفس الطريقة وابقائه في الظلام مكيفة حل carboxygenated خارج الخلية لاستخدامها لاحقا.

2. التسجيلات

  1. تثبيت غرفة تسجيل في الظلام تحت مجهر المسح الضوئي والليزر تستقيم superfuse إعداد الشبكية باستمرار (لا تقل عن 5 مل / ميلن) مع الحل خارج الخلية carboxygenated تسخينها إلى 35 درجة مئوية. يقع المجهر (مجهزة أيضا مع كاميرا تعمل بالأشعة تحت الحمراء الحساسة CCD) على امتصاص الصدمات الجدول الهواء داخل قفص فاراداي لالتدريع الالكترونية. تغطية القفص مع ستارة غير شفافة للحفاظ على إعدادها في الظلام. نحن أيضا إيقاف شاشة الضوء من شاشات الكمبيوتر التي فيلم شفافة حمراء.
  2. توليف ليزر الأشعة تحت الحمراء ل850-870 نانومتر أو الموجات الأطول ، والتحول إلى وضع شرط تأمين ، واستخدام اثنين من الفوتون الإثارة لتصور GFP ، معربا عن الخلايا. التخفيف من انتاج الليزر باستخدام مرشحات الكثافة المحايدة التي تسيطر عليها الليزر برنامج المسح وصولا الى درجة غير كافية لمجرد اعتراف واضح من الخلية الفلورسنت
  3. عن التصحيح ، المشبك التسجيلات الجاري في وضع الزجاج المشبك micropipettes استخدام (البورسليكات نستخدم أنابيب زجاجية قطرها 1.5 مم الخارجي ، وسمك الجدار 0.225 ملم) مليئة حل الخلايا التي تتكون من (مم) 125 K - غلوكونات ، 10 بوكل ، 0.5 EGTA ، 10 HEPES ، معاير لدرجة الحموضة 7.4 مع KOH (إعطاء المقاومة ماصة من حوالي 5 MΩ). علما أن ظروف تجريبية أخرى مثل الجهد المشبك تسجيل تتطلب حلا مختلفا. إذا المطلوب حقن الصبغة ، إضافة مسبار فلوري (10 ملي نستخدم اليكسا فلور 594) أو جزيء التتبع (3 ٪ Neurobiotin). إدراج micropipette في ماسك وتأكد من أن الإلكترود المرجعي (المكلورة الأسلاك الفضية) في اتصال مع حل خارج الخلية في غرفة تسجيل.
  4. الضغط على micropipette واستهداف GFP ، معربا عن الخلية (نستخدم الغمر بالماء 40 أضعاف الهدف ؛ NA 1.25). وتقع أجسام الخلايا عديم الاستطالات في طبقة الخلايا العقدية (تحت السطح مباشرة في التوجه الحالي في شبكية العين) وكذلك في الجزء القريب من الطبقة النووية الداخلية (حوالي 55-75 ميكرومتر في أعماق الإعداد). قبل micropipette الاتصال مع الخلية المستهدفة ، ويحد من الغشاء الداخلي (غمد مصنوع من endfeet الدبقية) في شبكية العينالسطح يجب أن يكون اخترق. ومن المسلم به الاختراق الناجحة التي قام بها حل الخلايا التي يتم طردهم من طرف micropipette ويفصل الغشاء الداخلي يحد من أنسجة الشبكية الأساسية كما يمكن ملاحظتها على صورة انتقال الأشعة تحت الحمراء التي تلتقطها كاميرا الأشعة تحت الحمراء لاتفاقية مكافحة التصحر.
  5. نهج الخلية المطلوبة من خلال مقارنة موقف سوما من صورة ثنائية الفوتون مع صورة للكاميرا الأشعة تحت الحمراء لاتفاقية مكافحة التصحر التي تبين موقف micropipette التسجيل. علما بأن هذه الخطوة لا يتحقق بسهولة ، ويتطلب بعض الممارسة ، لأن الخلية GFP ، معربا عن أن تكون معترف بها في نقل صورة الأشعة تحت الحمراء من أجل توجيه micropipette تجاهها. ويتم تحقيق الاستهداف الصحيح عند الحافة micropipette الأسباب التنقير من سطح الخلية والتي يمكن مشاهدتها في صورة ثنائية الفوتون. بديل لهذا الإجراء ، واستخدام صبغة الفلورسنت (مثل اليكسا فلور 594 ، 100 ميكرون) في حل الخلايا للكشف عن موقف micropipette في صورة ثنائية الفوتون. ثنائي الفوتون الإثارة الأشعة تحت الحمراء يسمح مضان كافية من هذه الصبغة لجعل micropipette ملحوظ. لهذا الغرض ، وضبط نطاق الكشف في برنامج المسح بالليزر ليشمل أيضا مضان أحمر.
  6. الافراج عن ضغوط من micropipette والحصول على كامل الخلية التصحيح ، المشبك التكوين في وضع المشبك الجاري. وينبغي أن تعطي تسجيل صالحة للاستعمال إمكانات غشاء -50 إلى -55 بالسيارات ومشاركة ما لا يقل عن 20 دقيقة.
  7. المثيرات البصرية الحالية إنشاؤها بواسطة برنامج التحفيز (نستخدم QDS التي يولر توماس ، من جامعة توبنغن ، ألمانيا) 11 على جهاز الكمبيوتر. ضبط الموضع المكاني للتحفيز أن تركز على الخلية المسجلة : مارك موقف الخلية تظهر على الشاشة صورة انتقال الكاميرا IR - CCD ومركز حافزا الموضعية مثل على ذلك. ضبط كثافة التحفيز عن طريق إدراج مرشحات الكثافة محايدة في مسار الشعاع. لمعايرة رصد الطيف وكثافة انظر المرجع [14]. اختيار prolongeد interstimulus الفاصل الزمني (على سبيل المثال 15 ق) لتجنب التكيف. وتشمل الضوئي ضمن مسار شعاع للحفاظ على سجل توقيت التحفيز.
  8. بروتوكول بدء التحفيز وتسجيل ردود الخفيفة (نستخدم معدل أخذ العينات من 10 كيلوهرتز مع تصفية عند 5 كيلو هرتز لغير التشويك الخلايا ؛ لتسجيل ارتفاع ينصح ارتفاع معدل أخذ العينات مثل 20 كيلو هرتز). استخدام برنامج التحفيز ضوء لتشغيل برنامج تسجيل.
  9. لصبغ ملء السماح للعامل الفلورسنت منتشر في الخلية المسجلة ل30-45 دقيقة قبل أن يتراجع بعناية micropipette من الخلية. الحرص على عدم سحب خلايا الجسم. إذا تم استخدام غير الفلورسنت Neurobiotin التتبع ، فإنها بحاجة إلى التصور من قبل ملزمة لstreptavidin مترافق إلى fluorophore (نستخدم streptavidin - Cy3 ، 1:400 أكثر من ليلة عند 4 درجة مئوية بعد 20 دقيقة من التثبيت بارافورمالدهيد الشبكية ؛ لاقتران صباغة ويمكن إطالة الدراسات streptavidin الحضانة إلى 3 د). بدلا من ذلك ، يمكن أيضا أن يؤديها مع الحقنأقطاب حادة (> 100 MΩ) عندما يتم دفع الصبغة iontophoretically في الخلية مخوزق (البقول مستطيلة : ،25-1 NA ، و 100 مللي ، 100 مللي الفاصل ، مجموع الوقت 3-6 دقائق).

3. ممثل النتائج :

النتائج التالية تنشأ من الدراسة على الماوس التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تحت مروج للهيدروكسيلاز التيروزين 13،14 ، الانزيم تحفيز معدل الحد خطوة في التوليف الكاتيكولامينات (TH : GFP الماوس). استنادا إلى سطوع GFP اشارة المجموعتان خلية متميزة ومميزة (الشكل 2A). خلايا التعبير عن المستوى العالي GFP تمتلك أجسام الخلايا الموجودة في الطبقة النووية الداخلية (INL ، الشكل 2A) أو المشردين في طبقة الخلايا العقدية (GCL ، الشكل 2B) وتطبق في منتصف طبقة ضفيري الداخلية (IPL ، الشكل 2C) . وحددت على أنها خلايا من النوع 2 14-16 ويمكن أن تدرس بشكل منهجي فيما يتعلق مورفولوجيا (الشكل 3) والمنتخبالنشاط rical (الشكل 4) على الرغم من كثافة سكانها سوى مبالغ إلى 250 خلية / مم 2.

figure-protocol-1
الشكل 1. التمثيل التخطيطي من الإعداد التجريبية. ثنائي الفوتون الإثارة (أحمر مسار الضوء منقط) من fluorophore - معربا عن الخلايا في شبكية العين سليمة تمكن البصرية التي تستهدف من قبل micropipette (مسار الضوء الأخضر الانبعاثات). يتعرض للمؤثرات البصرية الشبكية عبر المكثف المتوقع من المجهر (أصفر مسار الضوء) ، وتسجل ردود ضوء الخلوية.

figure-protocol-2
الشكل 2. GFP ، معربا عن الخلايا في شبكية العين من flatmount TH : GFP الماوس. ويمكن التمييز بين اثنين من السكان من قبل سطوع الإشارات GFP : 1 نوع الخلايا (خلايا DA) الموجود في INL تظهر مضان ضعيفة (A ، انظر السهام) ونوع الخلايا المسمى مكثف 2مع الهيئات الخلية إما في INL (A ، انظر سهام) أو المشردين في GCL (B) والتراتب شجيري في S3 الطبقة من الشعيرات (C). أشرطة النطاق ، 50 ميكرومتر.

figure-protocol-3
الشكل 3. المورفولوجيا خلية من النوع 2 حقنوا Neurobiotin التتبع. كان تصور التتبع لاحقا من قبل streptavidin - Cy3 ملزمة (قرمزي). ومجهرية ، وهو يصور أيضا إشارة GFP (أخضر) ، هو الإسقاط من مداخن صورة تغطي GCL والشعيرات. مقياس بار ، و 50 ميكرومتر.

figure-protocol-4
الشكل 4. ردود ضوء خلية من النوع 2 الموجود في GCL. نمط الاستجابة إلى الأبيض إنارة كامل الحقل ضوء الكثافة المتزايدة في مجموعة ظلامية. ويرد في كثافة التحفيز photoisomerizations في قضيب في الثانية الواحدة (ره * / قضيب / ثانية). تم استخدام التحفيز لفترات طويلة من 3 ليالي لأفضل متميزةايون من مكونات الاستجابة عند بدء التحفيز (ON الاستجابة) ويقابلها (إيقاف الاستجابة).

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا الأسلوب يتيح إمكانية لدراسة الخصائص الكهربائية للخلايا العصبية المحددة في الشبكية سليمة تحت إشراف البصرية دون التأثير على حالة adaptational الشبكية. هي مناسبة خاصة وأنها لتوصيف الخلايا التي هي في الوقت الحاضر بدلا درس سيئة بسبب الكثافة السكانية المنخفضة مثل معظم السكان من الخلايا عديم الاستطالات. ثنائي الفوتون الإثارة تصاريح التصوير عالية الدقة وعالية التباين ، وحتى من أعمق أجزاء من الأنسجة 17 ، شرطا مسبقا لاستهداف دقيقة وناجحة التصحيح - لقط من خلايا خاصة في INL مع كثافة عالية من الهيئات الخلية.

شبكية العين هي معزولة الماوس قابلة للح 3-4 في ظل الظروف التجريبية. إذا تم تخزين شبكية العين الثانية في ظلام دامس تحت بالغاز كربوجين مستمرة ، فإنه يحتفظ اللون الأرجواني من صباغ متبدل بالضوء غير المبيض ، ويمكن استخدامها بعد الانتهاء من التجارب على شبكية العين الأولى. في البداية ، واستهدافالخلية المحددة مع micropipette wholemount في شبكية العين قليلا تحديا ويتطلب بعض الممارسة ، وخصوصا عندما تعمل في الظلام. يمكن بما في ذلك صبغة الفلورسنت في micropipette تبسيط الإجراءات ، وذلك لأن الخلية وmicropipette مرئية تحت ثنائية الفوتون الإثارة في نفس الوقت. ومع ذلك ، قد إضافة مكونات إلى حل بين الخلايا يعرقل تشكيل gigaseal أو التسبب في جودة التسجيل للمعاناة. مرة واحدة حققت بنجاح ، يمكن تسجيل جيدة للمشاركة حوالي 1 ساعة.

في حين أن ضوء الأشعة تحت الحمراء هي سيئة الإثارة فقط استوعبت نفسها مبصرات الشبكية ، متحمس GFP - معربا عن الخلايا ينبعث الضوء في الجزء المرئي من الطيف. ومع ذلك ، نحن متحمسون fluorophores فقط في حجم تنسيق والصغيرة التي ليس من المرجح أن تغير الشرط adaptational من شبكية العين. وهناك حاجة فقط عن أكثر ، والإثارة لاستهداف ويمكن مغلقا خلال تسجيل الاستجابات الخفيفة.

وusefulnويتجلى بالفعل وفاق سطيف لهذا النهج من الدراسات على فئات معينة من السكان من الخلايا التي عديم الاستطالات 14،18 من التسجيلات الكهربية لولاها لكان ممكنا فقط عن طريق الصدفة 12. أخيرا ، يمكن أيضا أن تكون هذه التقنية القوية التي تقدمها بما في ذلك اتباع نهج الدوائية 14 ، كا 2 + 19 أو التصوير باستخدام خلايا حقن للدراسات immunocytochemical أو المجهر الإلكتروني. بهذه الطريقة ، يمكن كشف موقف الوظيفية من نوع خلية معينة في الدوائر الشبكية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم التعامل مع الفئران والموت الرحيم وفقا لمبادئ توجيهية مؤسسية لرعاية الحيوان والقوانين المتعلقة التجارب على الحيوانات التي تصدرها الحكومة الألمانية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (WE849/16 1 / 2 الى دينار وRW). ونحن ممتنون ليولر توماس (Töbingen والمانيا) لتحفيز QDS البرامج الخفيفة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كاشف / جهز السالح شركة فهرس العدد تعليقات
نظارات للرؤية الليلية Gutzeit محدودة ، Warthausen وألمانيا Xtron F1 يتضمن مصدر الضوء 800 نانومتر
تصفية البصرية شوت ، ماينز ، ألمانيا RG9 longpass فلتر مع قطع تبلغ 690 نانومتر
مقص القزحية أدوات العلوم غرامة 14061-09 منحني مع النصل 22 مم
مقص الربيع أدوات العلوم غرامة 15000-00 مستقيم مع شفرة 3 ملم
غرفة تسجيل وLuigs نيومان محدودة ، Ratingen ، ألمانيا 200-100 500 0180 نوع A (TC) تفلون مع غرفة أسفل محمولة على الزجاج زلة تغطية (حوالي 0.15 ملم ، 500 رقم 0182 200-100)
تدفق سخان نظم متعددة ، ريوتلنجن وألمانيا PH01 ، TC01 مع صفيحة تسخين قنية التروية مع درجة الحرارة لياليودرجة الحرارة وحدة تحكم إنسور
مجهر المسح الضوئي ليزر لايكا مايكروسيستمز DM LFS متحد البؤر التي تسيطر عليها برامج لايكا
الجدول الهواء نيوبورت VH - 3036W الأراضي الفلسطينية المحتلة
الليزر الأطياف ، الفيزياء الوضع غير الساحلية تسونامي تي : ليزر الياقوت
كاميرا CCD AG PCO ، Kelheim وألمانيا PixelFly QE بما في ذلك البرمجيات السيطرة
Micropipette الزجاج الشعيرات الدموية Hilgenberg ، Malsfeld وألمانيا 1408411
Micropipette مجتذب سوتر الصك P - 97
الكسا فلور 594 Invitrogen A - 20004 صبغة الفلورسنت
Neurobiotin Axxora VC - SP - 1120 - M050 غير الفلورسنت التتبع
Streptavidin - Cy3 Dianova 016-160-084
هيئة التصنيع العسكريromanipulator وLuigs نيومان محدودة ، Ratingen ، ألمانيا 210-100 000 0010 بمحركات Mini25 حدة تتلاعب مع عرض SM - 5
التصحيح ، المشبك مكبر للصوت NPI الإلكترونية محدودة ، تام ، ألمانيا SEC - 05LX NPI
التحويل الرقمي الصكوك الوطنية BNC - 2090
الحصول على البيانات البرمجيات WinWCP جون ديمبستر ، جامعة اسكتلندا ، غلاسكو ، المملكة المتحدة http://spider.science.strath. ac.uk / sipbs / software.htm
QDS التحفيز البصري مولد توماس أويلر ، جامعة توبنغن في ألمانيا يجب أن تعمل على كمبيوتر منفصل التحكم 2 مراقبين (واجهة المستخدم ، ورصد الحوافز)
مرشحات الكثافة محايدة ITOS ، ماينز ، ألمانيا

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Masland, R. H. The fundamental plan of the retina. Nat. Neurosci. 4, 877-886 (2001).
  2. Baccus, S. A. Timing and computation in inner retinal circuitry. Annu. Rev. Physiol. 69, 271-290 (2007).
  3. Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wässle, H. Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines. Neuroscience. 160, 126-139 (2009).
  4. Siegert, S., Gross-Scherf, B., Del Punta, K., Didkovsky, N., Heintz, N., Roska, B. Genetic address book for retinal cell types. Nat. Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).
  5. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  6. Euler, T., Detwiler, P. W., Denk, B. Directionally selective calcium signals in dendrites of starburst amacrine cells. Nature. 418, 845-852 (2002).
  7. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Plenum Press. (1995).
  8. Jackson, M. B. Whole-cell voltage clamp recording. Current Protocols in Neuroscience. Gerfen, C. , Wiley. (1997).
  9. Majewska, A., Yiu, G., Yuste, R. A custom-made two-photon microscope and deconvolution system. Pfügers Arch. - Eur. J. Physiol. 441, 398-408 (2000).
  10. Yuste, R., Konnerth, A. maging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (2005).
  11. Euler, T., Hausselt, S. E., Margolis, D. J., Breuninger, T., Castell, X., Detwiler, P. B., Denk, W. Eyecup scope - optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflügers Arch. - Eur. J. Physiol. 457, 1393-1414 (2009).
  12. Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat. Protoc. 5, 1347-1352 (2010).
  13. Matsushita, N., Okada, H., Yasoshima, Y., Takahashi, N., Kiuchi, K., Kobayashi, K. Dynamics of tyrosine hydroxylase promoter activity during midbrain dopaminergic neuron development. J. Neurochem. 82, 295-304 (2002).
  14. Knop, G. C., Feigenspan, A., Weiler, R., Dedek, K. Inputs underlying the ON-OFF light responses of type 2 wide-field amacrine cells in TH-GFP mice. J. Neurosci. 31, 4780-4791 (2011).
  15. Zhang, D. Q., Stone, J. F., Zhou, T., Ohta, H., McMahon, D. G. Characterization of genetically labeled catecholamine neurons in the mouse retina. Neuroreport. 15, 1761-1765 (2004).
  16. Contini, M., Lin, B., Kobayashi, K., Okano, H., Masland, R. H., Raviola, E. Synaptic input to ON-biploar cells onto the dopaminergic neurons of the mouse retina. J. Comp. Neurol. 518, 2035-2050 (2010).
  17. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
  18. Dedek, K., Breuninger, T., de Sevilla Müller, L. P., Maxeiner, S., Schultz, K., Janssen-Bienhold, U., Willecke, K., Euler, T., Weiler, R. A novel type of interplexiform amacrine cell in the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 30, 217-228 (2009).
  19. Denk, W., Detwiler, P. B. Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GFP

مقالات ذات صلة