وصفت وسيلة سريعة لإجراء immunostaining القلب الجنينية الزرد. بالمقارنة مع نهج جبل immunostaining كله ، هذا الأسلوب يزيد بشكل كبير من انتشار الأجسام المضادة ، والذي يسمح بالحصول على صور عالية الدقة التي تكشف عن الهياكل الخلوية / التحت خلوية في القلب في غضون فترة زمنية أقل بكثير التجهيز.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
Immunostaining تشريح القلب الجنينية اسماك الزرد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الزرد الجنين تصبح شعبية في الفقاريات نموذج الجسم الحي لدراسة التنمية القلب وأمراض القلب البشري بسبب علم الأجنة وعلم الوراثة لها فائدة 1،2. حوالي 100-200 الأجنة متوفرة في كل أسبوع من زوج واحد من السمك الكبار. الأجنة الشفافة التي وضع الرحم السابقين يجعلها مثالية لتقييم عيوب القلب 3. ويمكن التلاعب بها على التعبير عن أي الجينات عبر تقنية الحمض النووي الريبي morpholino أو الحقن 4. علاوة على ذلك ، لقد ولدت قدما شاشات الوراثية بالفعل قائمة من المسوخ التي تؤثر على وجهات نظر مختلفة لتخلق القلب 5.
جبل immunostaining كله هو أسلوب هام في هذا النموذج الحيواني للكشف عن نمط التعبير عن هذا البروتين إلى الأنسجة المستهدفة خاصة 6. ومع ذلك ، فقد كانت الصور ذات الدقة العالية التي يمكن أن تكشف عن الهياكل الخلوية أو التحت خلوية الصعبة ، ويرجع ذلك أساسا إلى locat البدنيةايون القلب وتغلغل الفقيرة من الأجسام المضادة.
هنا ، نقدم طريقة لمعالجة هذه الاختناقات التي تشريح قلبية للمرة الأولى وإجراء عملية التلوين ثم على سطح شريحة المجهر. لمنع فقدان العينات الصغيرة والقلب لتسهيل التعامل مع حل ، ونحن يقتصر عينات القلب ضمن دائرة على سطح المجهر الشرائح التي رسمها قلم immEdge. بعد التلوين ، ويمكن للاشارات مباشرة عن طريق الملاحظة مضان المجهر المركب.
لدينا وسيلة جديدة تحسن كبير في اختراق للأضداد ، لأن القلب من الأسماك الجنينية يتكون فقط من طبقات الخلايا قليلة. ويمكن الحصول على صور ذات جودة عالية من قلوب سليمة ضمن الموكب الكثير من الوقت لخفض الأجنة الزرد الذين تتراوح أعمارهم بين يوم 2 إلى 6 أيام. يمكن أن يكون لدينا وسيلة لتمديد يحتمل صمة تشريح الأجهزة الأخرى سواء من الزرد أو الحيوانات الصغيرة الأخرى.
البروتوكول
1. إعداد الشرائح وغرفة ترطيب
- يمكن جعل غرفة ترطيب من مربع مثل مربع تلميح تفرغ. التفاف كل من الغرفة وتغطية برقائق الألومنيوم لحماية العينات بعيدا عن الضوء.
- داخل الغرفة ، ووضع كومة من المناشف الورقية الرطبة للحفاظ على الرطوبة داخل الغرفة ، والتي سوف يمنع عينات من القلب التجفيف. تعيين microplate صغيرة على الجزء العلوي من منشفة ورقية كما رف للشرائح.
- رسم خطوط أو دوائر إما على سطح شريحة المجهر باستخدام القلم immEdge جعل الآبار للحصول على عينات من القلب مع البعد عن 5x5 ملم. السماح للشرائح الجافة.
- وضع الشرائح في غرفة ترطيب وإضافة جديدة 50ul الفورمالديهايد 4 ٪ في كل بئر.
2. تشريح القلب الجنينية
- تخدير الجنين الأسماك في المياه التي تحتوي على البيض E3 7 tricaine 0.4 ٪ لمدة دقيقة تقريبا حتى 1 الأسماك وقف حركة الجسم ولكن لا يزال القلب الطبيعيالضرب.
- وضع شريحة المجهر مقعرة على مرحلة مجهر تشريح. نقل الأجنة إلى البئر concaved.
- ضبط تركيبة ضوء مجهر تشريح لتكشف بوضوح القلب. اعتمادا على تفضيل شخصي ، قد يكون إما حقل مظلم أو مدينة دبي للإنترنت ، مثل حالة الضوء المستقطب.
- محاقن نظيفة الأنسولين مع اثنين من الايثانول 75 ٪ ، ثم الجافة.
- ضبط مجهر تشريح لارتفاع التكبير والتركيز على القلب. الإصلاح جسديا الجنين عن طريق إدخال إبرة في طرف واحد الحدود صفار البيض الجسيدة قريبة من الرأس. ادخال آخر قريب الإبرة إلى منطقة القلب وسحب القلب بسرعة. إذا لم يتم فصلها تماما عن قلب الجنين ، قطع الأنسجة المتبقية المتصلة بين القلب وصفار البيض و.
- ضبط المجهر لخفض التكبير والتركيز على القلب المشتتة. استخدام pipetteman 10μl وتعيينها إلى حجم 1μl. تطبيق غيض من pipetteman لرسم أو لمسقلب العينة ، بحيث ستكون معزولة القلب سواء داخل أو تعلق على سطح الحافة.
- تراجع غيض ماصة في محلول الفورمالديهايد 4 ٪ على شرائح معدة وتضغط على المكبس ماصة للافراج عن القلب إلى حل. التوتر على سطح الماء يساعد أيضا على إطلاق سراح القلب من ماصة الحافة إلى الحل. وضع أقل من 3 في قلوب كل بئر.
3. Immunostaining
- إغلاق الغرفة ووضعها على شاكر مع حركة هزاز لطيف. الإصلاح العينة القلب لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تمحو الماء على الجزء الخلفي من الشرائح ووضع الشرائح على مسرح المجهر تشريح لتبادل العازلة.
- تراجع غيض من pipetteman 10μl في منطقة فارغة في كل بئر والحفاظ على تلميح إلى أقصى حد ممكن من عينات القلب. أخذ يحذر لتجنب القلب المترتبة على الحافة ، حيث يمكن أن تتحرك قلوب مع تدفق المياه عندما يوجه الى حل غيض. تغييرتوطين الطرف ، إذا لزم الأمر.
- تخلص من حل على منديل ورقي وتجنب إنتاج أي فقاعات في الطرف منذ يضيع بسهولة العينة القلب في وجود فقاعات الهواء. يمكن الحفاظ على العينات القلب الجافة جزئيا لفترة قصيرة تساعد على قلوب البقاء تعلق على الشرائح.
- إضافة 50μl PBST لتغطية عينة القلب واحتضان في غرفة ترطيب في حركة بطيئة هزاز لمدة 5 دقائق. تكرار شطف مرة أخرى. بعد هذه الخطوة ، يمكن تخزين العينات القلب في غرفة ترطيب تصل إلى 1 في الاسبوع 4 درجات مئوية.
- كتلة العينة القلب مع مصل الأغنام 10 ٪ في PBST لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان العينة القلب مع الأجسام المضادة الأولية ، مثل تخفيف 1:200 β - catenin الأضداد و1:200 تخفيف mef2 الضد محددة ، في الأغنام 10 ٪ مصل / PBST لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- يغسل القلب مع عينة مرات PBST الثلاثة (5 دقائق. لكل منهما) في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان العينة مع الثانويالأضداد ، مثل تخفيف 1:1000 اليكسا الموسومة الماوس المضادة و / أو الأجسام المضادة المقاومة للأرنب ، في PBST عن 0.5 ساعة.
- يغسل القلب مع عينات مرات PBST الثلاثة (5 دقائق. لكل منهما) في درجة حرارة الغرفة.
4. التصوير
- إزالة PBST وإضافة 10 ميكرولتر متوسطة متزايدة لكل بئر. صخرة الغرفة لعدة دقائق حتى يصبح الحل واضحا.
- إزالة معظم المتوسطة التركيب وتغطية جميع الآبار في شريحة واحدة مع ميكروسكوب الغطاء (24x50).
- صورة القلب الأسماك باستخدام مجهر زايس Axioplan 2 مجهزة ApoTome (كارل زايس).
5. ممثل النتائج
ويظهر مثال الصورة التي تكشف الغشاء ونوى جميع العضلية الزرد في الشكل. 1. واستخدمت والأضداد mef2c β catenin معا لصبغ العينات القلب تشريح الجنين من 52 HPF الزرد. بينما بقع الضد mef2c نوى الخلايا العضلية ، β - cateninالضد يكشف حدود كل خلية 80-10. عن طريق ضبط مرحلة من مراحل المجهر المركب ، يمكن تعديلها صورا لعينات من القلب الى التوجه نفسه ، والتي سوف تسمح للمراقبة انحناء الخارجي والداخلي انحناء في القلب 11. ويمكن بعد ذلك عدد cardiomyocyte مجموع cardiomyocyte حجم الخلية ، ويمكن قياس دائرية.
مثال آخر هو مبين الذي يكشف عن بنية sarcomeric من القلب الجنينية في الشكل. 2. أجرينا immunostaining باستخدام F59 ، وهو جسم الميوسين ، في قلب جنينية تشريح. ويمكن للشبكة myofibril في قلب جنينية كشفت بوضوح كامل في أقل التكبير ، بينما يمكن كشف الفرقة المخططة من خيوط سميكة على أعلى التكبير (الشكل رقم 2) 6.
الشكل 1. Immunostaining من mef2 (الحمراء) ، وβ - catenin (الخضراء) لإظهار النوى وoutlإيناس الخلايا العضلية في البطين الزرد. شريط مقياس = 10μm
الشكل 2. Immnostaining من الميوسين لاظهار خيوط سميكة في البطين الزرد إما في التكبير المنخفض (أ) أو تكبير عالية (B). شريط مقياس = 10μm
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بالمقارنة مع الأساليب الكلاسيكية كلها immunostaining جبل ، لدينا وسيلة لديه المزايا التالية. أولا ، يمكن الفلورسنت أقوى بكثير الإشارات التي تم الحصول عليها باستمرار نظرا لتغلغل المحسنة. في أسلوب جبل immunostaining كله ، وأنسجة الجلد الكثيفة المحيطة القلب إلى خفض كبير في اختراق العديد من الأجسام المضادة ، مما أدى إلى ارتفاع الخلفية في الجسم كله. هذه المشكلة الحادة وخاصة بالنسبة للأجنة مضى عليها أكثر من 3 أيام بعد الإخصاب (DPF). في المقابل ، فإن قلوب تشريح تتألف فقط من طبقات الخلايا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر Beninio Jomok لمساعدته في تربية الزرد. ويتم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة HL81753.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم الكاشف | شركة | فهرس العدد | |
| tricaine | البحوث العضوية | 3007T | |
| الفورمالديهايد | Polysciences | 04018 | |
| حقنة الانسولين | بيكتون ديكنسون | 329461 | |
| تريتون - X - 100 | سيغما | T8532 | |
| مكافحة β - catenin الأضداد | سيغما | C7207 | |
| الأضداد المضادة للMef2c | سانتا كروز في مجال التكنولوجيا الحيوية | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| مكافحة α - actinin الأضداد | سيغما | A7811 | |
| الأضداد المضادة للأمثاله | الخلية إشارات | # 3862 | |
| ثر اليكسا 568 عنزة المضادة مفتش الأرنب TD> | Invitrogen | A11011 | |
| ثر اليكسا 488 عنزة المضادة الماوس IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| تصاعد المتوسطة لمضان | النواقل | H - 1200 | |
| ImmEdge القلم | النواقل | H - 4000 | |
| بولي - L - lysin الشرائح المغلفة | الإلكترون المجهري العلوم | 63410-01 | |
| مجهر الغطاء الزجاجي | الصياد | 12-543 - D | |
| شرائح المجهر Concaved | الصياد | 7-1305-8 | |
| تشريح المجهر | ايكا MZ95 | ||
| مجمع المجهر | زايس | Axioplan2 | |
| ApoTome | زايس |
PBST :
1 × PBS
0.5 ٪ تريتون 100 - X
400 ملغ Tricaine
97.9 مل DDH 2 O
2.1 مل (1M تريس pH9)
ضبط درجة الحموضة إلى 7.0
المراجع
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E. Muscle: the regulation of myogenesis. Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 745-751 (1994).
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A. Cadherins and associated proteins. Vivo. 5, 505-513 (1991).
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
